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Artigo de método

Imagem de super-resolução do biofilme de Proteus mirabilis por microscopia de expansão

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DOI:

10.3791/67932

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18 de julho de 2025

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1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo abrangente para PmbExM, uma técnica de Microscopia de Expansão projetada especificamente para biofilmes de Proteus mirabilis . O PmbExM utiliza um tratamento enzimático gradual de amostras de biofilme para obter uma expansão isotrópica de 4,3 vezes, permitindo a análise de super-resolução da organização espacial das estruturas celulares e subcelulares dentro dessas comunidades microbianas sésseis.

Resumo

O acesso a informações visuais detalhadas e dados quantitativos de amostras microbiológicas usando microscopia óptica convencional é limitado pela barreira de difração. Uma solução para melhorar a resolução é a Microscopia de Expansão (ExM), uma técnica de super-resolução inovadora e econômica que amplia fisicamente as amostras em aproximadamente quatro vezes seu tamanho original. Para uma expansão bem-sucedida, é essencial homogeneizar as propriedades mecânicas do material biológico. Os biofilmes são comunidades bacterianas, aderindo a uma superfície e embutidas em uma matriz extracelular que produzem; eles exigem que os protocolos ExM sejam adaptados para acomodar seus componentes estruturais exclusivos. Este artigo apresenta o biofilme ExM de Proteus mirabilis (PmbExM), uma variante especializada do ExM que permite a visualização em super-resolução de biofilmes de P. mirabilis cultivados por 48 h. O protocolo se concentra na degradação direcionada dos principais componentes estruturais das amostras por meio de digestões enzimáticas seriadas, otimizadas perto de suas condições teóricas. O PmbExM utiliza uma combinação de enzimas, incluindo α-amilase, celulase e glicosídeo-hidrolases de litíaca para hidrólise de polissacarídeos; mutanolisina para hidrólise de peptidoglicanos; e proteinase K para hidrólise de proteínas. Esses procedimentos de digestão são independentes do processo de gelificação, permitindo modificações para atender a requisitos específicos de homogeneização em diferentes modelos de biofilme. Essa adaptabilidade oferece grande potencial para aplicação em várias espécies bacterianas e condições de crescimento. O ExM foi aplicado a diferentes espécies de biofilme com fatores de expansão gerais abaixo do ideal. Em contraste, o PmbExM atinge o fator de expansão máximo teórico do hidrogel ExM de acrilamida-acrilato padrão, sem distorção significativa da morfologia ou topologia. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo de super-resolução acessível para visualizar a arquitetura, montagem e características celulares e intracelulares de biofilmes de P. mirabilis .

Introdução

A microscopia de fluorescência é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a arquitetura, composição e função do biofilme1. No entanto, a capacidade da microscopia óptica de resolver as características estruturais, celulares e subcelulares dos biofilmes é limitada pela barreira de difração. A Microscopia de Expansão (ExM) é uma técnica de super-resolução inovadora, acessível e fácil de usar, com grande potencial para revelar a estrutura do biofilme além do limite de difração 2,3. O ExM aumenta a resolução expandindo isotropicamente os espécimes biológicos aproximadamente quatro vezes seu tamanho original. O método envolve a polimerização in-situ de um hidrogel iônico expansível em toda a amostra e preserva o arranjo espacial relativo dos alvos moleculares quando aplicado com cuidado 4,5.

Para que o ExM funcione corretamente, homogeneizar as propriedades mecânicas do material biológico é uma etapa crucial6. As variantes padrão do ExM foram desenvolvidas em culturas de células e tecidos de mamíferos, onde alcançaram eficientemente a homogeneização apenas por meio da digestão proteolítica da proteinase K 4,5 ou desnaturação de proteínas moles com detergentes e autoclavagem7, produzindo expansão isotrópica de 4 vezes. No entanto, no caso de bactérias e biofilmes bacterianos, a parede celular do peptidoglicano e os elementos da matriz EPS, como polissacarídeos estruturais, são obstáculos à expansão 2,3,8,9.

