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Um ensaio de Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos de 50% em Tempo Real, Otimizado e Sem Marcação, usando Impedância para Quantificação Automatizada de Títulos Virais

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DOI:

10.3791/67956

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9 de janeiro de 2026

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1Agilent Technologies, Inc.

Neste artigo

Resumo

O ensaio TCID50 relatado aqui utiliza medições de impedância em tempo real sem rótulo e o módulo de Virologia do sistema para monitorar objetivamente os efeitos citopáticos (CPE) induzidos pelo vírus em tempo real. Esse ensaio simplificado reduz significativamente o tempo de atuação prática, ao mesmo tempo em que suporta medições de CPE cinética quantitativa de alto rendimento e possibilita cálculos automatizados e em tempo real do TCID50.

Resumo

Medir o título viral, a concentração de um vírus em uma amostra, é um procedimento fundamental na pesquisa virológica. Embora essenciais, métodos tradicionais como o ensaio de placas e o ensaio TCID50 podem ser demorados, exigem coloração ou marcação de reagentes e frequentemente envolvem interpretação subjetiva, especialmente quando os efeitos citopáticos (ECP) são sutis ou difíceis de quantificar por meio de imagem. Por exemplo, ensaios TCID50 podem empregar corantes de viabilidade como MTT ou MTS, enquanto ensaios de placas dependem de imagens e coloração para visualizar placas virais, ambos podendo introduzir variabilidade. Além disso, esses métodos tradicionais oferecem apenas um retrato estático da infectividade viral, limitando a capacidade de capturar as interações dinâmicas entre vírus e células permissivas. Para superar as limitações atuais na medição do título do vírus, foi desenvolvido um ensaio TCID50 simplificado usando tecnologia baseada em impedância para medir o CPE de forma objetiva, não invasiva e em tempo real, eliminando a necessidade de rótulos. Neste estudo, dois modelos celulares permissivos por vírus foram usados para validar o ensaio de impedância-TCID50: o adenovírus marcado com GFP (Adv-GFP) em células HEK293A e o vírus da influenza A (IAV) em células MDCK. O fluxo de trabalho é simples, abrangendo semeadura celular, inoculação contra vírus, monitoramento em tempo real e análise automática do TCID50 pelo software. Durante toda a infecção, os valores do TCID50 foram calculados automaticamente pelo software do sistema usando a fórmula Reed-Muench em todos os momentos registrados. Os valores TCID50 de IAV obtidos por meio de leituras de impedância eram comparáveis aos gerados pelo ensaio convencional TCID50 baseado em coloração violeta cristalina. Esses resultados demonstram que a quantificação do vírus pode ser realizada de forma precisa e eficiente usando a medição de impedância em combinação com o Módulo de Virologia do software do sistema. O novo ensaio simplifica métodos tradicionais ao mesmo tempo em que oferece uma compreensão aprimorada da dinâmica viral, apoiando assim pesquisas virológicas avançadas e ampliando as potenciais aplicações clínicas.

Introdução

À medida que a pesquisa virológica evolui rapidamente, a quantificação precisa da infectividade viral continua sendo crucial para entender os mecanismos virais, desenvolver terapias antivirais e avaliar a eficácia da vacina. Um dos procedimentos mais importantes é medir o título viral, a concentração de partículas virais em uma amostra. O ensaio TCID50, que quantifica o número de partículas virais infecciosas necessárias para produzir CPE em 50% das células inoculadas, é um dos métodos mais comumente usados para determinar o título viral funcional. Este ensaio de desfecho amplamente utilizado é especialmente valioso para vírus que não formam placas e pode servir como alternativa ao ensaiode placas 1.

Em geral, o ensaio TCID50 leva de 2 a 14 dias, dependendo do vírus e das células permissivas. O CPE, incluindo alterações na proliferação celular, morfologia e viabilidade, é avaliado por meio de (1) medição colorimétrica após a adição de reagentes, como o ensaio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio) e o ensaio MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium), usando um leitorde placas 2, ou (2) avaliação visual de alterações morfológicas ou relacionadas à cultura usando plataformas de imagem óptica — por exemplo, avaliar a CPE medindo a confluênciapercentual 3, ou (3) a detecção visual da CPE por coloração violeta cristalina após a fixação de poços tratados com vírus com formalina ou paraformaldeído (PFA). A taxa positiva de infecção viral derivada do número de replicações CPE-positivas a cada diluição viral é a base para o cálculo do TCID50. A diluição na qual 50% das culturas apresentam CPE é calculada estatisticamente usando fórmulasestabelecidas 4, como Reed-Muench, Spearman-Karber e Improved-Karber, e o resultado é reportado como TCID50 por mililitro (TCID50/mL).

Ensaios tradicionais de TCID50 e placas são amplamente reconhecidos como o padrão ouro para quantificação viral funcional e podem fornecer insights valiosos. No entanto, esses ensaios costumam ser tediosos, demorados e exigem coloração manual para visualizar a EPC, resultando em baixo rendimento, aumento do risco de erro humano e subjetividade. Para vírus altamente infecciosos ou letais, minimizar o tempo de exposição aos vírus e reduzir resíduos que contêm vírus por etapas adicionais, como a coloração, são considerações importantes para melhorar a biossegurança. Exceto pelo ensaio TCID50 baseado em imagem sem rótulos, a maioria dos ensaios TCID50 e de placas também são ensaios de ponto final, o que pode resultar em um momento subótimo para avaliação de títulos e limitar a capacidade de observar as interações dinâmicas entre vírus e células hospedeiras. Para superar essas limitações, foi desenvolvido e estabelecido um ensaio TCID50 simplificado, sem rótulos e em tempo real. Embora conceitualmente semelhante ao ensaio convencional TCID50, o novo método utiliza leituras de impedância celular, capturadas e analisadas pelo sistema MP RTCA, para monitorar a infecção de forma objetiva e contínua ao longo do tempo.

