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Artigo de método

Medindo a captação do análogo da glicose, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-desoxiglicose, na retina neural murina intacta

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DOI:

10.3791/67921

⸱

14 de março de 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

Neste artigo

Resumo

Vários tipos de células na retina, incluindo células endoteliais, neurônios e células gliais, expressam transportadores de glicose (GLUTs) para permitir a captação de glicose nas células. Usando a retina neural de camundongo ex vivo e o análogo fluorescente de glicose 6-NBDG, descrevemos um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose em toda a retina do camundongo.

Resumo

A retina é um tecido altamente metabólico com vários tipos de células que requerem glicose e seus derivados para produzir energia na forma de ATP. As células da retina, incluindo células endoteliais, neurônios, fotorreceptores e células gliais, expressam transportadores de glicose (GLUTs; por exemplo, GLUT1-4) para permitir a captação de glicose para a produção de energia. O GLUT1 é o transportador de glicose mais abundantemente expresso na retina. Este protocolo permite que os pesquisadores meçam a captação de glicose na retina murina neural em condições ex vivo usando o análogo fluorescente da glicose 6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-Desoxiglicose (6-NBDG). Após a dissecção da retina, os níveis totais de 6-NBDG da retina podem ser facilmente determinados por meio da medição do ponto final de fluorescência usando um leitor de placas. Para consistência, recomendamos normalizar os resultados para os níveis totais de proteína. Embora o 6-NBDG seja altamente específico para o GLUT1, a captação desse análogo é detectada na presença do inibidor de GLUT1 BAY-876. Como tal, este ensaio fornece um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose ex vivo em toda a retina neural de camundongos, que é parcialmente mediada por GLUT1.

Introdução

A glicose é um metabólito essencial para a retina neural, onde é usada para alimentar altas taxas de glicólise e respiração mitocondrial para produzir energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP)1. Como a glicose é o substrato energético preferido, muitas células da retina expressam transportadores de glicose (GLUTs) para facilitar a captação de glicose da vasculatura e do tecido circundante2. Os GLUTs compreendem uma família de glicoproteínas de membrana intrínsecas que são responsáveis pelo transporte de glicose para as células de mamíferos3. O transportador GLUT-1 (GLUT1) é o transportador primário de glicose na retina, expresso em todas as camadas retinianas4 e pelas células endoteliais capilares que compõem a barreira hemato-retiniana (BRB) 5. Curiosamente, em doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC), incluindo a doença de Alzheimer, uma redução nos níveis de proteína GLUT1 e captação de glicose precede a atrofia cerebral e a disfunção neuronal em humanos 6,7. Em um modelo de hipertensão ocular em ratos, níveis mais baixos de GLUT1 também foram observados nos capilares8. O transporte reduzido de glicose para a retina externa está implicado na perda de fotorreceptores em modelos animais de retinite pigmentosa humana e também pode desempenhar um papel na neurodegeneração da retina, como a observada no glaucoma. Portanto, é necessária uma compreensão do transporte de glicose na retina neural para estabelecer seu papel na neurodegeneração da retina.

Aqui, descrevemos um método bioquímico novo, barato e direto para medir a captação de 6-NBDG na retina neural murina ex vivo , ou seja, excluindo o epitélio pigmentado da retina e a coroide. Comparado com outros análogos fluorescentes, como o 2-NBDG, o 6-NBDG é composto por uma porção de glicose na qual um grupo nitrobenzoxididiazoamino fluorescente substitui o grupo hidroxila no carbono 6, impedindo a fosforilação pela hexoquinase e posterior degradação metabólica9. Embora o 6-NBDG tenha alta especificidade para o GLUT1, com uma afinidade de ligação 300 vezes maior que a glicose9, detectamos captação desse análogo na presença de inibidores do GLUT110. Como tal, este ensaio fornece um método relativamente rápido e barato para medir a captação de glicose ex vivo em toda a retina do camundongo, que é parcialmente mediada por GLUT1.

A medição da captação de glicose no tecido em tempo real é desafiadora, muitas vezes exigindo marcação de radioisótopos ou métodos de imagem de alta resolução. Aqui, empregamos um ensaio bioquímico fluorescente para determinar rapidamente a captação de 6-NBDG em várias amostras de retina em condições ex vivo . O protocolo fornece informações sobre a captação total de glicose na retina; não fornece informações sobre os níveis específicos de captação de 6-NBDG nas células da retina.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Vanderbilt University Medical Center.