Este artigo descreve os procedimentos da Microscopia de Expansão de Biofilme de Proteus mirabilis (PmbExM), uma variante ExM personalizada projetada para expandir biofilmes de P. mirabilis, um bacilo gram-negativo clinicamente relevante associado a alta resistência a antibióticos e infecções do trato urinário associadas a cateteres10. O PmbExM usa uma combinação de tratamentos enzimáticos com mutanolisina, α-amilase, celulase, liticase e proteinase K para hidrolisar a parede celular do peptidoglicano, polissacarídeos e proteínas, respectivamente. Os resultados demonstram que este método atinge uma expansão isotrópica de 4,3 vezes de biofilmes de P. mirabilis com 48 h de idade. A técnica permite a visualização em super-resolução da arquitetura, montagem e características intracelulares do biofilme de P. mirabilis por meio de coloração dupla3. Além disso, o PmbExM pode ser adaptado a outros modelos de biofilme, ajustando os tratamentos enzimáticos para atingir componentes de biofilme específicos da espécie.

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada dos procedimentos envolvidos na gelificação, digestão, expansão e montagem de amostras de biofilme para PmbExM. Além disso, este trabalho descreve as condições de crescimento bacteriano, formatos de amostra e técnicas de coloração fluorescente usadas pelos autores, juntamente com uma rotina de processamento e análise de dados que pode ser facilmente aplicada por pesquisadores com experiência limitada em processamento de imagens. Para um guia mais abrangente e aprofundado sobre processamento e análise de imagens, consulte Castagnini, D. et al.3.

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Protocolo

O processo geral do PmbExM está resumido na Figura 1. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para encontrar a composição de todas as soluções nomeadas (ou seja, solução de monômero, solução de digestão de proteinase K, etc.) usadas neste trabalho. Da mesma forma, consulte o Arquivo Suplementar 2, o Arquivo Suplementar 3 e o Arquivo Suplementar 4 para uma rotina simplificada de processamento e análise de dados que pode ser usada por pesquisadores sem vasta experiência em processamento de imagens. O protocolo pode ser realizado confortavelmente durante um período de 2,5 a 3 semanas: a primeira semana dedicada à limpeza e esterilização da lamínula, crescimento do biofilme e fixação da amostra; a segunda semana para a coloração da amostra e o próprio protocolo PmbExM, e a terceira para montagem da amostra e aquisição da imagem. Além disso, considere 1 semana de preparativos prévios para os materiais e soluções necessários. Detalhes sobre os reagentes, materiais, equipamentos e software empregados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

figure-protocol-1
Figura 1: Ancoragem, polimerização, digestão e diálise do protocolo PmbExM para expansão, observação e análise bem-sucedidas do biofilme de P. mirabilis . A coluna da esquerda identifica seis estados da amostra em etapas selecionadas durante o protocolo de expansão. Inicia-se a partir da amostra de biofilme fixa, permeabilizada e corada, seguindo quatro estados intermediários até o estado final gelificado e expandido, pronto para microscopia e análise de imagem em super-resolução. A matriz EPS do biofilme é mostrada em verde, a parede celular bacteriana é representada por linhas roxas, a estrutura celular geral da proteína é mostrada em cinza e o polímero ExM de acrilamida-acrilato é exibido como linhas azuis onduladas. Todas as enzimas envolvidas no processo são representadas por símbolos do Pac-Man: 3 glicosídeo-hidrolases (verde) para hidrólise de exopolissacarídeos: α-amilase, celulase e liticase; mutanolisina (roxa) para degradação da parede celular do peptidoglicano; e proteinase K (cinza) para digestão geral de proteínas. As cores dos símbolos do Pac-Man correspondem às respectivas estruturas de destino. Todos os objetos mostrados em baixa opacidade ou bordas tracejadas representam um estado de degradação enzimática. Essa figura é modificada de Castagnini, D. et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Limpeza e esterilização de lamínulas de vidro para formação de biofilme

  1. Ultrassonicar lamínulas de vidro de 12 mm em hidróxido de sódio 1 M por 20 min em temperatura ambiente e depois enxaguar com água deionizada abundante.
  2. Ultrassonicar as lamínulas em etanol a 70% (v/v) por 15 min em temperatura ambiente e depois enxaguar com etanol a 95% (v/v).
  3. Deixe as lamínulas secarem ao ar livre em temperatura ambiente.
  4. Esterilize por autoclavagem.