Foi demonstrado e verificado que a biosensação baseada em impedância fornece uma leitura composta qualitativa e quantitativa do número celular, morfologia e força de fixação célula-substrato de forma não invasivae sem marcação 5,6. Estudos anteriores demonstraram que a CPE induzida por vírus pode ser quantificada com precisão em tempo real usando as medições de impedância RTCA 7,8,9. Em vez de reportar valores brutos de impedância, os sistemas utilizam um parâmetro sem unidade chamado Índice de Células (CI) para refletir mudanças na impedância devido a eventos celulares. Por exemplo, à medida que as células aderem, se espalham e crescem no fundo do poço, o IC aumenta. Por outro lado, quando as células morrem, encolhem ou se descolam, como durante uma infecção viral, o IC diminui.

Considerando os relatos promissores que usam impedância para medir CPE, este estudo buscou demonstrar que o ensaio TCID50 baseado em impedância é uma alternativa confiável e precisa à quantificação viral convencional. O módulo de Virologia do software do sistema permite o cálculo automatizado do TCID50 durante toda a medição em tempo real do CPE, simplificando e encurtando o processo de ensaio enquanto fornece insights valiosos sobre a cinética da replicação viral e sua interação com células permissivas.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ensaio TCID50 baseado em impedância

NOTA: Como ilustra a Figura 1 , um ensaio TCID50 baseado em impedância consiste em quatro etapas, incluindo semeadura permissiva de células em uma placa biossensorial, preparação e inoculação por diluição do vírus, medição de CPE no sistema e, por fim, análise de dados e cálculo do TCID50 usando o módulo de Virologia do software do sistema.

