Artigo de método

Isolamento rápido de vesículas extracelulares derivadas do leite materno humano

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DOI:

10.3791/67954

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14 de novembro de 2025

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1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

Neste artigo

Resumo

Este protocolo foi projetado para agilizar e permitir o isolamento eficaz de vesículas extracelulares do leite materno humano com alta pureza.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs), partículas nanométricas de aproximadamente 20-1000 nm de tamanho, estão rapidamente chamando a atenção por seu potencial terapêutico. Especificamente, as vesículas extracelulares derivadas do leite materno humano (HBMDEVs) demonstraram conferir proteção em modelos experimentais de enterocolite necrosante, uma doença intestinal que afeta principalmente bebês prematuros, resultando em mortalidade de até 50%. No entanto, as técnicas tradicionais de isolamento de vesículas extracelulares, como ultracentrifugação diferencial, cromatografia de exclusão de tamanho, etc., são demoradas ou requerem instrumentação especializada, nenhuma das quais é prática no ambiente clínico. Portanto, há a necessidade de um método de isolamento simples que permita a administração reativa rápida de HBMDEVs aos pacientes. A proposta aqui é uma combinação de centrifugação do leite materno humano para remover gordura e detritos celulares, juntamente com a ultrafiltração rápida do leite desnatado restante que produz vesículas extracelulares funcionais e de alto rendimento. O uso dessa técnica pode permitir o uso de HBMDEVs como uma opção terapêutica prática no ambiente clínico.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas onipresentes com aproximadamente 20-1000 nm de tamanho, seja por vias endossômicas (quando os corpos microvesiculares se fundem com a membrana plasmática, o que facilita a liberação de carga celular no espaço extracelular) ou vias da membrana plasmática (ou seja, brotamento). Os EVs contêm carga celular hospedeira, como lipídios, proteínas, ácidos nucléicos, vários metabólitos e outros conteúdos, dependendo de sua fonte. Além disso, os EVs são importantes na comunicação intercelular, angiogênese, imunossupressão, remodelação do microambiente tumoral, progressão do câncer, etc.1,2,3,4. Notavelmente, o leite materno humano (HBM) é rico em EV e facilmente acessível por mães lactantes5. Recentemente, as EVs derivadas do leite materno humano (HBMDEVs) têm chamado a atenção como vetores terapêuticos para o tratamento de doenças 1,2. Recém-nascidos prematuros ou de baixo peso são suscetíveis a várias infecções, incluindo enterocolite necrosante. A enterocolite necrosante, caracterizada por necrose ileal ou colônica, varia de inflamação intestinal leve a falência de múltiplos órgãos sistêmicos, com taxa de mortalidade infantil de até 50%6. O pré-tratamento com EVs derivados do leite materno é suficiente para proteger da inflamação intestinal em modelos experimentais de ECN in vitro e in vivo 2,7. Portanto, a utilização de HBMDEVs pode ser uma opção viável para o tratamento de NEC em ambientes clínicos.

Apesar da promessa terapêutica dos HBMDEVs, existem limitações conhecidas usando as técnicas de isolamento atuais, pois são demoradas ou requerem equipamentos especializados, nenhum dos quais é universalmente prático para o ambiente clínico. O "padrão ouro" do isolamento de EV envolve várias rodadas de ultracentrifugação diferencial, que, embora produza um rendimento satisfatório de EVs, pode afetar sua integridade estrutural e funcionalidade 8,9. Além disso, os tempos de ultracentrifugação podem ser de 2 h no mínimo, um recurso caro no ambiente clínico9. Os kits de isolamento provaram ser economizadores de tempo e um tanto econômicos. No entanto, o isolamento usando esses métodos também resulta em baixos rendimentos e, portanto, baixa escalabilidade. Portanto, há uma necessidade de técnicas de isolamento HBMDEV que economizem tempo e sejam econômicas, sem sacrificar o rendimento do EV.

Este protocolo visa delinear um método passo a passo de isolamento rápido de EVs da HBM usando ferramentas existentes clinicamente disponíveis e aprovadas pela FDA. Para conseguir isso, centrifugação padrão e um sistema de extensão de filtro de grau clínico foram utilizados para isolar EVs de HBM. Essas vesículas estão dentro da faixa de tamanho esperada, exibem morfologia consistente com EVs conhecidas, são enriquecidas para marcadores EV e funcionalmente semelhantes a EVs isoladas usando técnicas tradicionais de isolamento por ultracentrifugação. Assim, este protocolo de isolamento de EV da HBM pode permitir o isolamento prático e rápido e a aplicação de EVs isolados da HBM no ambiente clínico.

