Detecção da Tensão da Membrana do Retículo Endoplasmático Associada a Mitocôndrias usando biosensores FRET Indutíveis

Jacob C. Zellmer; Marina B. Tarantino; Raja Bhattacharyya

doi:10.3791/67914

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Artigo de método

Detecção da Tensão da Membrana do Retículo Endoplasmático Associada a Mitocôndrias usando biosensores FRET Indutíveis

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DOI:

10.3791/67914

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7 de agosto de 2026

Jacob C. Zellmer¹ , Marina B. Tarantino¹ , Raja Bhattacharyya¹

¹Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método para medir valores de FRET de biossensores FRET induzíveis direcionados ao RE (marcado com CFP) ou mitocôndrias (marcado com YFP ) in vitro , para avaliar a tensão das membranas ER associadas a mitocôndrias (MAMs), que influenciam a geração de Aβ, e esse método pode ser usado para triagem inicial de agentes moduladores sintéticos ou naturais da MAM como potenciais terapêuticos para DA.

Resumo

Diversos estudos demonstraram que o número, comprimento e largura do espaço (espessura) dos contatos ER-mitocôndrias, ou membranas associadas a mitocôndrias (MAMs), influenciam seus papéis biológicos. Nosso trabalho anterior mostrou que a estabilização de MAMs apertados, caracterizada por uma largura de intervalo de aproximadamente 7 nm, leva a um aumento nos níveis de β amiloide (Aβ), enquanto a presença de MAMs soltas, com largura de intervalo de cerca de 40 nm, reduz a produção de Aβ em um modelo neural tridimensional (3D) da doença de Alzheimer (DA). Para investigar os efeitos das MAMs com diferentes larguras de folga, biosensores FRET (Transferência de Ressonância de Energia de Förster) direcionados a RE e mitocôndrias — ER-CFP (proteína fluorescente ciano) e Mito-YFP (proteína fluorescente amarela), respectivamente — foram desenvolvidos para quantificar MAMs apertados (largura de folga de <10 nm) em contraste com MAMs soltos ou não MAMs. A FRET ocorre quando o fluoróforo doador (CFP) e o fluoróforo aceitador (YFP) estão a menos de 10 nm um do outro, tornando este sistema adequado para avaliar a proximidade do MAM. Este protocolo descreve o uso do FRET racional espectral para medir a extensão da formação de MAM apertada.

Introdução

Os contatos do retículo endoplasmático associado a mitocôndrias (MERCs), que são isolados bioquimicamente como membranas de RE associadas a mitocôndrias (MAMs), estão implicados em vários distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer (DA⁾¹. A recentemente proposta "hipótese da MAM" sugere que as MAMs desempenham um papel central na geração da β amiloide (Aβ), iniciando assim a cascata patogênica da DA. Essa cascata inclui a formação de emaranhados neurofibrilares (NFTs), dishomeostase do cálcio e^{neuroinflamação 2}. As MAMs consistem em microdomínios ricos em colesterol, s....