  1. Preparação do ensaio: reviver e subcultivar células permissivas
    NOTA: Esta etapa precisa ser realizada uma semana antes do ensaio. Para minimizar variações entre experimentos, é altamente recomendado que um banco de células permissivas no mesmo número de passagem seja preparado para uso no ensaio. Não use células com mais de 15 passagens após a compra pelo provedor de celular.
    1. Degelo criopreservado células permissivas
      1. Meio de crescimento celular quente em banho-maria a 37 °C por pelo menos 30 minutos. Por exemplo, o Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina, foi usado para HEK293A cultura.
      2. Descongelar um frasco de células do banco de células criopreservado para ensaios TCID50 girando suavemente em um banho-maria a 37 °C por 1-2 minutos até que alguns cristais de gelo estejam presentes; Não submerga a tampa. Limpe o frasco com etanol 70% e coloque em um capuz laminar.
      3. Transfira suavemente as células para um novo tubo cônico de 50 mL e adicione 9 mL de meio de crescimento aquecido às células.
      4. Centrifuge a suspensão da célula a 300 x g por 4 minutos em temperatura ambiente.
      5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mL de meio de crescimento aquecido. Transfira para um novo frasco T75.
      6. Cultive células até 80%-90% de confluência em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
    2. Subcultura de células permissivas.
      1. Monitore as células até que atinjam 80%-90% de confluência.
      2. Remova o meio contendo soro do frasco e enxágue suavemente a monocamada celular uma vez com a solução fisiológica fosfatada (DPBS) de Dulbecco sem Mg e Ca.
      3. Tripsinize as células distribuindo uniformemente 2 mL de solução 0,05% de Tripsina/EDTA por frasco T75 e deixando o frasco em uma incubadora a 37 °C por 1 a 3 minutos.
        NOTA: Não tripsinize excessivamente as células, pois isso pode ser prejudicial às células.
      4. Pare a tripsinização adicionando 8 mL de meio contendo soro para diluir o volume original de tripsina pelo menos cinco vezes. Transfira 2,5 mL da suspensão da célula para um novo frasco T75, depois adicione 8 mL de meio de cultura.
        NOTA: Evite usar células permissivas recém-descongeladas para o ensaio TCID50. Em vez disso, use células cultivadas com confluência de 80%-90%. Para reduzir a variabilidade interexperimental, as células revividas devem ser mantidas por no máximo duas semanas após o descongelamento. Para garantir alta viabilidade e proliferação celular durante a cultura de duas semanas: (1) trocar o meio de crescimento pelo menos duas vezes por semana; (2) células de subcultura quando atingem 80%-90% de confluência. Para manutenção prolongada além de duas semanas, é necessária validação.
  2. Título viral
    NOTA: Esta etapa precisa ser realizada no Dia 1.
    1. Medição do fundo da placa de biossensor
      1. Transfira cuidadosamente 50 μL de meio pré-aquecido para cada poço usando uma pipeta multicanal, utilizando a técnica de pipeteamento reverso para minimizar a formação de bolhas e garantir uma distribuição consistente em volume.
      2. Coloque a placa na Estação de placas; abrir o software do sistema e selecionar o módulo de Virologia antes de iniciar o experimento. Insira quaisquer notas relevantes na aba Notas de Expansão e insira as informações das células, incluindo nome e número da célula, na subaba Célula da aba Layout após selecionar os poços correspondentes. Alternativamente, as informações da célula podem ser inseridas após a semeadura.
        NOTA: A medição de fundo da placa deve ser feita antes de adicionar células aos poços da placa. As leituras de fundo para todos os poços devem indicar entre -0,063 e 0,063.
      3. Na aba Agenda, clique no botão Adicionar um Passo para adicionar o Passo 1, que é designado para medição do fundo da placa. Depois, inicie a gravação clicando no botão Iniciar .
      4. Remova a placa da Estação e a coloque de volta no capuz para semeadura das células.
    2. Semeadura permissiva de células para a placa biossensorial de 96 poços
      1. Tripsinize as células permissivas do frasco T75.
      2. Conte as células e ajuste a suspensão celular para a concentração desejada. Neste estudo, a concentração de HEK293A foi de 60.000 células/mL.
      3. Adicione 100 μL de suspensão de célula a cada poço da placa.
        NOTA: A densidade celular adequada é essencial. Densidade de semeadura subótima pode resultar em um artefato experimental. Portanto, a densidade de seed precisa ser otimizada antes de realizar um ensaio TCID50.
      4. Deixe a placa na capela em temperatura ambiente por 30 minutos após a adição da célula, permitindo que as células se distribuam uniformemente no fundo do poço.
        NOTA: A falha em realizar essa etapa pode resultar em grandes variações de poço a poço.
      5. Coloque a placa na placa Estação dentro de uma incubadora a 37 °C com 5% deCO2.
      6. Navegue até a aba Agendamento do software e adicione o Passo 2 usando as configurações padrão de gravação: 100 Varreduras e um Intervalo de 15 minutos. Isso iniciará o monitoramento de impedância/IC a cada 15 minutos, permitindo avaliação em tempo real da fixação e proliferação celular como uma etapa de controle de qualidade celular (QC) antes da inoculação do vírus.
        NOTA: Dia 2 - Para maximizar a reprodutibilidade e consistência do ensaio entre os experimentos, é fundamental avaliar o desempenho das células no sistema antes de avançar para a próxima etapa. Como o IC reflete a ligação e o crescimento celular, os valores de IC durante o período de 20-28 horas após a semeadura servem como um parâmetro chave de controle de qualidade. Tanto o valor quanto a cinética do IC são específicos de cada célula. Neste estudo, para HEK293A células semeadas a 6.000 células por poço e cultivadas por 20-28 horas, o IC deve exceder 2. Se o IC não atingir 2 dentro de 20-28 horas após a semeadura, a cultura celular HEK293A é considerada que não passou no controle de qualidade (QC), e o ensaio TCID50 subsequente não será realizado. Esse critério garante alta reprodutibilidade dos resultados experimentais.
    3. Preparação de diluições seriadas virais
      1. Calcule o volume total do meio (DMEM + 2% FBS + 1% penicilina / estreptomicina) necessário para preparar as diluições e aqueça em um banho-maria a 37 °C por 30 minutos. O meio será usado pelo restante do experimento.
      2. Descongele rapidamente um frasco de estoque de vírus aliquotado em um banho-maria a 37 °C por 1-2 minutos até que todos os cristais de gelo derretassem.
      3. Prepare vírus 10 vezes diluídos em série transferindo 20 μL do estoque viral para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL contendo 180 μL de meio pré-aquecido em cada etapa. Pipete para cima e para baixo para garantir uma mistura completa do meio e do vírus.
        NOTA: Não submerga a ponta da pipeta muito profundamente na solução viral para evitar que resíduos excessivos de partículas virais sejam transportadas para fora da ponta, o que pode resultar em diluições imprecisas.
      4. Para evitar flutuações nas leituras de impedância causadas pela adição de amostras do vírus do resfriado, equilibre as diluições virais incubando-as na incubadora a 37 °C com 5% deCO2 por 20 minutos antes da inoculação.
    4. Insira as informações sobre tratamento contra vírus na aba Layout
      1. Na aba de Layout da placa do software; selecionar os poços para o tratamento com título viral; clique na subaba Tratamento e insira a diluição inicial, por exemplo, 0,001 (10-3) neste experimento; entra 10 como o "Fator de Diluição"; selecione a direção de diluição, da esquerda para a direita nesse caso. A diluição viral será calculada automaticamente com base na entrada do layout da placa e exibida em cada poço correspondente.
      2. Em seguida, insira o Volume de Inoculação do vírus e clique no botão Aplicar para salvar todas as informações do tratamento. Essa etapa é essencial para calcular com precisão o TCID50/mL durante a análise de dados.
      3. Atribua os poços que não serão tratados com vírus como controles negativos selecionando os poços apropriados e depois marcando Ctrl Negativo em Tipo de Poço na aba Tratamento .
        NOTA: Poços de controle negativo devem ser designados e adicionados à página de Layout; A omissão impedirá o cálculo do TCID50.
    5. Inoculação viral
      1. Quando estiver pronto, pressione o botão Pausar no software para impedir a aquisição de dados. Remova a placa da Estação e coloque-a na cauz laminar.
      2. Remova cuidadosamente o meio de cultura dos poços da placa usando uma pipeta multicanal.
      3. Adicione suavemente 50 μL de diluição viral usando uma pipeta multicanal no topo da monocamada celular, evitando a interrupção da cultura celular.
      4. Coloque a placa de volta na Estação e adicione o Passo 3 usando as configurações padrão de gravação (100 varreduras e um intervalo de 15 minutos) na aba Agendamento para retomar a impedância de gravação a cada 15 minutos por 2 horas, permitindo que o vírus se ligue às células.
      5. Após 2 horas de inoculação viral, pause a gravação e remova a placa da Estação para o capuz laminar.
      6. Adicione lentamente 150 μL de meio pré-aquecido nos poços usando uma pipeta multicanal, evitando a ruptura da monocamada da célula; devolva a placa para a Estação.
      7. Retome o Passo 3 clicando em Iniciar na aba Agenda . Os sinais de impedância são medidos continuamente a cada 15 minutos durante todo o período de inoculação.
    6. Cálculo do TCID50 durante ou após a conclusão do ensaio TCID50
      1. Na aba de Análise de Dados , selecione e adicione todos os poços usados no ensaio ao gráfico gráfico. O eixo y do gráfico é determinado pela opção selecionada no menu suspenso do eixo Y .
      2. Navegue até a seção de Parâmetros . Selecione TCID50 na lista suspensa de parâmetros para iniciar o cálculo do TCID50.
      3. Escolha o Gráfico de Barras para cálculo do TCID50 em um ponto de tempo específico ou selecione o TCID50 Dependente do Tempo para gerar o curso temporal do TCID50 durante um período desejado durante a inoculação. O TCID50/mL será calculado e exibido após clicar no botão de execução.