Protocolo

O leite materno foi coletado na Unidade de Terapia Intensiva Regional da Universidade do Alabama em Birmingham (UAB). As amostras eliminadas foram coletadas depois que o leite materno foi descongelado para uso da paciente, e a paciente não conseguiu ingerir toda a alimentação. Esses alimentos são normalmente descartados, mas foram coletados para fins de pesquisa. As amostras foram coletadas de indivíduos não identificados e armazenadas a -80 ° C até o momento dos experimentos. A coleção foi aprovada pelo Protocolo do Conselho de Revisão Interna da UAB N160203002. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de vesículas extracelulares (ultracentrifugação diferencial)

  1. Em uma cabine de biossegurança, dilua o leite materno 1:10 em PBS estéril em um tubo cônico de 15 mL.
  2. Centrifugue o leite materno a 300 x g por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, deve haver 3 camadas distintas: gordura do leite (camada superior), soro de leite ou leite desnatado (camada aquosa média) e as células e outros detritos (peletizados na parte inferior). Em uma cabine de biossegurança, filtre a gordura do leite e as camadas de soro de leite através de um filtro de 70 μm (permite uma remoção mais fácil da gordura), deixando o pellet intacto. Transfira o fluxo para um novo tubo.
  3. Centrifugar a amostra a 2600 x g durante 10 min a 4 °C. A gordura residual do leite, as células e os detritos são removidos nesta etapa. Em um gabinete de biossegurança, filtre o sobrenadante através de um filtro de 70 μm. Transferir o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga. Confirme se há pelo menos 10 mL de líquido no tubo antes da ultracentrifugação.
  4. Ultracentrifugar a amostra a 20.000 x g durante 45 min a 4 °C. Após a ultracentrifugação, pode haver três camadas semelhantes à etapa 1.2: gordura do leite, soro de leite ou leite desnatado e células e outros detritos. Em uma cabine de biossegurança, filtre a gordura do leite e as camadas de soro de leite através de um filtro de 70 μm sem perturbar o pellet. Transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 15 ml.
  5. Em uma cabine de biossegurança, a seringa filtra o leite materno com um filtro de 0,22 μm. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga. Confirme se há pelo menos 10 mL de líquido no tubo antes da ultracentrifugação.
  6. Ultracentrifugar a amostra a 110.000 x g durante 70 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de PBS estéril.
  7. Ultracentrifugar novamente a amostra a 110,00 x g durante 70 min a 4 °C.
  8. Em um gabinete de biossegurança, ressuspenda o pellet em 150-200 μL de PBS estéril.

2. Isolamento de vesículas extracelulares (método de filtração rápida)

  1. Em um gabinete de biossegurança, dilua o leite materno (1:10) em PBS estéril.
  2. Centrifugue o leite materno a 300 x g por 10 min a 4 ° C. Após a centrifugação, deve haver três camadas distintas: gordura do leite (camada superior), soro de leite ou leite desnatado (camada aquosa intermediária) e as células e outros detritos (peletizados na parte inferior). Em uma cabine de biossegurança, filtre a gordura do leite e as camadas de soro de leite através de um filtro de 70 μm (permite uma remoção mais fácil da gordura), deixando o pellet intacto. Transfira o fluxo para um novo tubo.
  3. Centrifugue a amostra a 2600 x g por 10 min a 4 ° C. A gordura residual do leite, as células e os detritos são removidos nesta etapa. Em um gabinete de biossegurança, filtre o sobrenadante através de um filtro de 70 μm. Transfira o sobrenadante para um tubo de 15 ml.
  4. Em um gabinete de biossegurança, prepare um conjunto de extensão de filtro de 0,22 μm e 16 polegadas com 5,4 mL de PBS.
    1. Para o sistema primário, pegue 5,4 mL de PBS estéril em uma seringa e lave o sistema até que o PBS saia da outra extremidade do tubo.
  5. Seringa filtre o leite materno através de um conjunto de extensão de filtro de 0,22 μm e 16 polegadas. A gordura residual do leite, as células e os detritos são removidos nesta etapa.
    NOTA: Mais de um conjunto de extensão de filtro pode ser necessário, dependendo da quantidade de detritos presentes na amostra.
  6. Colete o fluxo em um tubo cônico de 15 mL.