1. Preparação para o ensaio

NOTA: A preparação deve ser realizada no dia do ensaio imediatamente antes da execução do ensaio. Isso é necessário devido à natureza sensível ao tempo do protocolo.

  1. Preparação geral antes do experimento
    NOTA: 6-NBDG é sensível à luz e deve ser protegido da luz. Cubra todas as soluções de 6-NBDG com papel alumínio.
    1. Uma solução estoque de 5 mM 6-NBDG em 50% de DMSO / 1x PBS é estável a -20 ° C por 6 meses. Faça uma solução de estoque e armazene alíquotas de 500 μL para ensaios futuros.
    2. Coloque um tubo cônico de 50 mL de meio Neurobasal-A (sem glicose) no gelo.
    3. Certifique-se de que o banho-maria está regulado para 37 °C.
    4. Rotule 4 × tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por retina: 1) falta de glicose, 2) incubação de 6-NBDG, 3) sonicação e 4) tubo de coleta para amostra para ensaio de Pierce (ou seja, se você tiver quatro retinas no total, precisará de 16 tubos de microcentrífuga). Consulte a Figura 1 para obter um resumo da configuração do tubo.
    5. Adicione 200 μL de meio A neurobasal do tubo cônico de 50 mL no gelo aos tubos de sonicação pré-rotulados e coloque no gelo para a etapa 2.5.4.
    6. Ligue o leitor de placas.
    7. Configure as informações da placa no software do leitor de placas usando o recurso de ensaio de ponto final de fluorescência com os seguintes parâmetros: excitação 483 nm, emissão 550 nm e corte 530 nm (parâmetros predeterminados para 6-NBDG).
  2. Preparação do reagente antes do experimento: 6-NBDG
    1. Fazer uma solução de trabalho de 6-NBDG em meio neurobasal-A a uma concentração final de 500 μM, diluindo o stock de 5 mM produzido no passo 1.1.1.
      NOTA: Lembre-se de cobrir todas as soluções 6-NBDG com papel alumínio. Faça um volume apropriado de 500 μM de solução de trabalho 6-NBDG para todo o ensaio (precisa de 200 μL de solução de trabalho 6-NBDG por retina; inclua volume extra para erro e quantidades necessárias para criar soluções padrão na etapa 2.4.).
    2. Pipetar 200 μL de solução de trabalho 6-NBDG nos tubos pré-rotulados feitos na etapa 1.1.4 para a etapa de incubação 6-NBDG.

2. Executando o ensaio de captação de 6-NBDG

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral passo a passo.