2. Ensaio Crystal Violet-TCID50

  1. Semente células permissivas em uma microplaca de 96 poços na densidade ótima de semeadura descrita no ensaio TCID50 baseado em impedância (etapas 1-2).
  2. Realize a preparação e inoculação por diluição serial do vírus conforme especificado no ensaio TCID50 baseado em impedância.
  3. Fixação e coloração
    1. Após a conclusão do ensaio, descarte suavemente o sobrenadante de cada poço e adicione 100 μL de formaldeído a 4% para fixar as células.
    2. Incube a 4 °C por 1 hora, depois retire o fixador.
    3. Tinga as células fixas com 0,5% de Violeta Cristalino preparada em PBS. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos.
    4. Lave a placa com água da torneira até que o fundo seja limpo. Deixe o prato secar completamente ao ar antes de marcar.
      NOTA: Resíduos de violeta cristalino são considerados perigosos tanto pela RCRA quanto pelo Código de Regulamentação da Califórnia (CCR 66261.24). Recolha todas as soluções cristalinas usadas, materiais contaminados (por exemplo, papel toalha, luvas) e enxágue os resíduos em um recipiente designado para resíduos perigosos. Descarte os resíduos por meio do órgão de Saúde e Segurança Ambiental (EH&S) da sua instituição ou de um contratado licenciado para descarte de resíduos perigosos.
  4. Pontuação e cálculo TCID50
    1. Inspecione visualmente cada poço para CPE. Um poço positivo mostra destruição parcial ou completa de uma monocamada e coloração mais leve. Um poço negativo mantém uma monocamada intacta com manchas roxas escuras.
    2. Conte o número de poços positivos e negativos para cada diluição.
    3. Calcule manualmente o TCID50/mL usando o método Reed-Muench, com base em um volume de inoculação de 150 μL.

Resultados

Monitoramento dinâmico, em tempo real e sem rótulo do CPE mediado por vírus usando impedância
Para confirmar que a CPE induzida pelo vírus pode ser medida de forma confiável e quantitativa pela impedância, primeiro registramos as mudanças celulares em células HEK293A após a infecção por Adv-GFP usando um sistema RTCA eSight que simultaneamente mede a impedância e captura imagens de células vivas da mesma população celular, fornecendo informações perspicazes sobre o comportamento celular. HEK293A células foram semeadas em uma placa biossensorial de 96 poços com uma densidade de semeadura de 6.000 células/poço por 24 horas e depois infectadas com Adv-GFP em 10,4 IFU/mL. Impedância e imagens de células vivas foram registradas para 250 horas após a inoculação (Figura 2A). Para minimizar a variabilidade causada por diferenças na semeadura celular e revelar mudanças relativas após o tratamento, o Índice Celular Normalizado (NCI) foi usado para representar as mudanças coletivas no crescimento, fixação e viabilidade celular ao longo do tempo. O NCI é calculado dividindo o IC em um determinado ponto temporal pelo seu IC no momento de normalização (o tempo antes da inoculação). O traço cinético do NCI do controle não infectado (Figura 2A, traço preto) mostra um aumento gradual nas primeiras 48 horas, indicando proliferação celular contínua. Em seguida, há um platô ao final do teste, indicando que as células haviam se tornado confluentes e cobriam toda a área superficial dos biossensores de ouro. Em contraste, a cinética dos NCI dos poços infectados pelo vírus caiu abaixo do controle 50 horas após a inoculação e diminuiu progressivamente até atingir zero às 100 horas.