3. Análise de rastreamento Nanosight

  1. Diluir a amostra (1:1000) em PBS estéril. Amostras filtradas rapidamente podem ser usadas não diluídas.
  2. Breve vórtice da amostra. Coloque 1 mL da amostra em uma seringa de tuberculina.
  3. Coloque a seringa no aparelho de injeção e prenda a seringa.
  4. Ajuste a bomba injetora para 50. Ligue a câmera para garantir que as partículas visualizadas não sejam muitas ou poucas. Certifique-se de que o fluxo de partículas seja constante, sem saltos ou saltos repentinos no fluxo da amostra.
  5. Defina a bomba injetora para 100. Execute o protocolo.
    NOTA: O software foi configurado para ser lido uma vez a cada minuto para um total de 5 leituras.
  6. Leia o exemplo.
  7. Nivele o Nanosight entre as amostras com PBS.
    NOTA: Um sistema de análise de rastreamento de nanopartículas foi usado para determinar o tamanho e a concentração de partículas por mililitro. A concentração média da amostra ultracentrifugada foi de 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 partículas/mL, enquanto o método de filtração rápida foi de 5,50e+08 +/- 1,16e+08 partículas/mL.

4. Coloração negativa de vesículas extracelulares e microscopia eletrônica de transmissão

NOTA: Amostras com concentração de exossomos na faixa de 108 foram usadas para microscopia eletrônica de transmissão (MET).

  1. Grelhas EM de cobre revestidas com película de carbono por 25 s a 20 mA utilizando o aparelho de descarga.
  2. Carregue 7 μL da solução de suspensão EV na grade e incube por 1 min.
  3. Absorva o excesso com papel de filtro Whatman, absorvendo de baixo da grade para "puxar" a amostra em direção à grade, em vez de para longe dela.
  4. Manchar a amostra imediatamente com 7 μL de solução filtrada de acetato de uranilo (UA) a 1% na superfície da grade EM com pipeta.
  5. Após 15 s, o excesso de solução de UA foi removido da grade entrando em contato com a borda da grade com papel de filtro. Veja a amostra imediatamente (dentro de 24 h) no MET a 80 kv.

5. Concentração de proteína

  1. A acetona precipita 250 μL de EVs purificados (1:4) por 1 h a -20 °C.
    NOTA: Use 100 μL de exossomos purificados para o método de ultracentrifugação.
  2. Centrifugue a amostra a 16.000 x g por 30 min.
  3. Seque o pellet ao ar, seguido de ressuspensão em 100 μL de tampão RIPA.
  4. Siga o protocolo do kit de ensaio de proteína BCA para determinar as concentrações de proteína. A absorbância foi medida a 562 nm usando um leitor de microplacas.
    NOTA: 1 mL de leite materno normalmente produz aproximadamente 1,3 μg/mL de proteína usando ultracentrifugação e aproximadamente 0,2-1 μg/mL de proteína usando filtração rápida.

6. Mancha ocidental

  1. Incube uma amostra de proteína de 1 volume com um marcador de pista de 4 volumes, reduza o tampão da amostra e ferva-a por 7 min a 90 ° C.
  2. Carregue e execute 10 μg de proteína em um gel SDS 10% a 70 V por 15 min. Em seguida, aumente a tensão para 100 V e funcione por mais 90 min.
  3. Transferir o gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o aparelho semi-seco durante 30 min a 15 V.
  4. Lave a membrana 3 vezes com TBS-0,1% Tween (TBS-T) por 10 min cada.
  5. Bloqueie a membrana por 30 min usando a solução Fast Blocking Buffer (diluída a 1x).
  6. Incubar o anticorpo primário (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 e CD9-1:1000) em solução tampão 1x, durante a noite a 4°C em um balancim 10,11,12.
  7. Lave a membrana três vezes por 10 min cada com TBS-T.
  8. Adicione (H + L) anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com HRP, em uma diluição de 1: 1000 para todas as proteínas interrogadas (Hsp70, CD9 e CD63) em 2% de leite em TBS-T e incube por 2 h em temperatura ambiente em um balancim.
  9. Lave a membrana três vezes por 10 min cada com TBS-T.
  10. Revele usando ECL (1:1) e filme com revelador.

