Artigo de método

Estudo da morte celular programada induzida por nanopartículas de cobre em bactérias

DOI:

10.3791/67951

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16 de maio de 2025

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1Department of Laboratory Medicine and Biotechnology, College of Medicine, Tzu Chi University, 2Graduate Institute of Microbiology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Department of Biological Sciences, Missouri University of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

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As nanopartículas de cobre atuam como agentes antimicrobianos, gerando espécies reativas de oxigênio. Aqui, são apresentados procedimentos demonstrando que as nanopartículas de cobre são eficazes contra três patógenos clinicamente relevantes e que certas vias de morte celular programada estão envolvidas nesse processo bactericida.

Resumo

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Recentemente, as preocupações com patógenos multirresistentes e infecções incuráveis aumentaram devido ao uso excessivo e indevido de antibióticos. Nanomateriais, como nanopartículas metálicas e de óxidos metálicos, ganharam popularidade no campo biomédico como potenciais novas estratégias para combater patógenos multirresistentes. Este estudo investigou o uso de nanopartículas de cobre (CuNPs) como bactericida contra três patógenos oportunistas comuns adquiridos em hospitais - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) e Staphylococcus aureus (S. aureus) - que estão desenvolvendo cada vez mais resistência aos medicamentos. Protocolos detalhados são apresentados para sintetizar CuNPs de dois tamanhos (20 nm e 60 nm) e avaliar sua eficácia bactericida por meio de ensaios de colônias. Os mecanismos de ação antimicrobiana subjacentes aos CuNPs foram explorados avaliando mudanças na produção de espécies reativas de oxigênio. Além disso, quatro moduladores que inibem as funções proteicas humanas foram aplicados para estudar o envolvimento potencial das vias de morte celular programada (PCD) na morte bacteriana. Por meio dessa abordagem, sugere-se o surgimento potencial de cepas resistentes ao cobre, com base na pesquisa de proteínas da homeostase do cobre, incluindo reguladores transcricionais dependentes de cobre. Essas descobertas fornecem uma metodologia abrangente para estudar os efeitos bactericidas dos CuNPs e seu papel potencial no tratamento da resistência aos antibióticos.

Introdução

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As bactérias resistentes a medicamentos são uma séria causa de preocupação na medicina. Seu rápido surgimento reduziu a eficácia dos antibióticos convencionais, resultando em mais complicações clínicas. Representam uma grande ameaça para a saúde pública e criam uma necessidade urgente de novos agentes antimicrobianos. Uma via de pesquisa são os nanomateriais. Os nanomateriais possuem propriedades físico-químicas únicas que lhes permitem interagir com micróbios de maneiras que comprometem sua viabilidade. Por exemplo, as nanopartículas de prata (AgNPs) induzem estresse oxidativo em bactérias, resultando em disfunção proteica, ruptura da membrana, danos ao DNA e, finalmente, morte celular1. As nanopartículas de ouro (AuNPs), por outro lado, são conhecidas por suas propriedades antifúngicas e podem aumentar o efeito bactericida dos antibióticos, servindo como transportadores2.

Além disso, as nanopartículas de cobre (CuNPs) também atraíram atenção considerável devido ao seu potente efeito antimicrobiano e baixo custo de produção. Estudos sugerem que as CuNPs exibem atividade bactericida de amplo espectro pela interrupção da atividade enzimática e pela geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)3. A carga positiva das CuNPs facilita sua penetração nas bactérias, aumentando sua captação celular4. Esse mecanismo torna os CuNPs uma opção promissora para revestimento de superfícies, como em implantes, para prevenir infecções3. Uma descoberta interessante, no entanto, é que o efeito bactericida dos CuNPs parece ser dependente do tamanho. Alguns estudos descobriram que CuNPs menores exibem maior atividade antibacteriana, provavelmente devido à sua relação superfície-volume superior5.