Imagens de células vivas adquiridas da mesma população celular confirmaram visualmente que o sinal de impedância reflete de forma confiável a condição física das células permissivas à medida que avançam por todo o contínuo CPE. Como mostrado na Figura 2A, há uma correlação inversa entre o NCI e a expressão de GFP viral em células HEK293A infectadas observada nas primeiras 100 horas antes da lise completa das células permissivas. Além disso, as imagens de células vivas (Figura 2B) registradas nos pontos de tempo especificados demonstram ainda mais um status celular permissivo durante a infecção viral. O crescimento celular persistiu nas primeiras 48 horas após a infecção, enquanto as partículas virais permaneceram em níveis baixos dentro das células. No entanto, à medida que a replicação e infecção do vírus avançavam, começou a morte celular, evidenciada pela redução da confluência e pelo aumento do sinal de GFP nas células hospedeiras. Aproximadamente 100 horas após a inoculação, a expressão viral de GFP começou a diminuir devido à perda significativa de células permissivas viáveis. Essa abordagem integrada reforça a confiabilidade da detecção de CPE induzida por vírus por impedância, estabelecendo uma base sólida para o ensaio TCID50 baseado em impedância.

Cálculo automatizado do TCID50 derivado da leitura de impedância
Identificar com precisão os poços positivos de CPE é crucial para o cálculo confiável do TCID50. Para avaliar se o ensaio TCID50 baseado em impedância pode diferenciar de forma precisa e objetiva entre CPE positiva e negativa com o suporte do módulo de Virologia do software do sistema, as células HEK293A foram semeadas a 6.000 células/poço durante 24 horas antes da inoculação e tratadas com uma série de diluições dez vezes maiores de Adv-GFP, usando oito replicados (poços) para cada diluição. O CPE induzido por Adv foi gravado em tempo real no sistema RTCA. Na Figura 3A, traços cinéticos de impedância, apresentados como NCI, foram registrados e automaticamente plotados ao longo do experimento. A diminuição do NCI após a inoculação revela uma CPE claramente dependente da dose, demonstrada pela forte correlação entre a quantidade de vírus adicionada e a taxa de diminuição do sinal de impedância. As células expostas a altas cargas virais, entre diluição de 10-3 a 10-7 , apresentaram quedas acentuadas e consistentes no NCI, refletindo CPE robusta e uniforme em poços replicados. Em contraste, em uma diluição de vírus 10-8 , o traço cinético apresentou grande variabilidade desde o início, resultando em desvios padrão do NCI significativamente maiores, especialmente após 100 horas após a inoculação. Quando a carga viral foi ainda mais reduzida abaixo do limiar necessário para causar infecção, nesse caso, uma diluição 10-10 , o NCI tornou-se indistinguível dos controles negativos. Esses dados sugerem que, em uma diluição de 10-8 , 1) o vírus não conseguiu induzir CPE em todos os poços repetidos com cinética semelhante; 2) essa diluição seria uma linha divisória entre as concentrações que causam CPE em todas as repetições e aquelas que induzem CPE apenas em algumas ou nenhuma das réplicas; Esse resultado binário, infectado (indicado por mudanças de IC induzidas pela CPE) ou não infectado (sem mudança de CI), forma a base para calcular o TCID50 usando métodos estatísticos no software do sistema. Portanto, a profunda variação no NCI observada em certas concentrações virais é um indicador fundamental para a ocorrência de infecção parcial e pode ser crucial para a extrapolação necessária para calcular o TCID50.

Assim como no ensaio clássico TCID50, o limiar para CPE positivo deve ser definido antes que o software embutido possa identificar automaticamente os poços positivos para CPE. Como diferentes vírus e modelos celulares permissivos podem exigir limiares distintos, o software permite que os usuários configurem e refinam esses critérios dentro do módulo de Virologia. Com base em dados empíricos, foi aplicado o limiar padrão do software para CPE positivo, definido como o valor NCI do bem-estar tratado com vírus mais de três desvios padrão abaixo da média dos controles negativos (não inoculados), ou seja, ctrl negativo tratado com vírus NCI < (NCI-3 X SD). Os poços individuais foram então pontuados como positivos (+) ou negativos (-) (Figura 3B). Neste caso, o TCID50/mL do Adv-GFP foi posteriormente calculado usando a fórmula Reed-Muench, uma das fórmulas incluídas no software. Além de selecionar ou definir critérios para CPE positivo, nenhuma ação manual foi necessária para o cálculo do TCID50, pois o software automatizava totalmente o processo.

Rastreamento dinâmico do TCID50 durante a infecção viral
Para determinar a duração adequada do ensaio TCID50, os valores de Adv-GFP TCID50 foram extraídos nos momentos desejados após a infecção, começando em 30 horas e continuando em incrementos de 30 horas até 240 horas. Um incremento de 30 horas foi deliberadamente selecionado, pois a replicação do adenovírus leva aproximadamente 30horas e 10. Os valores do Adv-GFP TCID50 foram plotados em função do tempo (Figura 4). Uma observação notável é o aumento gradual dos valores de TCID50, que continua até aproximadamente 150 horas após a inoculação. Após esse ponto, emerge um platô, indicando um equilíbrio onde os efeitos citopáticos provavelmente atingiram saturação. O aumento dependente do tempo, seguido pela estabilização, sugere uma curva típica de replicação viral. A fase inicial é caracterizada pela propagação viral ativa, culminando em um pico que reflete o máximo impacto citopático sob as condições experimentais dadas. A fase de platô do TCID50 pode refletir um teto biológico onde o processo de infecção viral envolveu a maioria das células permissivas, resultando em morte celular significativa e interrompendo a replicação viral futura. O curso do tempo cinético TCID50 sugere que o ensaio pode ser interrompido de seis a sete dias após a inoculação para o modelo adenovírus-HEK293A, já que um valor constante de TCID50 de 8,9 × 109 TCID50/mL foi observado já em 150 horas.

