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Artigo de método

Ensaio de biofilme para Clostridioides difficile com aplicações para descoberta de medicamentos

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⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 de julho de 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Os biofilmes do patógeno bacteriano Clostridioides difficile e seu significado na doença não são bem compreendidos. Descobertas recentes sugeriram um papel na recorrência, ressaltando sua importância. Aqui, descrevemos a adaptação de um ensaio de biofilme acoplado a uma leitura metabólica com aplicações para descoberta de fármacos contra biofilmes.

Resumo

Clostridioides difficile é um patógeno bacteriano gastrointestinal capaz de aproveitar um ambiente de microbiota disbiótica para proliferar, secretar toxinas e danificar o epitélio intestinal. Um subconjunto de pacientes com infecção por C. difficile (CDI) experimentará falha no tratamento com antibióticos (15% -30%) ou transplante de microbiota fecal (FMT) (<10%). Portanto, o desenvolvimento de intervenções terapêuticas adicionais é de importância crítica. O papel dos biofilmes de C. difficile na recorrência não é claro. No entanto, os biofilmes em outros organismos são responsáveis por doenças crônicas e recidivantes, sugerindo que esse também pode ser o caso da CDI recorrente. Nossa hipótese é que os biofilmes de C. difficile apresentam um alvo terapêutico valioso. O objetivo do protocolo aqui apresentado é adaptar um ensaio de formação de biofilme para a identificação de compostos reposicionáveis com atividade contra biofilmes de C. difficile estabelecidos. O protocolo refina um ensaio robusto e reprodutível para a formação de biofilmes, acopla-o a um ensaio metabólico e aplica-o à descoberta de medicamentos. Este protocolo descreve o ensaio de formação de biofilme, leituras de biomassa e atividade metabólica, teste de suscetibilidade a medicamentos, triagem de medicamentos de uma biblioteca de reposicionamento e resultados representativos.

Introdução

Clostridioides difficile é um patógeno bacteriano anaeróbico formador de esporos, capaz de infligir danos graves ao trato gastrointestinal (GI) humano, produzindo toxinas. C. difficile é responsável por quase meio milhão de casos anualmente, com ~ 30.000 mortes (CDC, 2015). O tratamento da infecção por C. difficile (CDI) adiciona um custo significativo ao já sobrecarregado sistema de saúde (~ US$ 4,8 bilhões)1,2,3. Os indivíduos de maior risco são aqueles com imunossupressão, exposição a antibióticos e/ou idosos, todas as populações que continuam a se expandir significativamente nos EUA e em todo o mundo 4,5,6,7.

C. difficile é altamente dependente do status da microbiota gastrointestinal do hospedeiro e, como tal, o tratamento com antibióticos é um fator predisponente chave para CDI. A identificação de isolados clínicos resistentes a antibióticos de C. difficile complica ainda mais o tratamento 8,9,10. Além disso, entre 15% e 30% dos pacientes tratados com antibióticos para CDI falharão no tratamento inicial 5,11,12,13,14,15,16. Uma vez que um paciente experimenta um episódio de recorrência, a probabilidade de episódios de recorrência aumenta para 45%-64% (escada rolante de recorrência) e é acompanhada por um risco aumentado de novas falhas no tratamento16,17. É importante ressaltar que a maioria dos casos de recidiva de CDI é causada pela cepa original que estabeleceu o primeiro episódio de infecção no hospedeiro18,19, sugerindo colonização contínua por C. difficile mesmo após o tratamento bem-sucedido. Embora os esporos tenham demonstrado persistir no trato gastrointestinal e levar à recidiva em modelos ex vivo e murinos20, os biofilmes de C. difficile e seu papel na doença e na recidiva são pouco explorados. Os biofilmes são comunidades microbianas protegidas por uma matriz extracelular autoproduzida, característica que os torna altamente recalcitrantes a insultos ambientais, como tratamento com antibióticos e respostas imunes21. Além disso, a formação de biofilme é um fator de virulência significativo 22,23,24,25 e em infecções bacterianas, como as causadas por Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, os biofilmes são fundamentais na recorrência e manifestações crônicas26,27. Recentemente, os biofilmes de C. difficile têm sido sugeridos como reservatórios para infecções recorrentes28 , 29 , 30 e, portanto, representam um alvo de alto valor para o tratamento e / ou prevenção da recorrência de CDI.