  1. Dissecção do tecido retiniano
    1. Sedar o camundongo usando anestesia inalatória com isoflurano (isoflurano a 2% em 5% de dióxido de carbono/95% de oxigênio).
      NOTA: Confirme se o mouse está adequadamente anestesiado apertando a almofada do pé em ambas as patas traseiras. Se devidamente anestesiado, não deve haver movimento brusco (reflexo de retirada do pedal). Se houver um movimento reflexo, retorne ao passo 2.1.1.
    2. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical seguida de decapitação e, em seguida, enuclear rapidamente os olhos. Coloque os olhos enucleados em uma placa de Petri cheia de 5-10 mL de meio neurobasal-A gelado (sem glicose) no gelo.
      NOTA: Abaixo estão as diretrizes básicas para dissecção neural da retina (excluindo epitélio pigmentar da retina e coróide); Para obter instruções e orientações mais detalhadas, consulte um protocolopublicado anteriormente 11 e siga a seção "Dissecção da retina do camundongo".
    3. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção no gelo.
    4. Dobre um lenço sem fiapos em um pequeno quadrado e umedeça-o com a mídia Neurobasal A.
    5. Transfira um olho para o pano úmido e sem fiapos usando uma pipeta de transferência de plástico com a extremidade aparada.
      NOTA: O pano sem fiapos fornece maior atrito para evitar que o olho se mova durante a dissecção.
    6. Pegue uma agulha de 26 G e perfure o lado da córnea anterior ao limbo.
    7. Use uma tesoura Vannas para cortar ao longo do limbo a partir do ponto de punção para remover a córnea.
    8. Uma vez removida a córnea, segure a esclera a meio caminho entre o limbo e a cabeça do nervo óptico com um par de pinças. Usando outro par de pinças na mão oposta, segure a lente e remova-a rapidamente em um movimento rápido.
      NOTA: Se a lente for removida lentamente, a retina permanecerá presa à lente e se tornará difícil de dissecar.
    9. Transfira a ocular para uma placa de Petri com Neurobasal A frio no gelo.
    10. Usando uma pinça com as duas mãos, pegue a ocular e segure cuidadosamente a taça na ora serrata.
      1. Para liberar o copo da retina da esclera, aperte a esclera usando uma pinça, tomando cuidado para não prender o tecido da retina.
      2. Deslize a pinça cuidadosamente entre o tecido escleral e o tecido da retina ao redor de todo o globo até que toda a retina seja liberada do limbo.
    11. Usando uma tesoura Vannas, faça uma pequena incisão na esclera no limbo.
    12. Pegue uma pinça para agarrar as bordas da incisão e descasque o tecido escleral até a região da cabeça do nervo óptico. Segure a esclera usando uma pinça na mão não dominante e guie suavemente a retina para longe da esclera usando uma pinça fechada na mão dominante.
    13. Corte a cabeça do nervo óptico com uma tesoura para separar completamente a retina da esclera e de qualquer nervo óptico que reste.
    14. Transfira a retina usando uma pipeta de transferência aparada para o tubo de microcentrífuga pré-preparado de 1,5 mL para falta de glicose da etapa 1.1.4, que contém 200 μL de meio neurobasal-A (sem glicose)-1 retina por tubo.
  2. Etapa de falta de glicose
    1. Transferir os tubos do passo 2.1.14 para um banho-maria a 37 °C e incubar a 37 °C durante 20 min.
  3. Incubação NBDG
    1. Transfira cada retina para um novo tubo pré-marcado para incubação de 6-NBDG a partir da etapa 1.1.4, que contém 200 μL de 500 μM de 6-NBDG em meio neurobasal-A da etapa 1.2.2.
      NOTA: A retina deve ser transferida usando uma pipeta de transferência que foi cortada para aumentar a ponta de modo a transferir a retina com o mínimo de dano. Além disso, isso pode ser feito com pinças se estiver confiante na capacidade de transferir retina sem danos.
    2. Transferir os tubos para banho-maria a 37 °C e incubar a 37 °C durante 60 min.
  4. Preparação de padrões 6-NBDG (faixa de concentração 0 μM-40 μM)
    NOTA: Prepare os padrões durante o período de incubação de 60 minutos 6-NBDG (etapa 2.3.2.). Os padrões podem ser preparados à temperatura ambiente. Proteja as soluções da luz.
    1. Rotule os tubos de microcentrífuga de 1.5 mL #1-8 para os 8 padrões (consulte a Figura 3).
    2. Para o padrão #1 (40 μM 6-NBDG), pipetar 32 μL de solução-mãe 6-NBDG 500 μM feita na etapa 1.2.1.
    3. Adicione 368 μL de meio neurobasal-A no tubo de microcentrífuga e misture bem pipetando para cima e para baixo.
    4. Para os padrões #2-8, diluir as amostras em série da seguinte forma:
      1. Pipete 200 μL de meio neurobasal-A nos tubos #2-8.
      2. Pegue 200 μL do tubo padrão # 1 e pipete-o no tubo # 2, depois misture bem com a pipeta pipetando para cima e para baixo.
      3. Pegue 200 μL do tubo padrão # 2 e pipete para o tubo padrão # 3. Misture bem com a pipeta pipetando para cima e para baixo.