2. Crescimento do biofilme de Proteus mirabilis

  1. Cultive P. mirabilis em 10 mL de caldo Luria Bertani (LB) por 24 h a 37 °C sem agitar.
    NOTA: Uma cepa do tipo P. mirabilis disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) foi adquirida e empregada neste estudo, mas o uso de qualquer cepa de P. mirabilis que esteja prontamente disponível é incentivado.
  2. Pegue 1 mL da cultura e adicione-o a 9 mL de caldo LB fresco e estéril para gerar uma suspensão bacteriana de diluição 1:10.
  3. Verifique a densidade óptica (OD) a 600 nm da suspensão bacteriana 1:10 em 0,1. Ajustar se necessário adicionando pequenos volumes de cultura fresca de LB ou P. mirabilis até atingir OD600 = 0,1.
  4. Introduzir lamínulas de vidro de 12 mm (previamente limpas e esterilizadas) numa placa estéril de poliestireno 24 (uma lamínula por alvéolo).
    NOTA: Certifique-se de que toda a superfície da lamínula toque o fundo do poço. O biofilme se formará na lateral da lamínula, que está voltada para cima.
  5. Semeie os alvéolos da placa com 350 μL da suspensão bacteriana OD600 = 0,1.
    NOTA: Recomenda-se semear apenas os poços internos da placa, enquanto enche os poços externos (ou seja, poços nas linhas A e D e nas colunas 1 e 6) com água estéril ou caldo LB. Isso ocorre porque os poços externos são propensos a taxas de evaporação de líquidos mais altas do que os poços internos, o que afeta o crescimento do biofilme.
  6. Coloque a placa semeada dentro de uma incubadora e posicione-a com 45 graus de inclinação.
    NOTA: Use material de laboratório comum, como tubos de centrífuga de 50 mL ou caixas de ponteiras de micropipeta. A posição inclinada permitirá a formação de uma interface ar-líquido na superfície das lamínulas na qual o biofilme de P. mirabilis estabelecerá sua região mais espessa.
  7. Deixar formar-se biofilmes durante 48 h a 37 °C, sem agitar.
    NOTA: Esta configuração de crescimento de biofilme não é adequada para tempos de incubação superiores a 48 h devido à dessecação do biofilme devido à evaporação do meio.

3. Fixação e armazenamento de amostras de biofilme

  1. Remova cuidadosamente o meio de cultura dos poços e lave suavemente as lamínulas contendo biofilme duas vezes com 300 μL de solução salina de fosfato estéril (PBS) por 5 min em temperatura ambiente com agitação muito leve.
    NOTA: Evite a destruição dos biofilmes com troca repetitiva de fluidos usando pequenos volumes para incubações ou lavagem. 300-400 μL de líquido são suficientes para submergir os biofilmes em uma placa de 24 poços. A pipetagem lenta e metódica é fortemente sugerida, além de evitar atingir os biofilmes diretamente com as soluções trocadas.
  2. Remova cuidadosamente o PBS e substitua-o por 400 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% (p / v) em PBS por 20 min em temperatura ambiente para fixação do biofilme.
  3. Remova o PFA e substitua-o por 300 μL de PBST a 1% (Triton X-100 a 1% v/v em PBS) para permeabilização celular. Incubar por 20 min em temperatura ambiente.
  4. Substitua a solução de PBST a 1% por 300 μL de PBST a 0,3% (Triton X-100 a 3% v/v em PBS). Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
  5. Remova o PBST a 0,3% e substitua-o por 300 μL de uma mistura 50:50 de metanol e PBST a 0,3% para desidratação da amostra. Incube por 5 min em temperatura ambiente e depois substitua a mistura por 1 mL de metanol absoluto.
    NOTA: Adicione 1 mL de metanol lentamente, direcionando-o contra as paredes do poço. Este maior volume de metanol é usado para evitar sua evaporação completa durante o armazenamento da amostra.
  6. Armazenar as amostras a -20 °C durante pelo menos 1 dia e até um mês.
    NOTA: Recomenda-se selar as placas usando um filme de cera flexível para retardar a evaporação do metanol e a dessecação das amostras.
  7. Após o uso, reidratar sequencialmente as amostras substituindo o metanol por 300 μL de uma mistura 50:50 de metanol e 0,3% de PBST e, em seguida, por 300 μL 0,3% de PBST, à temperatura ambiente.