Os modelos atuais para estudar biofilmes de C. difficile incluem modelos de biofilme de colônia31,32, microfermentadores33, modelos de intestino quimiostato34,35 e sistemas de cultura líquida usando frascos ou placas de poço36,37. Todos esses modelos forneceram informações importantes sobre biofilmes de C. difficile em diferentes estágios de desenvolvimento e em ambientes distintos. No entanto, alguns desses modelos (ou seja, microfermentadores, modelos intestinais de quimiostatos, biofilmes de colônias) não são adequados para esforços de descoberta de medicamentos. Até o momento, a maioria dos estudos envolvendo esforços de descoberta de medicamentos se concentrou no estilo de vida planctônico de C. difficile 38,39,40,41. Portanto, o protocolo aqui descrito visa adaptar, padronizar e validar o modelo de biofilme de placa de 96 poços existente com o objetivo de desenvolver uma plataforma para bibliotecas de triagem para identificar moléculas reposicionáveis com a capacidade de matar biofilmes de C. difficile estabelecidos (24 h de idade). A validação do protocolo foi realizada comparando as capacidades de formação de biofilme entre uma cepa adaptada em laboratório (630 Δerm) e um isolado clínico epidêmico (cepa UK1 isolada durante um surto de 2006 no Hospital Stoke-Mandeville no Reino Unido42). A formação de biofilme foi quantificada usando o ensaio clássico de cristal violeta para medir a biomassa e um ensaio metabólico para medir a viabilidade dos biofilmes. Diferenças significativas na capacidade de formação de biofilme entre as cepas foram identificadas, sugerindo possíveis implicações clínicas. Além disso, o ensaio foi utilizado para determinar os perfis de suscetibilidade a antibióticos de biofilmes estabelecidos. Por fim, como prova de conceito, a caixa Global Health Priority da Medicines for Malaria Venture (MMV), uma organização sem fins lucrativos focada na descoberta de novas terapias contra doenças negligenciadas, como a malária, foi rastreada para identificar compostos com atividade contra biofilmes estabelecidos de C. difficile. O protocolo descrito aqui adapta e valida um ensaio clássico de biofilme para uso como uma plataforma de triagem de medicamentos direcionada a biofilmes maduros.

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Protocolo

1. Preparação de células para o ensaio de biofilme

CUIDADO: Clostridioides difficile é um patógeno humano e requer contenção BSL-2.

NOTA: Os esporos utilizados para este estudo foram adquiridos da Dra. Carol Kumamoto na Tufts University School of Medicine. Os estoques de esporos de C. difficile foram preparados conforme descrito anteriormente 43,44,45. Os esporos são então aliquotados como volumes de 10 μL em tubos de PCR para estriar as placas. Todos os meios e tampão fosfato salino (PBS) necessários para o experimento devem ser pré-reduzidos na câmara anaeróbica 24 h antes do uso. Isso é feito afrouxando a tampa do frasco contendo o meio ou PBS dentro da câmara.

  1. Pré-reduza uma placa de ágar Brain Heart Infusion suplementada com 0,1% (p / v) de taurocolato e 0,1% (p / v) de L-cisteína (BHIS) na câmara anaeróbica, de preferência durante a noite ou por pelo menos 3 h para permitir a redução total. Regular a temperatura da câmara anaeróbia para 37 °C.
  2. Aquecer o tubo de PCR contendo 10 μL de esporos durante 20 min a 70 °C. Isso pode ser feito em banho-maria ou termociclador.
  3. Traga os esporos para a câmara anaeróbica, misture pipetando suavemente 5x-6x e pipete 10 μL na placa BHIS pré-reduzida. Efectuar uma sequência de quatro quadrantes, tal como descrito anteriormente46, e incubar a placa durante a noite a 37 °C (temperatura da câmara anaeróbia).
  4. Após 24 h de crescimento, as colônias isoladas devem ser visíveis. Selecione uma única colônia e, usando uma alça descartável, transfira para um tubo contendo 10 mL de líquido BHIS. Incubar durante a noite (14-18 h).
  5. Determine a densidade celular diluindo em série a cultura noturna na câmara.
    1. Realize diluições de 10 vezes da cultura durante a noite. A diluição 103 produz uma amostra contável para cada uma das cepas utilizadas neste protocolo. No entanto, a padronização desta etapa pode ser necessária para isolados clínicos com diferenças de crescimento.
    2. Retire os tubos da câmara anaeróbica, coloque 10 μL de cada amostra em um hemocitômetro e conte usando um microscópio de campo claro, conforme descrito pelo fabricante do hemocitômetro.
    3. Siga as instruções do fabricante para determinar a concentração de células após a contagem.