7. Cultura in vitro de células IEC-6

  1. Semeie 1,0 x 106 células em um frasco T-25 em 5 mL de meio RPMI completo. Deixe as células aderirem durante a noite.
  2. Remova a mídia completa e lave com 1-2 mL de PBS.
  3. Aspire PBS e adicione 5 mL de RPMI completo sem EV.
  4. Adicione uma concentração final de 400 μM H2O2 por poço e 10 μg/mL de EVs simultaneamente às células durante a noite.
  5. Remova o meio e lave as células com 1-2 mL de PBS.
  6. Aspire o PBS e adicione 1 mL de tripsina.
    1. Coloque as células na incubadora a 37°C por 5 min.
  7. Desative a tripsina adicionando o dobro do volume do RPMI completo. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugue a 125 x g por 5 min.
  8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS.
  9. Conte as células usando um contador de células.

Resultados

Isolamento de EVs usando ultracentrifugação e isolamento rápido
Dogmaticamente, o isolamento EV da HBM envolve centrifugação para remover a gordura do leite e outras partículas grandes, seguida de filtragem, várias rodadas de ultracentrifugação e ressuspensão da amostra enriquecida com EV em PBS. O método de filtração rápida utiliza centrifugação para remover a gordura do leite e os detritos celulares, seguido pela filtração por meio de um filtro de extensão de filtro de 0,22 μm, removendo ainda mais os detritos residuais, o que produz uma amostra enriquecida com EV comparável à ultracentrifugação tradicional (Figura 1).

Caracterização de HBMDEVs do sistema de filtragem rápida de extensão de filtro
A análise de rastreamento Nanosight revelou tamanho de partícula comparável entre HBMDEVs isolados de filtro ultracentrifugado (Figura 2A) e rápido (Figura 2B). Ambos os métodos indicam que os EVs isolados têm um tamanho médio de aproximadamente 100 nm. Os EVs carregam várias cargas (ou seja, proteínas, lipídios, miRNAs, etc.) para secreção das células hospedeiras para seus vários alvos. Portanto, a primeira proteína-alvo examinada foi a proteína de choque térmico 70 (Hsp70), uma proteína conhecida por ser transportada via EVs13. A análise de Western blot mostra que os EVs isolados usando filtração rápida mostraram expressão comparável de Hsp70, como aqueles isolados usando ultracentrifugação ( Figura 3A e Figura Suplementar 1A ). Além disso, os EVs podem ser identificados por meio da expressão superficial de tetraspaninas, como CD9 e CD6314. A análise de Western blot revelou que os EVs isolados por filtração rápida realmente expressam CD9 (Figura 3B e Figura Suplementar 2B) e CD63 (Figura 3C e Figura Suplementar 3C). Por fim, a análise morfológica de HBMDEVs via microscopia eletrônica de transmissão revelou morfologia de vesícula semelhante entre as duas técnicas de isolamento (Figura 4A-D).

Vários laboratórios mostraram que os EVs conferem propriedades protetoras que promovem a sobrevivência celular durante o estresse celular 2,3,7. Semelhante aos relatórios publicados anteriormente, os EVs isolados usando o método de filtração rápida são capazes de proteger as células epiteliais intestinais (IEC-6) da morte celular induzida por peróxido de hidrogênio2 (Figura 5A, B). Esses dados sugerem que os HBMDEVs isolados usando o método de filtração rápida não apenas possuem qualidades comparativas com aqueles isolados usando ultracentrifugação diferencial, mas também são funcionalmente semelhantes.