4. Coloração fluorescente de biofilme

  1. Incubar as amostras de biofilme reidratado com 300 μL de 50 μg / mL de conjugado de lectina fluorescente de aglutinina de gérmen de trigo (doravante denominado conjugado WGA; ver Tabela de Materiais) em PBS por 20 min em temperatura ambiente para coloração de parede celular / cápsula / exopolissacarídeos.
    NOTA: Consulte os tópicos relevantes sobre coloração fluorescente na seção Discussão. A partir de agora, proteja as amostras da luz.
  2. Remova a solução conjugada WGA e lave suavemente duas vezes com 300 μL de PBS por 10 min em temperatura ambiente.

5. Etapas do PmbExM

  1. Ancoragem MA-NHS e polimerização de acrilamida-acrilato
    1. Incubar as amostras de biofilme coradas com 400 μL de éster N-hidroxisuccinimidílico de ácido metacrílico 1 mM (MA-NHS) em PBS por 1 h à temperatura ambiente com agitação leve.
      NOTA: MA-NHS é um éster ativado que é propenso à hidrólise em meio aquoso, portanto, trate as amostras imediatamente após preparar o 1 mM em solução de PBS.
    2. Realize três lavagens suaves de 10 min com 300 μL de PBS à temperatura ambiente.
    3. Remova o PBS e substitua-o por 300 μL de solução de monômero. Incubar durante a noite (O.N.) a 4 °C.
    4. Construa as pré-câmaras de gelificação. Utilizar uma lâmina de vidro como base e colocar sobre ela dois pedaços de fita dupla face dobrada para funcionar como espaçadores de 400 μm. Disponha os espaçadores a 8-10 mm um do outro.
      NOTA: Consulte a Figura 2A para obter mais clareza sobre como construir a pré-câmara de gelificação. A fita dupla face usada aqui tinha aproximadamente 100 μm de espessura, por isso foi aparada e dobrada sobre si mesma para criar espaçadores de 3 mm x 5 mm x 0,4 mm. Meça a espessura da fita dupla-face disponível e organize-a de acordo. A absorção da solução gelificante pelos espaçadores de fita é insignificante. Como alternativa à fita dupla face, lamínulas de vidro redondas de 12 mm podem ser coladas com gotas de água e empilhadas até a altura necessária.
    5. Organize câmaras úmidas para proteger as amostras durante a polimerização da dessecação.
      NOTA: Uma caixa comum de pontas de micropipeta pode ser facilmente convertida em uma câmara úmida removendo o andaime de plástico das pontas e substituindo-o por toalhas de papel molhadas.
    6. Preparar um novo volume de solução gelificante misturando bem os volumes de solução monómera, 10 % (m/v) N, N, N', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED), 0,5 % (m/v) 4-hidroxi-TEMPO (4-HT) e 10 % (m/v) de persulfato de amónio (APS) numa proporção de 47:1:1:1, respectivamente. Misturar o APS com o resto dos reagentes da solução gelificante apenas quando estiverem terminados os passos até 5.1.5.
      NOTA: O volume total da solução de gelificação de estoque a ser preparada dependerá da quantidade de amostras de biofilme que estão sendo processadas. Por exemplo, para processar três amostras de biofilme, prepare 900 μL de solução gelificante misturando 846 μL de solução de monômero com 18 μL de TEMED a 10% (p/p), 18 μL de 4-HT a 0,5% (p/p) e 18 μL de APS a 10% (p/p). Para evitar a polimerização prematura, o APS deve ser adicionado por último à mistura e somente quando as amostras, pré-câmaras de gelificação e câmaras úmidas estiverem prontas para serem usadas. Mantenha todos os reagentes mencionados e a solução gelificante recentemente preparada resfriada durante esta etapa.
    7. Imediatamente após preparar a solução gelificante, remova suavemente a solução de monômero e substitua-a por 300 μL da primeira. Incubar a 4 °C durante 5 min.
    8. Enquanto a etapa 5.1.7 estiver em andamento, remova a tampa protetora restante das listras de fita dupla face dispostas nas lâminas de vidro e, no espaço entre elas, coloque 40 μL de solução gelificante.
    9. Após a conclusão da etapa 5.1.7, remova cada lamínula contendo biofilme de seu poço e coloque-a em cima da gota de 40 μL de solução gelificante previamente colocada em uma lâmina de vidro. Oriente a lamínula de modo que o biofilme em sua superfície entre em contato com a solução gelificante.
    10. Termine a construção da câmara de gelificação pressionando suavemente a lamínula com biofilme usando uma pinça para garantir sua aderência aos espaçadores de fita dupla face.
      NOTA: Esta configuração semelhante a um sanduíche consiste no que é chamado de câmara de gelificação (Figura 2B).
    11. Deixar as amostras polimerizarem no interior de uma câmara húmida e incubar durante 2 h a 37 °C sem agitação.