A geração de ROS causa danos generalizados a células e bactérias, incluindo peroxidação lipídica, disfunção proteica, fragmentação do DNA e inibição da gliconeogênese / glicogenólise, e está envolvida na necrose ou morte celular programada (PCD) 6 , 7 , 8 . Estudos recentes revelaram que os sistemas PCD existem em bactérias, com modos de ação e efetores semelhantes aos dos sistemas eucarióticos9. As comunidades bacterianas podem induzir PCD em resposta ao estresse, incluindo o estresse oxidativo, por meio de um sistema toxina-antitoxina (TA)10. Em termos simples, o sistema toxina-antitoxina consiste em toxinas que podem interromper processos celulares essenciais e antitoxinas que podem formar complexos estáveis com as toxinas para inibir sua toxicidade em condições normais de crescimento. A maioria das bactérias e arqueias contém loci TA em seus genomas, muitas vezes presentes em múltiplas cópias de DNA extracromossômico e cromossômico. Existem vários tipos de sistemas TA, sendo o TA tipo II (conhecido como módulo MazE/MazF) de particular interesse. Sob condições de estresse, as antitoxinas são degradadas, permitindo que as toxinas inibam seus alvos celulares. Em E. coli e S. aureus, a toxina MazF é ativada em resposta a condições de estresse, como estresse oxidativo, alta temperatura e falta de aminoácidos. Consequentemente, a expressão da antitoxina MazE é reduzida, liberando a toxina MazF10. Estudos descobriram que o MazF permite a síntese de proteínas que permitem que uma pequena subpopulação sobreviva em condições adversas, enquanto a maioria da população sofre morte celular mediada por mazEF. Essa morte celular pode ser dependente de ROS, onde ROS induz inibição transcricional ou translacional, ou independente de ROS, onde o dano ao DNA desencadeia as vias de morte11.

Este estudo explora os mecanismos pelos quais os CuNPs induzem a morte bacteriana. Em vez de focar apenas no sistema TA, quatro moduladores de PCD, usados anteriormente em nossa pesquisa 7,12, foram empregados para investigar possíveis vias de PCD em bactérias.

Ao examinar os efeitos bactericidas de CuNPs de dois tamanhos diferentes (20 e 60 nm) em concentrações variadas e utilizar métodos como ensaios de colônias, detecção de ROS e moduladores de PCD (SBI, Z-VAD, NSA e Wortmannin), esta pesquisa destaca que o PCD não é exclusivo de organismos multicelulares, mas também ocorre em comunidades bacterianas sob estresse. Ao fornecer protocolos detalhados, este trabalho visa permitir que os pesquisadores avaliem a eficácia do CuNP e os mecanismos bactericidas em seus próprios sistemas. Além disso, essas descobertas avançam na compreensão da PCD bacteriana e apoiam o desenvolvimento de terapias baseadas em CuNP para combater bactérias resistentes a antibióticos.

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Protocolo

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Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de nanopartículas de cobre

  1. Obtenha nanopós de cobre comerciais (25 nm e 60-80 nm) de uma fonte comercial.
  2. Use dodecil sulfato de sódio (SDS) 1,0 mM como dispersante para dois tamanhos de nanopartículas de 1 mg/mL.
  3. Disperse as nanopartículas usando um banho ultrassônico por pelo menos 30 min em temperatura ambiente. As nanopartículas totalmente dispersas estão então prontas para uso em experimentos subsequentes.

2. Preparação de bactérias

  1. Obtenha E. coli (Migula) Castellani e Chalmers cepa 25922 e A. baumannii Bouvet e Grimont da American Type Culture Collection. Obtenha S. aureus do Centro de Pesquisa e Coleta de Biorrecursos.
  2. Cultivar as bactérias em caldo Luria-Bertani (LB) em condições aeróbias a 37 °C.
  3. Diluir as culturas bacterianas em meio LB até obter uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de aproximadamente 0,5.