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Figura 1: Esquema delineando as diferenças entre os métodos de ultracentrifugação e filtração rápida do isolamento de EVs do leite materno humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Análise de rastreamento Nanosight de EVs isolados de leite materno humano usando ultracentrifugação e método de filtração rápida. (A) NTA de EVs de leite materno humano (diluído 1:1000 em 1x PBS) isolado usando ultracentrifugação. Os dados mostrados são uma representação única de 3-4 ensaios independentes. (B) NTA de EVs de leite materno humano isolados usando filtração rápida. Os dados mostrados são uma representação única de 3-4 ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Análise de Western blot de EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. (A) Exposição de um segundo de 10 μg de proteína de choque térmico 70 (Hsp70). "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras obtidas por filtração rápida foram posteriormente concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. A imagem mostrada representa um dos quatro ensaios independentes. (B) Vigésima segunda exposição de 10 μg de CD9. "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras de filtração rápida foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. A imagem mostrada representa um dos quatro ensaios independentes. (C) Vigésima segunda exposição de 10 μg de CD63. "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras de filtração rápida foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. A imagem mostrada representa um dos quatro ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise de microscopia eletrônica de transmissão de EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. (A) Micrografia eletrônica de EVs isolados usando ultracentrifugação com ampliação de 8.000×. Barra de escala = 800 nm. A imagem mostrada representa um dos três ensaios independentes. (B) Micrografia eletrônica de EVs isoladas usando ultracentrifugação com ampliação de 20.000×. Barra de escala = 200 nm. A imagem mostrada representa um dos três ensaios independentes. (C) Micrografia eletrônica de EVs isoladas usando filtração rápida com ampliação de 8.000×. Barra de escala = 800 nm. As EVs foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. A imagem mostrada representa um dos três ensaios independentes. (D) Micrografia eletrônica de EVs isolados usando filtração rápida com ampliação de 20.000×. Barra de escala = 200 nm. As EVs foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. A imagem mostrada representa um dos três ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Análise funcional de EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. (A) Viabilidade celular de células IEC-6 cultivadas em meio RPMI-1640 completo livre de EV. As células foram tratadas durante a noite com 400 μM H2O2 e 10 μg/mL de EVs simultaneamente. Os dados mostrados representam um dos dois ensaios independentes. (B) Contagem de células IEC-6 cultivadas em meio RPMI-1640 completo sem EV. As células foram tratadas durante a noite com 400 μM H2O2 e 10 μg/mL de EVs simultaneamente. Os dados mostrados representam um dos dois ensaios independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Caracterização de Western blot de Hsp70 em EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. Exposição de um segundo de 10 μg de proteína de choque térmico 70 (Hsp70). "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras de filtração rápida foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. Cada amostra representa uma única réplica biológica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Caracterização de Western blot de CD9 em EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. Exposição de cinco minutos de 10 μg de CD9. "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras de filtração rápida foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. Cada amostra representa uma única réplica biológica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Caracterização de Western blot de CD63 em EVs isolados usando ultracentrifugação e filtração rápida. Exposição de dez minutos de 10 μg de CD63. "L" denota escada, "U" denota ultracentrifugação e "R" denota filtração rápida. As amostras de filtração rápida foram concentradas por centrifugação a 110.000 × g por 70 min, realizada duas vezes. Cada amostra representa uma única réplica biológica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As EVs estão chamando a atenção, pois a literatura sugere que elas podem regular vários mecanismos inflamatórios e podem oferecer benefícios protetores 2,7. No entanto, uma limitação do uso prático de EVs em ambientes clínicos é o tempo necessário para isolar EVs e extrair um rendimento suficiente 8,15. Aqui, foi delineado um protocolo passo a passo para isolamento rápido e eficiente de EVs da HBM usando um sistema de filtragem aprovado pela FDA. A utilidade desse método reduz os métodos tradicionais de isolamento de EV pela metade sem sacrificar o rendimento. Portanto, este protocolo pode permitir a aplicação terapêutica prática de EVs derivados do leite materno humano em um ambiente clínico, caso a terapia EV seja aprovada em um futuro previsível.

Os protocolos de isolamento de EV existentes demonstraram rendimento consistente e eficaz de EVs de seu fluido de origem. No entanto, os meios tradicionais de isolamento, seja o padrão-ouro, a ultracentrifugação diferencial ou o uso de kits comerciais, não são isentos de limitações. O isolamento de EVs por ultracentrifugação diferencial, embora eficaz, é demorado com protocolos que envolvem tempos de rotação combinados de no mínimo ~ 3 h 2,8,15. O tempo de isolamento combinado com protocolos para quantificar adequadamente os números de EV tornaria seu uso sob restrições de tempo em um ambiente clínico desafiador. Além disso, os kits comerciais, embora eficazes, são caros. Além disso, o número de amostras que podem ser processadas por kit é baixo, dado o alto custo desses kits 8,15.

Este protocolo oferece uma solução para essas limitações que economiza tempo e dinheiro sem sacrificar o rendimento ou a pureza do EV. Para que este protocolo seja eficaz, existem etapas importantes que devem ser seguidas ao realizar o protocolo. A diluição e centrifugação inicial do leite materno humano são necessárias para a remoção de detritos extracelulares e gordura do leite da amostra de leite. A remoção desses detritos é fundamental para evitar o entupimento do sistema de extensão do filtro e, assim, evitar o uso de vários filtros para uma amostra. Além disso, lavar o sistema de extensão do filtro com PBS é fundamental, pois prepara o filtro em preparação para a amostra. A preparação ajuda a garantir que a amostra não seja perdida durante o processo de preparação. Deve-se notar que, dependendo do conteúdo da amostra de leite materno, pode ser necessário mais de um conjunto de extensão de filtro, independentemente da diluição e centrifugação da amostra antes da filtração. Caso isso ocorra, mais de um filtro pode ser usado; no entanto, o novo conjunto de extensão de filtro precisa ser preparado antes da filtração da amostra.