    12. Visualize as amostras sob microscopia de fluorescência (consulte a etapa 6.2.1) sem desmontar as câmaras de gelificação para captura de imagem pré-expansão.
      NOTA: Não deixe as amostras gelificadas fora da câmara úmida por mais de uma hora, pois os géis pré-expandidos são propensos à dessecação, o que torna a amostra inutilizável. Consulte a etapa SF2.3 (Arquivo Suplementar 2) para obter os procedimentos relevantes de aquisição pré-expansão.
    13. Desmonte as câmaras de gelificação e apare o excesso de gel ao redor da região de interesse na amostra de biofilme usando uma lâmina cirúrgica.
      NOTA: O corte dos géis é altamente recomendado para facilitar o manuseio e a montagem de amostras expandidas. Além disso, para acompanhar a orientação espacial da região de interesse nas amostras, corte os géis em uma forma assimétrica ou deixe um recorte característico no gel para facilitar o reconhecimento da orientação correta.
    14. Coloque as lamínulas que transportam os géis aparados dentro de uma nova placa de 24 poços, com o gel voltado para cima.
      NOTA: Nesta fase, as amostras gelificadas devem permanecer aderidas à sua lamínula de vidro original.
  2. Digestão enzimática I-III e coloração de DNA
    NOTA: A homogeneização das propriedades mecânicas das amostras de biofilme de P. mirabilis segue uma série de digestões enzimáticas que os autores categorizaram em 3 etapas, com base na estrutura biológica alvo da degradação: hidrólise de polissacarídeos (Digestão I), hidrólise de peptidoglicanos (Digestão II) e hidrólise de proteínas (Digestão III).
    1. Digestão I
      1. Mergulhe as amostras em 1 mL de solução de digestão de α-amilase. Incubar O.N. a 50 °C.
        NOTA: Grandes volumes (ou seja, 0,5-1 mL) de solução enzimática são usados para evitar a dessecação da amostra devido à alta temperatura de incubação.
      2. Remova a solução de α-amilase e lave os géis por 5 min em temperatura ambiente com 300 μL de tampão de digestão de celulase.
      3. Remova o tampão de digestão da celulase e substitua-o por 500 μL de solução de digestão da celulase. Incubar durante 2 h a 45 °C.
      4. Remova a solução de digestão da celulase e lave os géis por 5 min em temperatura ambiente com 300 μL de tampão de digestão de liticase.
      5. Remova o tampão de digestão de lyticase e substitua-o por 500 μL de solução de digestão de lyticase. Incubar durante 2 h a 30 °C.
    2. Digestão II
      1. Remova a solução de digestão de lyticase e lave os géis por 5 min em temperatura ambiente com 300 μL de tampão de digestão de mutanolisina.
      2. Remova o tampão de digestão da mutanolisina e substitua-o por 1 mL de solução de digestão da mutanolisina. Incubar O.N. a 55 °C.
    3. Digestão III
      1. Remova a solução de digestão da mutanolisina e lave os géis por 5 min em temperatura ambiente com 300 μL de tampão de digestão da proteinase K. Remova o tampão de digestão da proteinase K e substitua-o por 500 μL de solução de digestão de proteinase K. Incubar durante 2 h a 37 °C.
    4. (OPCIONAL) Coloração de DNA
      1. Remova a solução de proteinase K e lave os géis com 300 μL de PBS 10x por 5 min em temperatura ambiente.
      2. Remova o PBS 10x e substitua-o por 300 μL de coloração de ácido nucleico fluorescente vermelho 5 μM em PBS 10x por 30 min em temperatura ambiente.
        NOTA: Consulte a seção Discussão para comentários sobre a coloração de DNA para procedimentos ExM.
  3. Expansão
    1. Remover a solução de proteinase K (ou a solução de coloração de ADN, se tiver sido efectuada a etapa 5.2.4 opcional) e transferir os géis para uma placa de Petri de 60 mm. Coloque um gel por placa de Petri.
      NOTA: Use um pincel pequeno e plano para empurrar o gel em sua lamínula de vidro. Com pinças de laboratório, pegue a lamínula de vidro e use-a como plataforma para o gel. Evite que o gel caia da lamínula com a ajuda da escova ao retirá-lo do poço da placa. Evite que os géis se dobrem sobre si mesmos.
    2. Encha a placa de Petri com excesso de água deionizada, mergulhe totalmente o gel e incube sob agitação suave em temperatura ambiente por 20 min. Troque a água 4-5 vezes.
      NOTA: Observe que o gel expansível torna-se praticamente invisível quando submerso em água. Posicione a placa de Petri contra a luz para facilitar a localização do gel e evitar danificá-lo com a sucção da pipeta ou micropipeta Pasteur durante as trocas de água.

