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Artigo de método

Detecção da Tensão da Membrana do Retículo Endoplasmático Associada a Mitocôndrias usando biosensores FRET Indutíveis

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DOI:

10.3791/67914

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7 de agosto de 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método para medir valores de FRET de biossensores FRET induzíveis direcionados ao RE (marcado com CFP) ou mitocôndrias (marcado com YFP ) in vitro , para avaliar a tensão das membranas ER associadas a mitocôndrias (MAMs), que influenciam a geração de Aβ, e esse método pode ser usado para triagem inicial de agentes moduladores sintéticos ou naturais da MAM como potenciais terapêuticos para DA.

Resumo

Diversos estudos demonstraram que o número, comprimento e largura do espaço (espessura) dos contatos ER-mitocôndrias, ou membranas associadas a mitocôndrias (MAMs), influenciam seus papéis biológicos. Nosso trabalho anterior mostrou que a estabilização de MAMs apertados, caracterizada por uma largura de intervalo de aproximadamente 7 nm, leva a um aumento nos níveis de β amiloide (Aβ), enquanto a presença de MAMs soltas, com largura de intervalo de cerca de 40 nm, reduz a produção de Aβ em um modelo neural tridimensional (3D) da doença de Alzheimer (DA). Para investigar os efeitos das MAMs com diferentes larguras de folga, biosensores FRET (Transferência de Ressonância de Energia de Förster) direcionados a RE e mitocôndrias — ER-CFP (proteína fluorescente ciano) e Mito-YFP (proteína fluorescente amarela), respectivamente — foram desenvolvidos para quantificar MAMs apertados (largura de folga de <10 nm) em contraste com MAMs soltos ou não MAMs. A FRET ocorre quando o fluoróforo doador (CFP) e o fluoróforo aceitador (YFP) estão a menos de 10 nm um do outro, tornando este sistema adequado para avaliar a proximidade do MAM. Este protocolo descreve o uso do FRET racional espectral para medir a extensão da formação de MAM apertada.

Introdução

Os contatos do retículo endoplasmático associado a mitocôndrias (MERCs), que são isolados bioquimicamente como membranas de RE associadas a mitocôndrias (MAMs), estão implicados em vários distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer (DA)1. A recentemente proposta "hipótese da MAM" sugere que as MAMs desempenham um papel central na geração da β amiloide (Aβ), iniciando assim a cascata patogênica da DA. Essa cascata inclui a formação de emaranhados neurofibrilares (NFTs), dishomeostase do cálcio eneuroinflamação 2. As MAMs consistem em microdomínios ricos em colesterol, semelhantes a balsas lipídicas, no retículo endoplasmático e na membrana mitocondrial externa (OMM), ligados por proteínas específicas de ligação que contribuem tanto para sua diversidade estrutural quantofuncional 3. A estabilização dos contatos das mitocôndrias do RE influencia vários processos celulares, incluindo a sinalização de cálcio do RE ea apoptose 4,5. Estima-se que 5%-20% das mitocôndrias formam contato físico com o RE para estabelecerMAMs 6. Diversos estudos indicaram que o número, comprimento e largura do espaço (espessura) entre o RE e as mitocôndrias nos locais do MAM são determinantes importantes de seus papéis funcionais. Microscopia crioeletrônica e análises in vivo do fígado de camundongos demonstraram que o estado metabólico dos hepatócitos modula tanto a espessura (variando de 14 nm a 20 nm) quanto o comprimento (variando de 145 nm a 270 nm) dosMAMs 7.

As MAMs também estão surgindo como potenciais alvos terapêuticos para diversos distúrbios, incluindo câncer e distúrbios metabólicos. A espessura ou largura do espaço do MAM regula a sobrevivência celular. Os estabilizadores constitutivos da MAM, MAM 1X e MAM 9X, projetados para estabilizar MAMs apertados (6 nm ± largura de folga de 1 nm) e soltos (24 nm ± largura de folga de 3 nm), respectivamente, demonstraram que a estabilização de MAMs apertados aumentou dramaticamente a geração de Aβ em um novo modelo de cultura neural 3D da DA. Em contraste, a estabilização dos MAMs soltos não teve efeito8. Assim, converter a estabilização de MAMs apertados em MAMs soltos pode ser benéfico para reduzir a patologia amiloide. As complexidades estruturais e funcionais e a falta de uma análise quantitativa precisa do grau de estabilização da MAM tornam desafiador o direcionamento das MAMs para descoberta de medicamentos. Uma nova análise de imagem de células vivas e baseada em cimografia da velocidade axonal das mitocôndrias ligadas ao RE demonstrou que a velocidade axonal das mitocôndrias pode ser usada como métrica para medir quantitativamente a estabilização da MAM, pois um contato mais apertado com o RE reduziu significativamente a velocidade axonal mitocondrial em comparação com as mitocôndriaslivres 8,9. Usando um estabilizador induzível de MAMs em células Neuro 2A (N2AAPP) expressoras dehAPP 8, descobrimos que o aperto das larguras das lacunas dos MAM aumenta a geração de Aβ de forma dependenteda dose 8. Os estabilizadores MAM indutíveis são plasmídeos de expressão que codificam o CFP (proteína de fluorescência ciano) marcado com epítopo e os biossensores que miram mitocôndrias marcados com epítopo YFP (proteína de fluorescência amarela) e que são alvo de mitocôndrias, fundidos aos domínios de ligação à rapamicina induzida por rapamicina FK506 (FRB) ou à proteína de ligação 12-kDa (FKBP) à proteína FK506. Os biossensores foram designados como ER-CFP e Mito-YFP, respectivamente. O CFP é um fluoróforo doador que transfere energia para o fluoróforo aceitador YFP quando eles estão separados por >10 nm. Células (N2A APP) que expressam os biossensores indutíveis aumentaram a geração de Aβ após o tratamentocom rapamicina 8, sugerindo que o aumento das MAMs apertadas aumentou a geração de Aβ. Esses métodos serão benéficos para a triagem de moduladores de pequenas moléculas das MAMs e sua concentração efetiva necessária para alcançar a estabilização de um nível ótimo de MAMs apertados que convertam MAMs patogênicos ("aumento de Aβ") em terapêuticos ("reduzindo o Aβ") sem desestabilizar completamente os contatos do RE e das mitocôndrias, importantes para a sobrevivência celular.