Quantificação do título do vírus influenza A usando ensaio TCID50 baseado em impedância
Para investigar se o ensaio TCID50 baseado em impedância pode ser expandido para outros modelos vírus-hospedeiro, foi realizado um ensaio TCID50 em células MDCK infectadas com IAV. Embora acomodasse pequenas variações no meio de infecção específico para IAV, o procedimento principal de ensaio permaneceu consistente com o estabelecido para adenovirus. A Figura 5A mostra o NCI das células MDCK ao longo do tempo após a inoculação, com diluições IAV variando de 1 x 10-2 a 5 x 10-9. Semelhante aos resultados observados nas células HEK293 A infectadas por Adv, os poços de controle não infectados/negativos apresentaram NCI estável e consistente entre as réplicas. No entanto, os poços infectados pelo vírus revelaram uma mudança de NCI dependente da dose. Nas doses baixas, 6,4 e 1,3 x 10-7 diluições, observou-se um grande desvio padrão. Isso sugere que, nessas diluições, a concentração do vírus estava próxima de TCID50.

Poços positivos para CPE foram identificados usando os mesmos critérios e limiar aplicados no modelo Adv-HEK293A, especificamente, um desvio padrão triplo abaixo da média dos poços controle negativos. Os valores TCID50 baseados em impedância para IAV também foram determinados em vários momentos após a inoculação. A Figura 5B mostra os valores médios de TCID50 de dois experimentos independentes. Exceto pelo ponto inicial de 60 horas, os valores do TCID50 de 90 a 150 horas após a infecção demonstraram boa estabilidade e consistência, indicando que o ensaio TCID50 baseado em impedância para IAV pode ser concluído de forma confiável em quatro dias em vez de cinco. Essa consistência reforça a robustez do método baseado em impedância, confirmando sua adaptabilidade e confiabilidade entre diferentes patógenos virais.

Validação do ensaio TCID50 baseado em impedância usando o método convencional TCID50
Para verificar o TCID50 derivado da impedância para medição de concentração de IAV, foram realizados ensaios TCID50 usando duas abordagens alternativas em paralelo: imagem sem marcador e coloração violeta cristalina. Brevemente, células MDCK foram preparadas e semeadas em placas microtituladas de 96 poços. No dia seguinte, as células foram inoculadas com uma série de diluições IAV por 5 dias. Para o ensaio TCID50 baseado em imagem, a imagem de células vivas foi adquirida a cada 4 horas. As concentrações de dez amostras de IAV foram avaliadas no estudo de validação. A confluência celular dos poços tratados com vírus foi comparada à dos poços negativos e não infectados usando o software do sistema. No entanto, a análise de imagem para células MDCK foi particularmente desafiadora, como ilustrado na Figura 6A. A diferenciação precisa entre células e espaços vazios foi desafiadora devido à morfologia plana e às arestas mal definidas das células MDCK, comprometendo a identificação confiável de poços positivos para CPE por meio de análise baseada em imagens. O uso de softwares de análise de imagem mais avançados e sofisticados pode aumentar a precisão dos cálculos TCID50 nessescasos 11. Neste caso, a avaliação TCID50 baseada em imagem sem rótulo não foi bem-sucedida usando o software atual do sistema. Para o ensaio TCID50 de coloração violeta cristalina, as células foram fixadas e coradas no quinto dia após a inoculação, conforme descrito na seção do protocolo. A Figura 6B demonstra uma forte correlação linear entre os valores TCID50 baseados em impedância e baseados em coloração violeta cristalina, com uma equação de regressão de y = 0,9582x e R² = 0,9979. Esta análise comparativa ressalta a confiabilidade do método baseado em impedância para a medição de títulos virais e sua adequação para ensaios TCID50.