figure-protocol-2
Figura 2: Câmara de gelificação e montagem da amostra. (A) Câmara de pré-gelificação. Em um slide, posicione 2 espaçadores de fita dupla face (amarelo). Uma lamínula de vidro (figure-protocol-3 = 12 mm) fica no topo do como referência de distância. (B) Câmara de gelificação. O biofilme bacteriano (verde) é formado na superfície inferior da lamínula. Espaçadores de 400 μm de espessura (laranja) são feitos de recortes de fita dupla face de 100 μm de espessura. Os espaçadores permitem que o gel incorpore toda a amostra e evite o transbordamento da solução gelificante das bordas da câmara, evitando que a amostra seja esmagada entre a lâmina e a lamínula. (C) Câmaras de imagem impressas em 3D (visite o link a seguir para acessar os arquivos .stl https://github.com/scianlab/ExM). Uma amostra de gel expandido (esquerda) e uma amostra de gel expandido imersa em água deionizada (direita). Os géis expandidos tornam-se praticamente invisíveis quando imersos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Observação e análise

  1. Montagem de amostras expandidas
    1. Prepare as câmaras de imagem com revestimento de polilisina para imobilização da amostra durante a imagem11: Mergulhe a superfície de vidro da câmara de imagem (consulte a Tabela de Materiais) com 0,1% (p / v) de poli-L-lisina por 20 min em temperatura ambiente.
    2. Remova a solução de poli-L-lisina e faça duas lavagens com excesso de água deionizada. Deixe secar ao ar por 1 h ou coloque dentro de uma incubadora a 37 °C para acelerar o processo de secagem.
    3. Após o quinto ciclo de diálise do passo 5.3.2, retire a água que cobre os géis e utilize uma pequena escova plana para empurrar a amostra para uma lamínula de vidro de 24 mm x 50 mm. Use a lamínula retangular como plataforma para o gel e retire-a da placa de Petri.
    4. Remova o excesso de água do gel usando papel de seda para evitar que a água bloqueie o contato direto entre a superfície do gel e o revestimento de polilisina na superfície de vidro da câmara de imagem.
    5. Coloque cuidadosamente o gel na superfície de vidro da câmara de imagem, evitando a retenção de bolhas de ar entre o gel e o vidro.
      NOTA: A superfície de vidro da câmara de imagem deve estar completamente seca. Se as imagens pré-expansão foram tiradas, considere uma orientação correta do gel expandido para facilitar a localização dos campos de visão capturados anteriormente na amostra pré-expandida.
    6. Adicione água deionizada até que o gel esteja completamente submerso (ver Figura 2C).
      NOTA: Os géis expandidos devem permanecer hidratados durante todo o processo de imagem para evitar encolhimento durante a captura.
  2. Aquisição de imagem
    1. Visualize e capture imagens das amostras em um microscópio fluorescente limitado por difração disponível.
      NOTA: Os autores utilizaram um microscópio confocal de disco giratório, com objetiva de imersão em água de 63x de abertura numérica (NA) de 1,2. Para a excitação do fluoróforo, foi utilizada uma linha de laser de estado sólido a 488 e 647 nm. As capturas foram feitas com uma câmera digital CMOS de 16 bits controlada por software proprietário (consulte a Tabela de Materiais). O tamanho do voxel foi definido para 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (eixos XYZ ).
  3. Processamento de imagem
    1. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para encontrar uma rotina de processamento de imagem digital para a segmentação de bactérias (seção SF2.1), medição da largura da célula (seção SF2.2), determinação de EF (seção SF2.3) e correspondência de imagem para condições pré-expandidas e expandidas (seção SF2.4).

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Resultados

O PmbExM expandiu o biofilme de P. mirabilis em 4,3 vezes e preservou a morfologia e a topologia
A Figura 3A-D evidencia a ampliação física das células do biofilme de P. mirabilis e o aumento da resolução trazido pela técnica. Além disso, isso não foi observado apenas em regiões finas de biofilme, onde as células se organizam em um layout semelhante a uma monocamada, mas também em regi...