3. Avaliação da viabilidade celular

  1. Ensaio de colônia
    1. Use soluções de estoque de CuNP (1 mg / mL) para preparar várias concentrações de dois tamanhos de CuNPs, incluindo 0 μg / mL, 1 μg / mL, 5 μg / mL, 10 μg / mL, 50 μg / mL e 100 μg / mL.
    2. Divida as culturas bacterianas preparadas na etapa 2.3 em tubos de microcentrífuga e centrifugue a 3300 × g por 10 min em temperatura ambiente.
    3. Reter os grânulos bacterianos e adicionar diferentes concentrações de dois tamanhos de CuNPs, respectivamente, com pipetagem suave.
    4. Trate os pellets bacterianos com PBS e álcool 70% como controles negativos e positivos, respectivamente.
    5. Incubar todas as bactérias tratadas com agitação a 200 rpm a 37 °C durante 24 h.
    6. Após a incubação, lave todas as bactérias tratadas com PBS e espalhe-as em placas de ágar LB. Colocar as placas numa incubadora a 37 °C durante 24 h.
    7. Conte o número de colônias em cada grupo de tratamento no dia seguinte e faça análises estatísticas. Recomenda-se realizar isso em triplicado para precisão estatística.
  2. Estudo do mecanismo bactericida
    1. Prepare as bactérias conforme descrito na etapa 3.1.2 e trate-as com 5 μM de SBI-0206965 (SBI) por 2 h, 0,5 μM de necrossulfonamida (NSA) por 1 h, 100 nM de wortmannin (Wort) por 30 min ou 100 nM de Z-VAD-FMK (Z-VAD) por 30 min.
    2. Co-trate as bactérias com diferentes concentrações de dois tamanhos de soluções CuNP, conforme descrito na etapa 3.1.1, na presença ou ausência de 5 μM de SBI, 0,5 μM de NSA, 100 nM de mosto e 100 nM de Z-VAD.
    3. Centrifugar as bactérias após tratamentos com moduladores (etapa 3.2.1) e remover os sobrenadantes.
    4. Ressuspender os sedimentos bacterianos em soluções preparadas no passo 3.2.2 e incubá-los com agitação a 200 rpm a 37 °C durante 24 h.
    5. Trate as bactérias com etanol a 70% e PBS como controles positivos e negativos, respectivamente. Use uma solução sem CuNPs como controle em branco de CuNP (0 μg / mL; mock) sob as mesmas condições inibidoras para cada grupo. Incubar todas as amostras por mais 24 horas.
    6. Após a incubação, adicione reagente de viabilidade celular às culturas na proporção de 1:10 em volume. Incubar as culturas durante mais 2 h agitando a 37 °C.
    7. Centrifugar as culturas (passo 3.1.2) após 2 h de incubação. Transferir os sobrenadantes fluorescentes para placas de 96 poços. Meça a fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm com um leitor de microplacas.
    8. Diluir o sobrenadante restante a 10-5 e 10-4 e espalhá-lo em placas de ágar-LB para cultura.
    9. Conte colônias únicas no dia seguinte.

4. Detecção de espécies reativas de oxigênio

  1. Preparar as culturas bacterianas conforme descrito no passo 2.3 e dividi-las em tubos de microcentrífuga.
  2. Trate as bactérias com várias condições de estresse como grupos de controle positivo indutores de ROS (dados não mostrados nos resultados). Os tratamentos são descritos nas etapas 4.2.1 a 4.2.4.
    1. Exponha as bactérias à luz UV de 405 nm por 3 h. Incubar as bactérias a 45 °C durante 2 h.
    2. Em seguida, incubar as bactérias a 4 °C durante 2 h.
    3. Trate as bactérias com 3% H2O2 por 30 min.
    4. Manter as bactérias a 37 °C em caldo LB como controlo negativo.
  3. Prepare várias concentrações de CuNPs conforme descrito na etapa 3.1.1 e trate as bactérias com CuNPs de 20 nm ou 60 nm nas concentrações de 1 μg / mL, 5 μg / mL, 10 μg / mL e 100 μg / mL por 24 h.
  4. Lave as bactérias incubadas duas vezes com PBS para remover quaisquer nanopartículas restantes.
  5. Preparar o corante diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) em PBS a uma concentração final de 5 μM.
  6. Ressuspender os sedimentos bacterianos em 5 μM de H2DCFDA e medir a intensidade de fluorescência a 520/30 nm de emissão utilizando um citómetro de fluxo.
    NOTA: A intensidade da fluorescência verde FL1 se correlaciona com o nível de ROS na cultura tratada. Recomenda-se realizar isso em triplicado para precisão estatística.