      4. Pegue 200 μL do tubo padrão # 3 e pipete-o para o tubo # 4, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      5. Pegue 200 μL do tubo padrão # 4 e pipete-o para o tubo # 5, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      6. Pegue 200 μL do tubo padrão # 5 e pipete-o para o tubo # 6, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      7. Pegue 200 μL do tubo padrão # 6 e pipete-o para o tubo # 7, depois misture bem pipetando-o para cima e para baixo.
      8. Não adicione nenhuma solução adicional ao tubo # 8 (ou seja, ele deve conter apenas 200 μL de meio neurobasal-A adicionado na etapa 2.4.4.1.).
  5. Lavagem, sonicação e centrifugação para coleta de amostras
    1. Remova todos os tubos do banho-maria a 37 °C assim que a incubação de 60 minutos com 6-NBDG estiver concluída.
    2. Lave cada retina com 500 μL de meio neurobasal-A gelado o mais rápido e cuidadosamente possível.
      1. Para lavar, remova a solução de 6-NBDG com uma pipeta, certificando-se de não tocar ou perturbar o tecido retiniano.
        NOTA: Há também a opção de transferir a retina com uma pinça do tubo de incubação 6-NBDG para um tubo novo que tenha 500 uL de meio neurobasal-A. Então, você só precisa fazer 3 lavagens adicionais. Faça isso se estiver confortável com sua capacidade de não danificar a retina com uma pinça.
      2. Em seguida, descarte a solução em um recipiente de lixo apropriado. Pipete imediatamente 500 μL de meio frio neurobasal-A no mesmo tubo para substituir a solução que foi removida. Substitua os tubos no gelo entre as lavagens.
    3. Repita mais 3 vezes para um total de 4 lavagens.
    4. Usando uma pipeta de transferência com borda aparada ou pinça, transfira cuidadosamente a retina para os tubos de sonicação contendo meio A neurobasal em gelo (consulte a etapa 1.1.4).
    5. Corte a retina em pedaços pequenos usando uma pequena tesoura de dissecação.
      NOTA: Certifique-se de lavar as ferramentas em etanol entre o corte de cada retina para não contaminar outras amostras.
    6. Sonicar cada retina por 5-10 s em uma amplitude de 10 e imediatamente colocá-la de volta no gelo.
      NOTA: Certifique-se de limpar a sonda de sonicação entre as amostras com etanol 100% seguido de H2O ultrapuro. Neste ponto, pré-resfrie a centrífuga a 4 °C ou utilize a centrífuga em uma câmara fria a 4 °C, se disponível.
    7. Centrifugar a 4 °C durante 15 min à velocidade máxima de 21130 x g or, se for inferior a 21130 x g.
      NOTA: Durante a centrífuga de 15 minutos na etapa 2.5.7, pipete 100 μL dos padrões # 1-8 feitos na etapa 2.4 em uma placa preta de fundo transparente de 96 poços.
  6. Lendo amostras em um leitor de placas
    1. Após o término da centrífuga de 15 minutos, remova 100 μL de sobrenadante e pipete para a placa de 96 poços.
    2. Insira a placa no leitor de placas.
      NOTA: A placa deve ter 100 μL de cada amostra e 100 μL de cada padrão.
    3. No software do leitor de placas, selecione o ensaio de ponto final de fluorescência com os parâmetros selecionados na etapa 1.1.7.
    4. Execute o ensaio e salve os resultados.
    5. Pipetar amostras de placa de 96 poços para os tubos pré-marcados de 1.1.4 para o ensaio de Pierce.
      NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser imediatamente analisadas para proteína (veja abaixo) ou armazenadas a -80 ° C.
  7. Ensaio de Pierce para normalização de proteínas
    NOTA: O ensaio de Pierce deve ser executado em duplicata (padrões e amostras) para maior precisão.
    1. Usando os padrões de ensaio de proteína pré-diluída do ensaio de Pierce, pipete 10 μL de cada um em duplicata em uma placa inferior transparente de 96 poços.
    2. Pipetar 10 μL de cada uma das amostras em duplicado do passo 2.6.5 para a placa de 96 poços.
    3. Adicione 150 μL de reagente Pierce a todos os poços contendo padrões ou amostras. Cubra a placa de 96 poços e misture em um agitador de placas em velocidade média por 1 min.
    4. Incube a placa à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
    5. Insira a placa no leitor de placas. Selecione o ensaio do ponto final de absorbância e defina o comprimento de onda para 660 nm.
    6. Meça a absorbância de padrões e amostras e salve os resultados. Calcular o total de microgramas de proteína em cada amostra traçando uma curva padrão.
  8. Calculando a captação de 6-NBDG da retina.
    NOTA: Os resultados do 6-NBDG precisam ser normalizados para o conteúdo total de proteína devido aos tamanhos irregulares da retina.
    1. Usando os valores de intensidade de fluorescência obtidos na etapa 2.6, use as leituras de fluorescência de padrões predeterminados para traçar uma curva padrão de fluorescência de 6-NBDG e quantificar a concentração de 6-NBDG (μM) em cada amostra.
    2. Normalize os resultados da amostra para as quantidades de proteína correspondentes para determinar a proteína [6-NBDG] μM / μg.

