Aqui, descrevemos os protocolos para obtenção de culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (HRTEC) do córtex renal para desenvolver monocamadas e culturas tridimensionais em uma matriz extracelular (3D-HRTEC).
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Artigo de método
Desenvolvimento de culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas em monocamadas e condições tridimensionais
Neste artigo
Resumo
Resumo
As culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (HRTEC) são isoladas de rins removidos de pacientes pediátricos submetidos a nefrectomias indicadas pela Unidade de Nefrologia Pediátrica do Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentina. Macroscopicamente, o córtex renal normal é dissecado da medula renal e cortado em fragmentos. Os fragmentos corticais são então digeridos em solução de Hank suplementada com colagenase tipo 1 a 0,1% e filtrados através de uma malha de poros de 70 μm para separar os túbulos renais dos glomérulos. Os túbulos renais passam por uma segunda digestão com colagenase para isolar as células epiteliais. Finalmente, a digestão enzimática é interrompida e as células epiteliais são cultivadas em frascos contendo RPMI 1640 com suplementos abaixo de 5% de CO2a 37 ° C até a confluência. As células HRTEC podem ser cultivadas como monocamadas em placas de 96 poços, lamínulas de vidro em placas de 24 poços ou suportes de cultura de células revestidos com colágeno. Além disso, culturas tridimensionais de células epiteliais tubulares renais renais humanas (3D-HRTEC) são obtidas a partir de células HRTEC semeadas em uma matriz de membrana basal (BM). A agregação celular e a formação de estruturas de forma tubular são monitoradas. Usamos culturas primárias HRTEC por muitos anos para estudar a ação citotóxica causada pela toxina Shiga no rim pediátrico, o que leva a alterações fisiopatológicas resultando em síndrome hemolítico-urêmica (SHU). As culturas HRTEC e 3D-HRTEC podem ser usadas para avaliar os efeitos de diferentes toxinas, drogas sintéticas, fatores biológicos, hormônios, etc., especificamente no epitélio do túbulo proximal renal humano.
Introdução
Em nosso grupo, culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (HRTEC) desenvolvidas em monocamadas e em condições tridimensionais (3D-HRTEC) foram utilizadas para estudar no rim pediátrico a ação citotóxica da toxina Shiga tipo 2 (Stx2) causada após infecção gastrointestinal por Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC).
Stx1 e Stx2 (Stxs) são os principais fatores de virulência da STEC capazes de causar síndrome hemolítico-urêmica (SHU) pós-diarreica1. A SHU é uma complicação sistêmica que afeta cerca de 5-10% das crianças infectadas por STEC e consiste em anemia hemolítica, trombocitopenia e lesão renal aguda pediátrica (LRA), necessitando de tratamento de suporte2. Na Argentina, a STEC-SHU é uma doença endêmica com incidência anual de 6,52 casos por 100.000 crianças menores de 5 anos (a mais alta do mundo), representando uma das principais causas de lesão renal aguda3. Embora a mortalidade seja inferior a 4%3, aproximadamente 50% dos pacientes desenvolvem sequelas renais, constituindo a segunda causa mais frequente de transplante renal em nossopaís4,5.
Antes da internalização e exercendo sua ação citotóxica, o Stx2 liga-se especificamente ao receptor glicolipídico globotriaosilceramida (Gb3) expresso na superfície celular dos órgãos-alvo6. O rim é o principal órgão lesado por Stxs devido à presença de células sensíveis a Stx, que expressam grandes quantidades de receptores Gb3 biologicamente ativos em células epiteliais e endoteliais renais 7,8.
Trabalhos anteriores realizados em HRTEC cultivado como monocamadas mostraram que Stx2 inibiu a síntese proteica, diminuiu a viabilidade celular e a proliferação celular e induziu apoptose e necrose 9,10,11,12. Além disso, a exposição do 3D-HRTEC ao Stx2 inibiu a migração celular e o desenvolvimento de estruturas tubulares com características dos túbulos proximais renais12,13.