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Resultados

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Atividades antimicrobianas de CuNPs de dois tamanhos em três patógenos
Três patógenos oportunistas (E. coli, S. aureus e A. baumannii) foram usados para testar as atividades bactericidas de CuNPs. As bactérias foram tratadas com 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL e 100 μg/mL de CuNPs de 20 nm ou 60 nm, e as atividades bactericidas foram determinadas usando a concentração bactericida mínima (CBM) derivada da contagem de colônias. Nossos resultados mostraram efeitos...

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Discussão

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Este estudo investigou os efeitos antimicrobianos e os mecanismos dos CuNPs em dois tamanhos e várias concentrações contra E. coli, S. aureus e A. baumannii. Utilizando os protocolos estabelecidos, observou-se que os efeitos bactericidas induzidos por CuNP envolvem estresse oxidativo e potencial ativação de PCD. No entanto, a interação entre a homeostase do metal e as respostas ao estresse bacteriano permanece amplamente inexplorada. Estudos anteriores identifi...

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Divulgações

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O autor declara não haver conflito de interesses, financeiros ou outros.

Agradecimentos

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Somos gratos pelo apoio do Core Facility Center, Tzu Chi University, Taiwan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acinetobacter baumannii Cepa Bouvet e Grimont Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC), Manassas, VA, EUA17978Bactérias para experimento de toxocidade CuNP
Bio-Rad iMark Microplate ReaderBio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA168-1130Usado para medir a absorbância em ensaios de viabilidade bacteriana.
diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína permeável por células  (H2DCFDA)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUAD6883 Usadopara detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) em células bacterianas tratadas.
Nanopartículas de cobre (CuNPs) 25 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA774081Usado para preparar solução estoque CuNP
Nanopartículas de cobre (CuNPs) 60-80 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA774103 Usadopara preparar solução estoque CuNP
Escherichia coli (Migula) Castellani e ChalmersAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA25922Bactérias para experimento de toxocidade CuNP
Citômetro de fluxo GalliosBeckman Coulter, Brea, CA, EUAUsado para análise de citometria de fluxo em vários experimentos, incluindo detecção de espécies reativas de oxigênio.
LB agarFocusBio, Miaoli, TaiwanLBA500Usado para cultura de bactérias
Caldo Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA244620Usado para cultura
de bactérias Necrosulfonamida (NSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA480073Usado como modulador para pré-tratamento em estudos de vias de morte bacteriana.
Reagente de viabilidade celular PrestoBlueInvitrogen, Carlsbad, CA, EUAP50200Usado para avaliar a viabilidade celular via fluorescência.
SBI-0206965 (SBI)BioVision, Milpitas, CA, EUA9580Usado como modulador para pré-tratamento em estudos de vias de morte bacteriana.
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAL4509Usado como dispersante para nanopartículas de cobre para reduzir a agregação.
Staphylococcus aureusAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA
Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan		13567Bactérias para experimento de toxocidade CuNP
Leitor de microplacas multimodo Varioskan LUXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAVLBLATGD2Usado para medir a fluorescência em ensaios de viabilidade celular
Wortmannin (Wort)Abcam, MA, EUAab120148Usado como modulador para pré-tratamento em estudos de vias de morte bacteriana.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAV116Usado como modulador para pré-tratamento em estudos de vias de morte bacteriana.

Referências

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