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Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio TCID50 baseado em impedância. Passo 1: Semeadura permissiva de células na placa biossensora. Semeie as células permissivas em uma placa com uma densidade de semeadura ideal. O crescimento celular é então monitorado no sistema como parte do procedimento de controle de qualidade celular (QC). Passo 2: preparação e inoculação do vírus. Prepare estoques de vírus diluídos em série usando um fator de diluição definido pelo usuário. Remova a placa do sistema e adicione os vírus aos poços da placa em uma capuz laminar. Passo 3: Medição e pontuação de CPE de poços CPE-positivos usando o software do módulo de Virologia. Devolva a placa ao sistema e retome o registro em tempo real da CPE induzida pelo vírus. O software identifica automaticamente poços positivos para CPE com base no limiar definido pelo usuário para detecção de CPE. Passo 4: Cálculo do TCID50. Com a pontuação em tempo real dos poços CPE-positivos em relação à inoculação viral, o software do módulo de Virologia pode calcular valores TCID50 em qualquer momento durante o ensaio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: A ECP induzida por adenovírus foi avaliada usando métodos baseados tanto em impedância quanto em imagem (A) Perfil dinâmico da impedância (eixo y esquerdo) e fluorescência verde (eixo y direito) em células HEK293A ao longo do tempo após a infecção com Adv-GFP. O Índice Celular Normalizado para células infectadas por adenovírus (infectadas por NCI Adv, linha vermelha), células controle negativas (NCI NC, linha preta) e intensidade total integrada com GFP (infectado por GFP Adv, linha verde) são representadas em função do tempo. A intensidade integrada total da GFP reflete a expressão da GFP em células permissivas e serve como indicador de infecção viral. Os números (1-6) ao longo do Índice de Células Normalizadas correspondem a pontos específicos durante o processo de infecção. Os dados são apresentados como média ± SD (N = 8). (B) Imagens sequenciais de células HEK293A antes e depois da infecção com Adenovírus-GFP. (1) A imagem de linha de base (0 h) é seguida por instantâneos em 48 h (2), 72 h (3), 96 h (4), 120 h (5) e 200 h (6) após a infecção, ilustrando a mudança no crescimento celular, viabilidade e fluorescência de adenovírus-GFP ao longo do tempo. Barras de escala = 160 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: EPC dependente de dose do adenovírus-GFP em células HEK293A medida pela impedância. (A) HEK293A células foram semeadas em uma placa biossensorial com densidade de 6.000 células/poço, e 24 horas depois, foram infectadas com uma série de adenovírus-GFP diluído 10 vezes. Os dados são apresentados como média ± SD (N = 8). Inset: Índice Celular Normalizado dos poços infectados com adenovírus-GFP em diluição de 10-8 . Os dados das diluições 10-9, 10-11 e 10-12 são omitidos para maior clareza. (B) Os poços/réplicas individuais em cada diluição do vírus foram avaliados como CPE-positivos (+) ou CPE-negativos (-). Cada coluna da placa foi tratada com uma diluição viral diferente, com o gradiente de diluição variando do menor na coluna 1 ao mais alto na coluna 10. As colunas 11 e 12 foram poços controle negativos, sem tratamento contra o vírus. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: O curso temporal dos valores de TCID50 derivados de medições de impedância da CPE em células HEK293 após a infeção com adenovírus-GFP. O TCID50/mL de adenovírus-GFP foi calculado nos momentos específicos usando o módulo de Virologia de cinco experimentos. Embora o módulo de Virologia forneça três fórmulas de cálculo TCID50, a fórmula Reed-Muench foi selecionada para o cálculo TCID50. Os dados são apresentados como média ± DS (N = 5). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Avaliação do título do vírus Influenza A usando o ensaio TCID50 baseado em impedância. (A) CPE dependente de dose do IAV em células MDCK medida via impedância. As células MDCK foram semeadas em uma placa biossensorial a 8.000 células/poço e infectadas 24 horas depois com uma diluição serial de cinco vezes do vírus da gripe. Os dados são mostrados como média ± DS (N = 8). Os dados da diluição 2,6 × 10⁻⁸ são omitidos para maior clareza. (B) Curso temporal dos valores TCID50 derivados de medições de impedância em células MDCK infectadas por IAV. O método Reed-Muench foi utilizado para o cálculo do TCID50. Os dados são apresentados como média ± DS (N = 2). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6: Correlação entre ensaios TCID50 baseados em impedância e baseados em coloração violeta cristalina. (A) Imagem de células MDCK inoculadas com IAV. Barra de escala = 160 μm. (B) Uma comparação dos valores de TCID50/mL obtidos por métodos baseados em impedância e coloração em violeta cristalino foi realizada usando dez amostras IAV. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 7: As interfaces representativas do software do módulo de Virologia do sistema. O software simplifica o processo de ensaio TCID50 baseado em impedância. (1) Disposição da placa para registrar o desenho do experimento; (2) Índice Celular ou Índice Celular Normalizado era automaticamente plotado e exibido pelo software durante a inoculação viral; (3) o software oferece flexibilidade na determinação de critérios e escolhas de CPE positivo para a fórmula de cálculo do TCID50; (4) TCID50/mL pode ser determinado em qualquer momento durante o ensaio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Neste estudo, foi demonstrada a aplicabilidade da impedância para a determinação de títulos virais usando modelos adenovírus-HEK293A e vírus influenza A-MDCK. Outros também validaram a detecção robusta e confiável de CPE induzida pelo vírus usando sistemas RTCA em uma ampla gama de vírus, incluindo ortopoxvírus12, vírus do Nilo Ocidental (WNV) e vírus da encefalite de St. Louis (SLEV)13, vírus chikungunya14, vírus bursalinfeccioso 8, dengue quiméricafebre amarela 15, vírus hepatiteA 16, SARS-CoV-217 e vírus dadengue 9.

O registro em tempo real de CPE por impedância permite a descoberta de quedas dependentes do tempo específicas do vírus no valor do CI em certos modelos celulares permissivos por vírus. Fang et al. demonstraram primeiro que um parâmetro cinético que caracteriza a CPE induzida por flavivírus, CIT50 — definido como o tempo até uma diminuição de 50% na impedância celular — é inversamente proporcional à dose infecciosa viral dentro de uma faixa específica. Eles também mostraram que o CIT50 é proporcional ao recíproco do título de anticorposneutralizantes 13. Desde então, Charretier et al., da Sanofi Pasteur, investigaram esse método de análise celular em tempo real baseado em impedância (RTCA) para determinar títulos infecciosos virais durante o desenvolvimento do produto e processo da vacina quimérica contra febre amarela e dengue (CYD). Charretier et al.15 validaram ainda essa dose infecciosa de cultura celular baseada em impedância de 50% (CCID50) com um ensaio CCID50 baseado em imunocoloração. Eles demonstraram que o método RTCA baseado em impedância é aproximadamente 5 vezes menos intensivo em mão de obra e 3,5 vezes mais econômico do que o ensaio padrão CCID50 em ambiente industrial. Em nosso estudo, a validação do TCID50 baseado em impedância em comparação com o tradicional ensaio Crystal Violet TCID50 foi demonstrada para CPE induzida por IAV. Além disso, o módulo de software de Virologia no software RTCA foi utilizado. Os poços CPE-positivos foram automaticamente identificados com base em critérios definidos pelo usuário para poços CPE-positivos no software; no nosso caso, o grau de IC cai em comparação com os controles negativos. O TCID50 foi então calculado pelo software de acordo, permitindo uma determinação precisa dos títulos sem depender do CIT50 ou correr o risco de a amostra de teste ficar fora da faixa ideal. Estabelecer um limiar adequado para poços positivos para CPE é crucial, pois impacta diretamente a sensibilidade e especificidade do ensaio. Recomenda-se que os usuários determinem critérios específicos de vírus comparando as alterações do Índice Celular com os resultados do método convencional validado. Esses limiares derivados empiricamente podem então ser configurados e refinados dentro do módulo de Virologia do software.