As culturas primárias de HRTEC e culturas 3D-HRTEC também foram usadas para avaliar o efeito do estradiol na proliferação celular, medindo a incorporação de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) no DNA de células na fase S do ciclo celular14.
Para isolar as células epiteliais, partimos de fragmentos renais obtidos de nefrectomias pediátricas indicadas para a correção de quadros urológicos.
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Protocolo
O Comitê de Ética do Hospital General de Niños Pedro de Elizalde aprovou o uso de tecidos renais humanos para o desenvolvimento de culturas de células primárias para fins de pesquisa. O consentimento informado por escrito dos parentes mais próximos ou responsáveis em nome das crianças foi obtido para o uso de amostras renais para pesquisa.
NOTA: As culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (TCAR) são derivadas de pacientes pediátricos submetidos a nefrectomias, indicadas para correção de condições urológicas ou ressecções tumorais, no Hospital Geral de Pediatria Pedro de Elizalde em Buenos Aires, Argentina.
1. Desenvolvimento de culturas primárias de células epiteliais tubulares renais humanas (HRTEC)
NOTA: Os fragmentos renais corticais são dissecados de rins removidos de pacientes pediátricos submetidos a nefrectomias no hospital. A cultura primária do HRTEC é realizada de acordo com o método descrito anteriormente11.
O protocolo é descrito nas seguintes etapas:
- Mantenha o fragmento renal refrigerado em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) ou solução salina balanceada de Hanks (Hanks) até que seja processado em laboratório.
- Disseque a cápsula renal com uma pinça. Separe o córtex renal da medula e corte-o em pequenos fragmentos de cerca de 1 mm.
- Para realizar a digestão, colocar os fragmentos renais em solução estéril de Hanks sem Ca2+ e Mg2+, suplementada com 0,1% de colagenase tipo I.
- Incubar os fragmentos renais durante 30 min a 37 °C com agitação.
- Para interromper a digestão, adicionar um volume de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e lavar a amostra três vezes por centrifugação a 160 × g por 10 min cada, em uma centrífuga refrigerada a 4 °C. Em cada centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento na mesma solução.
- Passar o produto da digestão através de uma malha de poros de 70 μm para filtrar os túbulos e descartar os glomérulos que permanecem retidos no filtro.
- Centrifugar os túbulos filtrados a 160 × g durante 10 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em solução estéril de Hanks, sem Ca2+ e Mg2+, suplementada com colagenase tipo I a 0,2%.
- Incubar a amostra durante 30 min a 37 °C com agitação.
- Para interromper a digestão, adicione um volume de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Lavar a amostra três vezes centrifugando a 160 × g, 10 min cada, numa centrifugadora refrigerada a 4 °C. Em cada centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento na mesma solução.
- Após a última centrifugação, ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio de cultura completo (RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS, L-glutamina [2 mmol / L], penicilina [100 U / mL], estreptomicina [100 μg / mL] e suplemento de crescimento de células endoteliais [ECGS, 1%]).
- Semear a suspensão celular num balão de25 cm 2 com tampa ventilada.
- Incubar as células a 37 °C em atmosfera úmida e 5% de CO2.
- No dia seguinte, lave a cultura de células 3 vezes, descartando o líquido do frasco, adicionando 5 mL de PBS cada e adicionando 5 mL de meio de cultura completo ao frasco. Essas lavagens eliminam glóbulos vermelhos e fragmentos tubulares que não foram totalmente digeridos e não aderiram ao frasco de cultura.
- Incubar as células epiteliais na incubadora de cultura de células a 37 °C, permitindo que cresçam em monocamada até à confluência.
- Troque o meio por um meio de cultura completo fresco a cada 3 dias e observe a cultura de células diariamente sob um microscópio invertido.
2. Desenvolvimento de culturas tridimensionais HRTEC (3D-HRTEC)
NOTA: Esta seção fornece as etapas para desenvolver culturas tridimensionais (3D-HRTEC). As culturas 3D-HRTEC são realizadas de acordo com o método descrito anteriormente12.