Este protocolo é eficaz e consistente no isolamento de EVs do leite materno humano, no entanto, existem algumas limitações a serem consideradas. As etapas da centrífuga (~ 20 min de tempo total entre as duas rotações) antes da filtração da amostra são necessárias. As tentativas de filtrar a amostra diluída sem centrifugação levarão ao entupimento repetido do sistema de extensão do filtro, perda de amostra e adicionarão tempo adicional ao protocolo de isolamento EV. Além disso, a amostra não era pura, como evidenciado pela análise NTA e TEM. As tentativas de usar amostras que não foram centrifugadas antes da filtração podem introduzir contaminantes indesejados na amostra, o que pode produzir efeitos fora do alvo, dependendo da futura aplicação a jusante de EVs isolados. Além disso, este protocolo só foi implementado no que diz respeito ao isolamento de EVs do leite materno humano. Portanto, a eficácia deste protocolo no isolamento de EVs de outros fluidos não foi investigada. Dada a natureza aquosa de todos os fluidos corporais, não se prevê que haja diferenças na pureza e no rendimento dos EVs se este protocolo for usado para isolar EVs de outras fontes.

Deve-se notar também que este protocolo é eficiente no isolamento de pequenas vesículas extracelulares (sEV). De acordo com a NTA, os EVs derivados de HBM tinham ~ 100 nm de tamanho, sugerindo que EVs maiores não estavam presentes na amostra. A razão é que as amostras foram filtradas usando um filtro de 0,22 μm, que é usado principalmente para o isolamento de exossomos e outros EVs menores, um foco principal do laboratório no momento deste estudo. Em teoria, a utilização de um filtro com tamanhos de poros maiores pode permitir o isolamento de EVs maiores. No entanto, essas questões estão além do escopo do presente estudo.

Os EVs derivados do leite materno humano representam uma fonte terapêutica natural que é facilmente acessível para uso clínico. Uma limitação para trazer o trabalho de EV para o ambiente clínico é isolar EVs em um método prático que qualquer instalação poderia usar. Este protocolo foi projetado para superar essa limitação e pode ser facilmente aplicado no ambiente hospitalar e implementado usando um sistema de filtragem de nível hospitalar existente, aprovado pela FDA, disponível comercialmente ou pode ser adquirido por muito menos do que a ultracentrífuga padrão. Este método é econômico e produz uma amostra pura e rica em EV a partir de um sistema de filtragem que já é usado no ambiente clínico.

Divulgações

O(s) autor(es) declara(m) não ter potenciais conflitos de interesse com relação à pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo.

Agradecimentos

Imagens e figuras foram geradas usando biorender.com. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo UAB High Resolution Imaging Facility. Este trabalho foi apoiado pelo NIH / NICHD 5R21HD104481.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(H+L) Anti-mouse conjugado com HRPBio-Rad1721011
(H+L) Anti-coelho conjugado com HRPBio-Rad1706515
Filtro de seringa 0,20Fisherbrand09-719C
Filtro de célula μm 0,70Corning431751
Tris HCL de 1,5 mFabricado internamente
Tubos de 15 mLFalcon352096
Conjunto de extensão de filtro de 16 polegadasB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Tubos de 50 mLFalcon353070
Buffer de Amostra Reduzida 5xTermo Científica39000
AcilamidaFisher Scientifc BP1410-1
Anfotericina BGibco15290-018
Câmera AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSTermo Científica17874
Kit de Ensaio de Proteína BCAPierce23227
Tubos BeckmanBeckman coulter 344059
BrightStar ECL QuimioluminescenteAlkali ScientificXR92
FBS Exossomo EsgotadoFisher ScientificNC0464480
Buffer de Bloqueio RápidoPierce37575
Soro Fetal BovinoTecnologias de Vida10082147
Hsp70InvitrogenMA3-006
Insulina humanaSigma-AldrichI9278-5ML
Peróxido de hidrogénioFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Buffer de amostra que reduz marcadores de faixaTermo Científica39000
Leite em póBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Membrana de nitroceluloseTecnologias de vida88018
Aparelho de descarga PELCO easiGlowTed Pella
Mini comprimidos inibidores de proteasePierceA32955
Buffer RIPAPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
Frasco T-25Termo Científica156367
TBSFabricado internamente
TEMEDBio-Rad161-0801
Tripsina EDTAGibso25200-056
Tween 20Termo CientíficaJ20605-AP

Referências

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