Modelo experimental
Este estudo utilizou células Neuro2A(N2A) expressando constitutivamente APP751 (N2A APP). Essas células liberam níveis detectáveis de Aβ no meio condicionado (CM) em comparação com células N2A ingênuas. CélulasN2A APP foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamato suplementado com 200 μg/mL de G418, conforme descritoanteriormente, 10.

Plasmídeo de expressão
Um plasmídeo de expressão foi gerado pela fusão da sequência de direcionamento mitocondrial marcada com YFP (proteína fluorescente amarela) da proteína âncora A-quinase 1 [AKAP1(34-63)] e da sequência de direcionamento ER marcada por CFP (proteína fluorescente ciano ) da fosfatase Sac1 [Sac1(521-587)] com uma sequência auto-clisante de Tav2A codificando a sequência peptídica EGRGSLLTCGDVEENPGP, denotada como pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. O plasmídeo de expressão fundido com Tav2A também é ladeado por sequências nucleotídicas que codificam o domínio de ligação à rapamicina FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] ou o domínio de ligação à proteína FK506 (FKBP) de 12-kDa (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFFSFFFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). O plasmídeo de fusão FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, denotado aqui como MAM-Tav2A, foi gerado para obter níveis de expressão equimolar de FRB-YFP-AKAP1(34-63) e Sac1(521-587)-CFP-FKBP para a análise ratiométrica de FRET. O Sac1(521-587)-CFP-FKBP, denotado como ER-CFP, é o fluoróforo doador, enquanto Mito-YFP-FRB, denotado como Mito-YFP, é o fluoróforo aceitador que gera FRET quando separado por ~10 nm8. Assim, os biossensores baseados em FRET detectam MAMs apertados (6-10 nm, largura do vão). O FRB e o FKBP foram introduzidos para induzir o aperto das larguras das lacunas do MAM após a adição de rapamicina de forma dependente da dose, o que poderia ser quantificado medindo o aumento do sinalFRET 8.

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Transfecção

  1. Transfecte célulasN2A APP com plasmídeo de expressão MAM-Tav2A (14-18 h).
    1. Antes de começar, a placa 1 × 106 célulasN2A APP por poço de placas de 6 poços contendo lâminas de vidro e mantenha as células no meio de crescimento por 12 a 16 horas.
    2. Transfecte 1-3 μg de plasmídeo MAM-Tav2A (Arquivo Suplementar 1) usando reagente de transfecção Lipofectamina seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Após 12-16 horas de transfecção, realize tratamento medicamentoso.
      NOTA: Sempre tenha células transfectadas com um plasmídeo de expressão que codifique apenas o doador (ER-CFP) ou o aceitador (Mito-YFP) para serem usadas como fundo de frete.

2. Tratamento de drogas

  1. Trate as células deAPP N2A que expressam MAM-Tav2A com Rapamicina (Rapa) ou Rapalog (Log) (3-6 horas).
    1. Antes do tratamento, prepare soluções de estoque (10 mM) de Rapa e Log.
    2. Troque o meio por um material novo contendo 0 nM, 100 nM ou 250 nM Rapa ou Log.
    3. Após 3 horas de tratamento, adicione 3,3% de paraformaldeído (PFA) para fixar as células.
    4. Prepare as lâminas para microscopia confocal de fluorescência colocando uma gota de reagente antidesvanecimento.
    5. Monte as coberturas sobre a gota e pressione suavemente com a pinça.
      NOTA: As coberturas de vidro são frágeis e exigem cautela. Como alternativa aos lâminos de cobertura de vidro, utilize placas inferiores de vidro. A principal desvantagem do uso de placas de fundo de vidro é que o reagente antifade não pode ser utilizado, o que dificulta a obtenção de imagens devido ao branqueamento dos fluoróforos. NÃO use reagente antifade contendo DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) porque sua fluorescência azul interferirá na frequência entre CFP e YFP.