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Discussão

Etapas críticas do PmbExM
Como acontece com qualquer variante do ExM, uma das etapas mais críticas do protocolo é a homogeneização das propriedades mecânicas da amostra. No caso do PmbExM, isso é conseguido por meio de uma série de tratamentos enzimáticos. A digestão insuficiente pode resultar em FEs baixos e danos potenciais à morfologia e/ou topologia do biofilme, levando a uma resolução abaixo do ideal e resultados não confiáveis. Por outro lado, digestões excessiv...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse financeiros ou pessoais relacionados a este trabalho.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Juan Eduardo Rodríguez e ao Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) por sua contribuição para a implementação das técnicas de expansão no SCIAN-Lab. Este trabalho foi financiado pelos projetos ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66.390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) e Projeto Binacional Regional Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
&alfa;-Amilase de Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070Digestão de polissacarídeos
0,1% (p/v) solução aquosa de poli-L-lisina Sigma-AldrichP8920Imobilização de amostras para imagens
de lamínulas de vidro de 12 mmChemglass Life SciencesCLS-1760Componente da câmara de gelificação
Câmera C13440-20CU de 16 bitsHamamatsu PhotonicsNão disponívelCâmera digital CMOS para aquisição de imagens
Lamínulas de vidro de 24 mm x 50 mmChemglass Life SciencesCLS-1764Manipulação/manuseio de amostras
Câmara de imagem impressa em 3DDesigninterno-Opçãocâmara de imagem
4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (4-hidroxi-TEMPO)Sigma-Aldrich176141Componente de solução gelificante
Placa de fundo de vidro de 6 poços com paredes pretasCelVisP06-1.5H-N Opção decâmara de imagem
Ácido acético Sigma-Aldrich818755componente tampão enzimático
Acrilamida Sigma-AldrichA4058Componente da solução de monômero
Persulfato de amônioSigma-AldrichA3678Componente da solução de gelificação
Microscópio Axiovert 200ZeissNão disponívelMicroscópio confocal
Cloreto de cálcioSigma-AldrichC8106Componente tampão enzimático
C-Apocromático 63x 1,2 NA objetiva de imersão em águaZeissNão disponívelObjetiva de microscópio
Celulase de Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178Digestão de polissacarídeos
Chamlide CMB 35 mm prato câmara de imagem magnéticaInstrumento de célula vivaNão disponívelOpção de câmara de imagem
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich472301MA-NHS solução de estoque de reagente de ancoragem 
Fosfato dissódicoSigma-AldrichS3264Componente tampão enzimático
EtanolSigma-AldrichE7023Limpeza e esterilização
Ácido etilenodiaminotetracéticoMerck324503Componente tampão enzimático
Poliestireno Falcon 24 placas de poçosCorning351147Plataforma de procedimentos gerais
FIJI SoftwareNational Institutes ofHealth-Software deprocessamento de imagem