2. Formação de biofilme

NOTA: Embora este protocolo seja adaptável a tamanhos de poços distintos, ele foi otimizado para a plataforma de 96 poços. Se o tamanho do poço for modificado, a concentração da célula precisará ser ajustada com base na área da superfície do poço.

  1. Depois de determinar a concentração celular da cultura noturna, ajuste a concentração celular para 1 x 107 células/mL em BHIS (suplementado com 10% (p/v) de L-cisteína e 0,1M de glicose).
    NOTA: A suplementação de glicose 0,1M demonstrou anteriormente aumentar a formação de biofilme pela cepa47 de C. difficile 630 Δerm. Para este protocolo, a concentração de 1 x 107 células/mL foi selecionada após testar concentrações iniciais distintas (Figura 1). A formação robusta de biofilme ainda pode ser alcançada sem suplementação de glicose.
  2. Dispense 100 μL de células nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços (fundo plano e cultura de tecidos tratada), deixando as colunas de controle (somente células) e em branco (somente mídia). Incubar durante 24 h na câmara anaeróbia (37 °C).
    1. Se a evaporação do meio se tornar um problema, coloque as placas de biofilme longe de qualquer unidade de aquecimento. Como alternativa, coloque os biofilmes dentro de um recipiente adicional ou cubra com membranas de placa permeáveis de 96 poços.
  3. Remova cuidadosamente a mídia de todos os poços, começando pelo branco. Isso removerá as células não aderentes e deixará para trás um biofilme. Esta etapa é crucial, pois apenas as células dentro do biofilme são de interesse.
  4. Lave suavemente os biofilmes 2x com 200 μL de PBS pré-reduzido. Para realizar esta lavagem suavemente, incline ligeiramente a placa de 96 poços, insira as pontas da pipeta contra a parede do poço, deslize as pontas perto do fundo do poço sem raspar o fundo e aspire lentamente. Se o PBS for deixado na parte inferior, repita o processo novamente. Nesta fase, as células não aderentes podem ser removidas, e é normal. Remova o PBS antes de retirar a placa da câmara anaeróbica.
  5. Neste ponto, use biofilmes para: Medições de biomassa (consulte a Etapa 3); medições da atividade metabólica (ver etapa 4); suscetibilidade a medicamentos e ensaios de triagem de medicamentos (consulte a Etapa 5).
    NOTA: Este protocolo foi validado para a cepa 630 Δerm adaptada em laboratório e a cepa epidêmica UK1. Isolados e cepas clínicas distintas podem exibir fracas capacidades de formação de biofilme. Para minimizar a interrupção do biofilme, lave com PBS 1x em vez de 2x e reduza o volume de lavagem para 100 μL.

3. Medição da biomassa do biofilme usando o ensaio Crystal violet

NOTA: A coloração com cristal violeta foi baseada em um protocolo descrito anteriormente48.