3. Microscopia confocal para Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET)

  1. Coloque as lâminas sob um microscópio invertido e ajuste o foco do microscópio até que as células fiquem visíveis.
  2. Excite o fluoróforo usando um laser de 440 nm e capture imagens usando emissão de 468-503 nm para o CFP doador (FKBP-CFP-ER) ou 525-565 nm para o aceitador YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Ajuste a intensidade do sinal usando o filtro fluorescente embutido até que o sinal de fundo tenha se dissipado (deve estar quase preto sólido).
    NOTA: Um microscópio confocal foi usado para capturar imagens fluorescentes usando o software NIS Element AR. Ampliação de 60x foi usada com resolução de 512 pixels.
  4. Salve as imagens como arquivos .nds.
  5. Realize análise espectral ratiométrica de FRET.

4. Análise de FRET Ratiométrica (6 - 12 h)

NOTA: A emissão de fluorescência do doador ER-CFP (468-503 nm) e do aceitador Mito-YFP (525-565 nm) foi detectada usando um microscópio confocal. O software ImageJ foi usado para quantificar a intensidade média de fluorescência dos pixels após a subtração de fundo. A razão entre a intensidade de emissão YFP e CFP foi calculada e usada como leitura para análise espectral de FRET.

  1. Imagem Aberta J (Fiji).
  2. Arraste o arquivo .nds para a Imagem J, ou pressione Arquivo -> Abrir e selecione a Imagem.
  3. Na tela seguinte, selecione a caixa Dividir Canais .
  4. Clique no painel C = 0 .
  5. Clique em Analisar -> Medida.
    NOTA: Anote o Valor Médio para cálculo posterior.
  6. Clique em Processo -> Matemática -> Subtrair.
  7. Insira o valor médio.
  8. Repita o passo 4 para o painel C = 1.
  9. Clique na ferramenta de seleção à mão livre .
  10. Circule uma célula de interesse, depois pressione Ctrl+T para registrá-la no ROI.
  11. Clique em Mostrar Tudo na parte inferior do ROI para mostrar o que você já selecionou.
  12. Selecione todas as células selecionadas e clique em Medo, Registre esses valores no Excel.
  13. Clique no painel C = 1 e clique em Mostrar Tudo.
  14. Selecione todas as células e clique novamente em Medir e registre esses valores em uma coluna separada no Excel.
  15. No Excel, crie uma função para colocar os valores do sinal doador sobre o receptor (C0/C1). Esta é a razão FRET.

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Resultados

A análise ratiométrica de FRET em células N2AAPP enriquecidas com FACS que expressam MAM-Tav2A demonstrou aumento dos níveis de Aβ40 dependente da dose após o tratamentocom rapamicina 8. A rapamicina atua inibindo o alvo mamífero da via de sinalização da rapamicina (mTOR), que por sua vez regula a expressão de TREM2 (Receptor Desencadeante Expresso em Células Mieloides 2) na microglia, levando à redução da eliminação de ...

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Discussão

A modulação das MAMs é uma área emergente de pesquisa com potenciais implicações para diversos distúrbios, incluindo câncer, distúrbios metabólicos e doençasneurodegenerativas 13. Muitos agentes farmacológicos, incluindo o antagonista da dinaína LDC-3/Dinastopina, o antidiabético metformina e o agente anticâncer sulforafano, interferem com as MAMs e atualmente estão em ensaios pré-clínicos e clínicos para câncer e distúrbios metabólicos. Esses agentes farmacológic...

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Agradecimentos

Agradecemos sinceramente ao Dr. Rudolph E. Tanzi, Professor do Massachusetts General Hospital (MGH), por seus comentários perspicazes sobre o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Masato Maesako, Professor Assistente do MGH, por compartilhar sua expertise em ensaios FLIM. Agradecemos ao Dr. Gyorgy Hajnoczky, Professor da Thomas Jefferson University, Filadélfia, por generosamente nos fornecer plasmídeos de expressão que codificam ER-CFP ou Mito-YFP. Este estudo foi apoiado pelo Cure Alzheimer's Fund para a RB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BSAFisher Scientific501781532
Microscópio confocal Olympus FV3000RS (Tóquio, Japão)N/A
DMEM com suplemento GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
Anticorpo policlonal GAPDHThermo Fisher ScientificPA1-988
GelatinVWR International9000-70-8
Geneticina (Sulfato G418)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
Anticorpo monoclonal GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, versão 9.5.0N/A
HeparinaSigma-Aldrich H0200000
Software ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Microscópio confocal invertido Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, versão 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
Gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
Penicilina/Estreptomicina/Anfotericina B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Tripsina-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referências

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