GlicerolSigma-AldrichG7893Componente tampão enzimático
Cloridrato de guanidinaThermo Scientific24115Componente tampão enzimático
Huygens SoftwareSoftware científico de imagem de volumerestauração de imagem
Ácido clorídricoSupelco1.00317Preparação de tampão
Papel de seda KimwipesFisher Scientiffic06-666Remoção de excesso de água
Pinças de laboratórioMicroscopia eletrônica CiênciasM5EManipulação/manuseio geral de amostras
Caldo Luria BertaniInvitrogen12795-027Meio de crescimento de biofilme
Lyticase de Arthrobacter luteusSigma-Aldrich L4025Digestão de polissacarídeos
Cloretode magnésio Sigma-AldrichD5652Componente tampão enzimático
Ácido metacrílico Éster N-hidroxisuccinimidílicoSigma-Aldrich730300Reagente de ancoragem
MetanolSigma-Aldrich32213Desidratação e armazenamento de amostras
MicrobeJ --Software de processamento de imagem
plugin Lâminas de vidro microscópicasChemglass Life SciencesCG-8221Componente da câmara de gelificação
Fosfato monossódicoSigma-AldrichS9638Componente tampão enzimático
Mutanolisina de Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Digestão de peptidoglicano
N, N, N', N'-tetrametiletilenodiaminaSigma-AldrichT7024Componente da solução gelificante
N,N′-metilenobisacrilamidaSigma-AldrichM1533Componente da solução de monômero
Nunc 40,4 mm placas de Petri com fundo de vidroThermo Fisher12-567-400Opção de câmara de imagem
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127Fixação de amostra
Tampão fosfato salinoSigma-Aldrich79383Componente da solução de monômero, Lavagem, Tampão enzimático
Proteinase K de Engyodontium albumInvitrogen25530-031Digestão de proteínas
Proteus mirabilis ATCC 12453Microbiológicos0440PSujeito do estudo
Pincel pequeno e planoLoja de ferragens local-Manipulação/manuseio de amostras
Acetato de sódioSigma-Aldrich241245Componente tampão enzimático
Acrilato de sódioSigma-Aldrich408220Componente de solução de monômero
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS5761Componente tampão enzimático
Cloretode sódioSigma-AldrichS9888Componente de solução de monómero, Componente tampão enzimático
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich221465Limpeza de lâminas
de vidro Linha laser de estado sólidoOmicronNão disponível488, 568 e 647 nm Linha de laser de excitação
Coloração com ácido nucleico SYTO 61InvitrogenS11343Corante fluorescente
Tris(hidroximetil)aminometano cloridratoSAFC108219Componente tampão enzimático
Triton X-100Sigma-AldrichX100Permeabilização de amostra, Componente tampão enzimático
Volocity 7.0.0 software de capturaQuorumTechnologies-Microscoy software controlador de aquisição
Volocity ViewVox sistema de disco giratórioPerkin-ElmerNão disponívelSistema de disco giratório para confocal microscópio
Aglutinina de gérmen de trigo - ndash; Alexa Fluor 488 conjugado de lectina fluorescenteInvitrogenW11261Corante fluorescente
de para

Referências

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