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Resultados

A Figura 4 mostra medições representativas de fluorescência de glicose da retina de camundongos WT incubados com 6-NBDG por diferentes períodos de tempo. Após 30 min de incubação, os níveis de 6-NBDG foram em média de 336 ± 27,91 UA, enquanto após 60 min, os níveis de 6-NBDG aumentaram para uma média de 616,3 ± 8,38 UA. Uma incubação adicional de 30 min levou a um nível reduzido de 6-NBDG (506,4 ± 5,3 UA). Aos 60 min, a variabilidade nos resultados foi mínima e, portanto, foi escolhida como ...

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Discussão

Em resumo, o método descrito permite que pesquisadores de ciências básicas meçam a captação do análogo fluorescente da glicose, 6-NBDG, na retina neural murina ex vivo . A glicose é um metabólito essencial para a retina neural, sua captação suporta as altas taxas de glicólise e respiração mitocondrial necessárias para produzir energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP)1. Como a glicose é o substrato energético preferido, muitas células da retina ex...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por fundos departamentais irrestritos concedidos a Lauren K. Wareham.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
# 5 pinçaKatenaK5-6550Usado para dissecção de retina
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" agulhasol-M112658Usado para perfurar a córnea durante a dissecção
Tubos de 5 mLMTC bioc2540
Tubos de 50 mLAvantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106Placas fluorescentes de
96 poços analógicos gucose pretas com fundo transparenteThermo Fisher Scientific265301
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258Usado na configuração de anestesia
BAY-876Millipore SigmaSML1774Para inibição de GLUT1.
Centrifugue a 4 > CEppendorfEPP-5424
Gás comprimido (5% de dióxido de carbono, 95% de oxigênio)AirgasUN3156Usado na anestesia configurar
pinças curvasInstrumento cirúrgicoRoboz RS-5137Usado para dissecção de retina
DDH2OElga LabWaterElga PureLab UltraUsado após etanol para limpar o sonicator entre as amostras
Microscópio de dissecaçãoOlympusszX12Usado para dissecção de retina
Etanol 200 provaDecon laboratories2701Para ser usado para limpar o sonicator entre amostras
Suporte de tubo flutuante de espumaThermo Fisher Scientific36-099-2328Para tubos durante a incubação em etapas de banho-maria
Tesoura geralInstrumento cirúrgico RobozRS-680Usado para retina dissecção
Isoflurano frasco de 250 mLPiramal cuidados intensivosNDC   6679401725Anestesia
Equipamento de isofluranoVetequip vendido pela VWR89012-492Usado para anestesiar antes da eutanásia
Lenços umedecidos KimVWR82003-820
Leitor de microplacasDispositivos molecularesLeitor de microplacas SpectraMax M2Usado para ler amostras
Neurobasal- A mediaGibco12349-015
Cone do nariz (baixo máscara de anestesia de perfil)Kent ScientificSOMNO-0801Usado para fornecer ansethesia
Objetivo no microscópio de dissecaçãoOlympusDF plapo 1x pfUsado para dissecção de retina
Placa de PetriVWR25384-088Usado durante a dissecção da retina
Reagente de ensaio de perfuraçãoThermo Fisher Scientific1861426
Pontas de pipeta P20Olympus Plásticos26-404
Ponteiras de pipeta P200, P1000, P10 XLVWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetas Pipetador P200, P1000, P20, P10VWRF144055M, F144056M, F144058M F144059M
Software SoftMax Pro no computadorDispositivos molecularesSoftware SoftMax Pro 7Software usado para ler amostra
Desmembranador sônicoThermo Fisher Amostra deSonicate de FB50110(retina)
Pipetas de transferênciaFisherbrand13-711-9AMUsado para transferir retina de um tubo para outro Tesoura de mola
VannasKatenaK4-5000Usado para dissecção de retina
Banho-maria ajustado para 37 ° CN/AN/A Usadopara incubação
Científica

Referências

  1. Casson, R. J., Chidlow, G., Crowston, J. G., Williams, P. A., Wood, J. P. M. Retinal energy metabolism in health and glaucoma. Prog Retin Eye Res. 81, 100881(2021).
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  3. Fernandes, R., Hosoya, K. -I., Pereira, P. Reactive oxygen species downregulate glucose transport system in retinal endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C927-C936 (2011).
  4. Badr, G. A., Tang, J., Ismail-Beigi, F., Kern, T. S. Diabetes downregulates GLUT1 expression in the retina and its microvessels but not in the cerebral cortex or its microvessels. Diabetes. 49 (6), 1016-1021 (2000).
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  8. Moreno, M., et al. Morphological and morphometric changes in rat optic nerve microvessels in a glaucoma experimental model. Arch Soc Esp Oftalmol. 89 (12), 471-476 (2014).
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  12. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nat Commun. 6 (1), 6807(2015).
  13. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  14. Wareham, L. K., et al. Solving neurodegeneration: common mechanisms and strategies for new treatments. Mol Neurodegener. 17 (1), 23(2022).

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