Como em outros ensaios baseados em células, a condição das células permissivas usadas nos ensaios TCID50 baseados em impedância é fundamental para determinar o sucesso do teste e a qualidade dos resultados. Para garantir alta proliferação celular e viabilidade, recomenda-se células frescas de baixa passagem. Além disso, criar um banco celular de células permissivas na mesma passagem pode melhorar a reprodutibilidade entre experimentos. Como indicado na Figura 3A, quando as células permissivas estavam em condições ideais, elas geravam sinais de impedância estáveis e consistentes nos controles não infectados durante todo o ensaio. Ele forneceu uma referência confiável de referência para estabelecer um limiar para poços CPE-positivos, resultando em uma determinação precisa do título viral. Além disso, o ensaio TCID50 baseado em impedância é singularmente capaz de realizar controle de qualidade em células permissivas antes da avaliação do título viral. O perfil característico de CI cinético das células permissivas saudáveis serve como uma métrica confiável de controle de qualidade, garantindo que apenas populações celulares viáveis e consistentes sejam usadas para quantificação viral, aumentando assim a reprodutibilidade e a precisão do ensaio.

Para cada novo vírus, a otimização e validação do ensaio de impedância-TCID50 também deve ser realizada antes da implementação. Fatores-chave, como condições de cultura celular, incluindo o meio basal e a concentração de FBS, são críticos para alcançar dados reprodutíveis de impedância celular e aumentar a sensibilidade da detecção de CPE, como destacado por estudos anteriores 6,16. Nesse sentido, a tecnologia baseada em impedância em tempo real e sem rótulo provou ser uma ferramenta simples, eficiente e valiosa para otimizar as condições de cultura celular durante o desenvolvimento doensaio 16.

Uma limitação do ensaio impedância-TCID50 surge com vírus que não causam CPE, pois o ensaio depende da CPE para gerar mudanças na leitura de impedância, que forma a base para o cálculo do TCID50. Nesses casos, pode ser necessário identificar um modelo celular permissivo alternativo que possa apresentar CPE induzida pelo vírus ou adotar uma abordagem de imunocoloração, desde que haja um anticorpo adequado contra o antígeno viral específico. No entanto, este estudo demonstrou a capacidade do sistema MP RTCA de capturar CPE dependente de dose e distinguir efetivamente entre populações celulares infectadas e não infectadas por meio de uma leitura objetiva e sensível de impedância.

A introdução da análise dependente do tempo TCID50 representa um avanço significativo em relação às medições tradicionais de endpoints. Isso simplifica o processo de otimização do ensaio TCID50, pois o momento ideal para calcular e reportar o título viral pode ser facilmente obtido a partir de um único ensaio em tempo real. Embora ensaios TCID50 sem rótulos baseados em imagem também possam fornecer valores TCID50 resolvidos no tempo, sua aplicabilidade é limitada a modelos vírus-células que exibem CPE reconhecida pelos algoritmos de software de imagem, como demonstrado no modelo IAV-MDCK (Figura 6A). Além disso, o uso de impedância sem rótulo para detecção de CPE elimina as complicações do uso de vários reagentes e fluxos de trabalho em múltiplas etapas que potencialmente aumentam os riscos associados a erros humanos. Além de simplificar o fluxo de trabalho, o módulo de Virologia do software do sistema também simplifica o ensaio. Primeiro, começa com uma configuração fácil de cronograma de experimentos para gravação automática controlada pelo sistema. É seguida por uma pontuação espontânea em tempo real e positiva para CPE após cada medição e conclui com o cálculo automatizado do TCID50 para uma quantificação direta das partículas de vírus infecciosos (Figura 7). Essa automação reduz significativamente o tempo de contato manual, uma melhoria crucial, especialmente no manejo de vírus altamente infecciosos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina 0,53 mM EDTA  (1x)Corning25-052-CI
12 reservatórios de reagentes do canalTecnologias VistaLab3054-1011
Adenovírus-GFPVector Biolabs 1060
Meio DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Soro fetal bovinoAvantor97068-085
Célula Hek293AThermo Fisher Scientific   R70507
Solução de penicilina-estreptomicinaHyCloneSV30010
Soro tampão de fosfato (1x)HyCloneSH30256.01
Seaplaque agaroseLonza50101
xCELLigence sistema RTCA eSightAgilentS2833AA
xCELLigence RTCA sistema MPAgilent380601040

Referências

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