  1. Depois de lavar os biofilmes na câmara anaeróbia (ver passo 2.4), retire a placa e transfira-a para uma hotte química.
  2. Para fixar os biofilmes, adicione suavemente 150 μL de metanol a cada poço. Cubra o prato com a tampa por 10 min.
  3. Remova o metanol e deixe os poços secarem completamente com a tampa removida. Isso deve levar entre 30 minutos e 45 minutos.
  4. Adicione 100 μL de violeta de cristal a 0,3% em todos os poços e pinte por 10 min. Remova o violeta de cristal com cuidado para evitar manchas na borda e nas paredes do poço, pois isso pode afetar a leitura.
  5. Deixe o prato secar com a tampa removida. Isso deve levar entre 30 minutos a 45 minutos.
  6. Lave os poços 3x com 200 μL de água destilada e deixe a placa secar completamente. Isso deve levar de 30 a 45 minutos.
  7. Depois de seco, use um microscópio de campo claro para obter imagens dos biofilmes (Figura 2A). Embora esta etapa seja opcional, ela permite uma observação mais completa das células do biofilme.
    1. Coloque a placa de 96 poços em um microscópio de campo claro invertido com um adaptador de placa. Identifique poços representativos para cada cepa testada.
    2. Tire imagens para cada poço na ampliação desejada. As imagens apresentadas neste protocolo foram obtidas com aumento de 40x.
  8. Uma vez adquiridas as imagens desejadas, transfira a placa de volta para uma capela de exaustão química para descoloração.
  9. Para desmanchar o biofilme, adicione 150 μL de ácido acético a 33% e coloque em um shaker em velocidade média por 10 min.
  10. Remova 90 μL de cada poço e transfira para uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Leia a absorbância a 595 nm usando um leitor de placas (Figura 2B).

4. Medição da viabilidade do biofilme usando o corante metabólico PrestoBlue

  1. Realize a medição da atividade metabólica seguindo o protocolo do fabricante para o ensaio com as principais modificações. Aquecer o leitor de placas a 37 °C antes de preparar os biofilmes para o ensaio. Recomenda-se um leitor de placas capaz de medir a fluorescência.
    NOTA: Alternativamente, a atividade metabólica pode ser lida em OD600; no entanto, não descobrimos que essa abordagem seja sensível o suficiente para esses ensaios. Recomenda-se que os usuários revisem o protocolo do fabricante e padronizem, se necessário.
  2. Depois de lavar os biofilmes com PBS na câmara anaeróbica conforme descrito acima (consulte a etapa 2.4), remova a placa da câmara.
  3. Junto com a placa, remova 9 mL de BHIS pré-reduzido (suplementado com 10% (p / v) de L-cisteína e 0,1 M de glicose).
  4. Adicione rapidamente 1 mL de reagente PrestoBlue a 9 mL de BHIS e vórtice pré-reduzidos. Não reduza previamente o reagente, pois isso pode afetar a coloração do reagente (consulte a discussão).
  5. Adicione 100 μL da mistura BHIS-PrestoBlue a cada poço. Coloque a placa em um leitor de placas com as seguintes configurações: Temperatura a 37 °C, tipo de ensaio como Cinético; tempo de leitura como 30 min; frequência de leitura a cada 2 min; intensidade de fluorescência dependendo do tipo de leitor de placas disponível. As medições descritas neste protocolo foram realizadas usando comprimentos de onda de excitação/emissão de 560 nm/590 nm, respectivamente.
  6. Após a leitura, descarte as placas.
  7. Uma vez que os valores de fluorescência são adquiridos das leituras da placa, use poços em branco (somente mídia) para subtrair o ruído de todos os poços de amostra. Depois disso, divida os poços de biofilme tratados com cada composto pelo poço de controle contendo um biofilme não tratado (100%) para obter atividade metabólica.

5. Adição de fármacos aos biofilmes

NOTA: A configuração descrita abaixo pode ser modificada para ensaios de suscetibilidade a medicamentos e triagem de medicamentos de concentração fixa. Para ambos os métodos descritos abaixo, recomenda-se o ensaio PrestoBlue.