- Use uma matriz BM do sarcoma murino de Engelbreth-Holm-Swarm. Esta matriz BM é entregue congelada e, neste estado, permanece sólida. Descongelar a solução da matriz BM durante a noite num banho de gelo no frigorífico a 4 °C, conforme indicado pelo fabricante.
- Resfrie as pontas no freezer antes de colocar a matriz BM e deixe a placa de vários poços no gelo para evitar a solidificação da matriz durante o processo.
- Pegue uma alíquota de matriz BM líquida (150 mL / cm2) e coloque-a em cada poço da placa para cobrir o fundo do poço. Incubar a placa na incubadora de células a 37 °C durante 1 h para transformar a matriz BM num estado de gel.
- Enquanto isso, para separar as culturas primárias HRTEC confluentes, descarte o meio de cultura do frasco e adicione 1 mL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA a 0,02%.
- Espalhar o líquido por toda a superfície do balão e incubar durante 5 min a 37 °C na incubadora de cultura de células.
- Observe sob um microscópio invertido se todas as células se separaram.
- Ressuspenda as células em 10 mL de meio de cultura ou PBS, passe-as para um tubo de 15 mL e centrifugue a 160 × g por 10 min a 4 ° C.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular num meio de cultura completo que contenha os mesmos suplementos utilizados para as culturas primárias HRTEC.
- Conte o número de células em uma câmara de Neubauer.
- Semeie 4 × 104 células/150 μL por poço na matriz BM. Incubar a cultura de células durante vários dias numa incubadora de cultura de células a 37 °C, numa atmosfera húmida e com 5% de CO2.
- Troque o meio a cada 2 dias por meio novo.
- Monitore a agregação celular e a formação de estruturas de forma tubular sob um microscópio óptico invertido.
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Resultados
As culturas primárias HRTEC confluentes mostraram uma morfologia semelhante à observada à microscopia óptica (Figura 1). As células foram caracterizadas por imunofluorescência, conforme descrito em nossas publicações anteriores, usando anticorpos contra aquaporina 1 (AQP1) e PECAM CD31 9,12,13. Estudos de imunofluorescência mostraram que mais de 90% dos HRTEC foram positivos para AQP1, o que demonst...
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Discussão
As culturas primárias devem ser realizadas no mesmo dia da nefrectomia. As culturas primárias HRTEC podem ser usadas entre 1-5 passagens para garantir a estabilidade morfogenética das células. Após a quinta passagem, as células começam a mudar sua morfologia, apresentando aparência semelhante a fibroblastos ou aumento de vacúolos, podendo se tornar quiescentes.
Se um fragmento de rim maior for usado, o DNA liberado pela lise celular após a digestão pode interf...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos à equipe de Urologia Pediátrica da "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Buenos Aires, Argentina, por fornecer amostras renais. Este trabalho foi apoiado por bolsas para C. Silberstein da Universidade de Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) e para C Ibarra e C Silberstein do Conselho Nacional de Pesquisas Científicas e Técnicas (CONICET: PUE 0041). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (através da Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Colagenase tipo I | Sigma Merck, St Louis, MO, EUA | 637958 | |
| Suplemento de crescimento de células endoteliais | Sigma Merck, St Louis, MO, EUA | E2759 | |
| Matriz de membrana basal Matrigel | BD Biosciences, EUA; Sigma Merck, St Louis, MO, EUA | 356234 | |
| 70 μ Filtro de malha de poros M | BD Bioscience, MA, EUA | css010070 | |
| Meio RPMI 1640 com L-glutamina | Sigma Merck, St Louis, MO, EUA | R8758-500ml | |
| Hanks ' Solução salina balanceada Livre de Ca2+ e Mg2+ | Gibco Invitrogen, NY, EUA | 14175046 | |
| Solução de tripsina-EDTA | Sigma Merck, St Louis, MO, EUA | T4049 |
Referências
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Reimpressões e permissões