  1. Determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) de antibióticos distintos
    NOTA: Os biofilmes são manuseados durante um período de 48 horas, aumentando a possibilidade de contaminação. É de grande importância processar primeiro os poços em branco e seguir procedimentos assépticos. Os valores de CIM relatados na literatura para outras cepas de C. difficile e ensaios de resposta à dose teste foram usados para informar as concentrações iniciais de antibióticos para os ensaios de CIM apresentados neste protocolo. Essa abordagem será útil para determinar as concentrações iniciais de antibióticos ao trabalhar com isolados clínicos.
    1. Lave os biofilmes maduros (24 h de idade) com PBS na câmara anaeróbica conforme descrito acima (consulte a etapa 2.4).
    2. Adicionar 200 μL de meio BHIS pré-reduzido (suplementado com 10% (p/v) de L-cisteína e 0,1M de glicose) contendo diluições duplas do antibiótico de teste a cada poço, exceto as colunas de controle (somente células) e em branco (somente mídia) na placa.
    3. Incubar por mais 24 h. Neste estudo, vancomicina (concentração inicial de 200 μg/mL), metronidazol (concentração inicial de 16 μg/mL) e fidaxomicina (concentração inicial de 4 μg/mL) foram utilizados para validar o ensaio. Os valores de CIM são relatados na Tabela 1.
    4. Para evitar o ressecamento das placas, mantenha-se afastado da unidade de aquecimento na câmara anaeróbica ou use uma membrana permeável a gás.
      NOTA: Alternativamente, um PBS pré-reduzido ou fosso de mídia (300 μL) pode ser usado nos poços externos da placa.
    5. Após 24 h de incubação com os medicamentos, remova o meio e lave suavemente os biofilmes 1x com PBS. Processe biofilmes usando o ensaio Crystal violet ou o ensaio PrestoBlue.
  2. Triagem de bibliotecas de medicamentos
    1. Lave os biofilmes maduros (24 h de idade) com PBS na câmara anaeróbica conforme descrito acima (consulte a etapa 2.4).
    2. Adicione 200 μL de meio contendo uma concentração fixa de compostos da biblioteca de medicamentos a cada poço, exceto as colunas de controle (células em meio sem antibióticos) e em branco (meio sem antibióticos) na placa. Incubar por mais 24 h. Para evitar o ressecamento das placas, mantenha-o afastado da unidade de aquecimento na câmara anaeróbica.
    3. Após 24 h de incubação com os medicamentos, remova o meio e lave suavemente os biofilmes 1x com PBS. Processe biofilmes usando o ensaio Crystal violet ou o ensaio metabólico.

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Resultados

O objetivo do protocolo descrito acima é adaptar e validar o modelo de formação de biofilme em placa de 96 poços como uma plataforma de triagem de fármacos para a identificação de compostos reposicionáveis com atividade contra biofilmes estabelecidos de C. difficile. O impacto de densidades celulares distintas (104, 105, 106 e 107 células/mL) na formação de biofilme foi determinado, e a formação de biofilme foi quantificada pela coloraç...

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Discussão

A formação de biofilme de C. difficile e o papel que desempenha na doença não são bem compreendidos. Descobertas recentes sugerem um papel dos biofilmes na recidiva da doença 28,34. A formação de biofilme é um fator de virulência significativo 22,23,24,25 e em infecções bacterianas, como as cau...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos a divulgar.

Agradecimentos

J.A.R. projetou o estudo e o protocolo e escreveu o manuscrito. A.S. e P.Z. conduziram os experimentos e ajudaram a refinar o protocolo. Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais da Universidade do Texas em San Antonio (UTSA) para JAR, e AS foi apoiado pelo programa UTSA MARC (T34GM145507). Os autores gostariam de agradecer à Medicines for Malaria Venture (MMV, Suíça) por fornecer a biblioteca Global Health Priority Box.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ÁCIDO ACÉTICO SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
ÁGAR BACTERIOLÓGICO GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 leitor de placasFisher ScientificBTH1MG
GARRAFA EXTRATO DE LEVEDURA 500GFisher ScientificDF0127179
CÉREBRO CORAÇÃO INFUSÃO CALDOFisher Scientific
Cristal Violeta Grau USP 100GVWR97061-850Para coloração de biofilmes para ensaios de biomassa
Placa TC de 96 poços CytoOne, fundo plano, transparente, envolvida em indivíduos com tampas, 50/caixaUS ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glicose, anidroFisher Scientific50712744
Dimetil Sulfóxido para Biologia Molecular (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICINA 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CISTEÍNA 98+% 1KGFisher ScientificAAA104350Bpara C. difficile meio
METANOL 99,8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOL, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
tampão fosfato salino (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Reagente de Viabilidade de CélulasFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Usado para selar placas de medicamentos mãe e filha antes do armazenamento
TAUROCOLATO DE SÓDIO 100MG VWR100291-598
VANCOMICINAFisher ScientificBP29581
CM1135R

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