Artigo de método

Rastreando métricas de corrida individuais em camundongos usando um protocolo voluntário de corrida de roda que minimiza o isolamento social

DOI:

10.3791/67960

⸱

18 de abril de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biological & Biomedical Sciences, College of Science & Mathematics, Rowan University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um modelo voluntário eficaz de corrida de rodas que pode ser implementado em vários contextos de pesquisa. Ao contrário de outros modelos de execução voluntária, esse método evita o isolamento enquanto rastreia métricas de execução em mouses individuais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A corrida voluntária em roedores é utilizada para avaliar o desempenho e a resistência e para simular o exercício. Em contraste com outros paradigmas de exercícios que requerem estímulo aversivo para induzir o movimento ativo, a corrida com rodas é voluntária. A VWR consiste geralmente em colocar uma roda de corrida dentro da gaiola inicial do rato. No entanto, a análise dos parâmetros do exercício normalmente só pode ser conduzida quando os camundongos estão alojados individualmente, enquanto os efeitos gerais da gaiola podem ser relatados quando os camundongos são alojados em grupo. Portanto, os modelos atuais forçam os experimentadores a escolher entre medir parâmetros individuais de exercício em camundongos alojados em um único ou medir os efeitos do grupo em camundongos alojados em grupo; Dependendo da questão e do modelo de pesquisa, isso pode ser limitante.

Portanto, o objetivo deste método é demonstrar um protocolo que avalie a VWR em um modelo de camundongo, quantificando os parâmetros de execução em camundongos individuais, com isolamento mínimo. Relatamos o design do dispositivo, os preparativos pré-operatórios e a configuração do experimento. Os resultados de um protocolo de treinamento de 6 semanas usando este modelo VWR sugerem que ele fornece estímulo suficiente para aumentar a memória de reconhecimento de objetos espaciais, comparável ao efeito clínico do exercício. Este modelo simples e barato facilita a investigação do efeito da VWR em várias medições da atividade da roda, minimizando fatores que podem limitar ou afetar os resultados experimentais.

Introdução

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O exercício afeta beneficamente a saúde fisiológica e psicológica e pode melhorar a fisiopatologia de inúmeras doenças1. A atividade física é fundamental para a saúde, e a Organização Mundial da Saúde (OMS) relatou em 2020 que o aumento da atividade física reduz o risco de inúmeras doenças, incluindo distúrbios psicológicos2. Além da prevenção de doenças, o exercício pode melhorar a função cerebral, estimulando o fluxo sanguíneo3, induzindo a neurogênese, particularmente no hipocampo4, uma região chave do cérebro para aprendizado e memória, regulação hormonal5 e plasticidade sináptica através do aumento dos níveis de fatores neurotróficos derivados do cérebro6. Por meio desses mecanismos, o exercício pode melhorar a função cognitiva e a memória7,8,9. Mecanismos neurobiológicos adicionais promovidos pelo exercício apoiam a saúde mental, incluindo liberação de endorfina10, redução do cortisol11, melhora da qualidade do sono12 e inibição da neuroinflamação13. Temos anteriormente
demonstraram que o exercício voluntário pode promover resiliência ao estresse crônico e comportamento semelhante à ansiedade em camundongos machos e fêmeas14. As evidências de que a atividade física melhora os resultados da doença, combinada com a promoção da saúde mental, destacam a necessidade de estratégias para incentivar a atividade física, incluindo o aumento de nossa compreensão do potencial preventivo e terapêutico do exercício.

Um método para estudar os efeitos do exercício na função biológica é usar modelos de exercícios de roedores. Esses modelos são eficazes no aumento do débito cardíaco e na indução da produção de lactato em vários níveis, dependendo da intensidade e frequência do exercício. Modelos comuns usados para estudar o efeito terapêutico do exercício incluem natação, treinamento em esteira e treinamento intervalado de alta intensidade15. Uma desvantagem de alguns modelos, no entanto, é o exercício involuntário ou forçado, que pode ser uma experiência estressante. Por exemplo, quando camundongos são submetidos a corrida em esteira em um modelo de lesão por isquemia cerebral, foi relatado um comportamento semelhante à ansiedade elevada no teste de campo aberto, aumento dos níveis de corticosterona, dano neuronal ou aumento dos níveis de citocinas16. Alternativamente, modelos de exercícios voluntários, incluindo VWR, podem evitar a experiência potencialmente estressante, permitindo que os roedores corram livremente, sem a necessidade de condicionamento ou reforço17. A VWR é normalmente realizada fornecendo acesso contínuo a uma roda de corrida em uma gaiola que abriga 4-5 camundongos ou gaiolas de camundongos com um único alojamento. Portanto, a VWR fornece condições não estressantes, pois não requer um estímulo negativo ou uma intervenção direta do experimentador e pode fornecer um mecanismo de enfrentamento ou experiência de enriquecimento18,19,20.

O objetivo deste método é propor um protocolo VWR simples e barato que permita o rastreamento de métricas individuais em execução com isolamento mínimo. Os camundongos são alojados em grupo para evitar o isolamento social prolongado, e os parâmetros de corrida são registrados para camundongos individuais, isolando-os em uma arena de corrida por apenas 2 h / dia. Os detalhes são fornecidos para um modelo VWR de 6 semanas no qual 10 camundongos C57BL/6 tiveram acesso a rodas de corrida por 2 h/dia, enquanto 10 camundongos C57BL/6 tiveram acesso a rodas travadas. Os resultados confirmaram que este protocolo VWR foi capaz de rastrear com sucesso parâmetros de corrida individuais com isolamento mínimo e mediar os efeitos benéficos do exercício na memória espacial induzida pelo hipocampo no teste de reconhecimento de objetos espaciais (SORT).

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Rowan University. Os camundongos machos pesavam entre 20 g e 27 g e tinham 8 a 10 semanas de idade no início do estudo. Os camundongos foram alojados em grupos de 4, em ambiente controlado (ciclo claro/escuro de 12:12 h) com acesso ad libitum a alimentos e água.

1. Configuração das rodas

  1. Na circunferência média externa de cada roda, cole um ímã. Este íman será detetado pelo censor do velocímetro para monitorizar a VWR (Figura 1A).
  2. No lado oposto da roda, cole um objeto de peso semelhante ao ímã (uma moeda) para contrabalançar e evitar rotação indesejada devido ao peso do ímã.
  3. Crie um palco para o velocímetro e a roda. Usando uma placa de espuma branca, corte um pedaço de forma complementar na base da roda e prenda-o na base (Figura 1B).
  4. Depois de inserir um novo conjunto de baterias no velocímetro, defina o tamanho da roda durante a programação inicial medindo a circunferência externa da roda.
  5. Cole o censor do velocímetro na plataforma. Certifique-se de que o censor do velocímetro esteja colocado paralelo ao ímã da roda para permitir o registro adequado do movimento (Figura 1C). Cada vez que o ímã passar pelo sensor, ele contará como uma revolução.
  6. Enrole o censor e o fio com fita adesiva para evitar a mastigação do fio por ratos (Figura 1D).

figure-protocol-1
Figura 1: Configuração do aparelho da roda de rolamento. (A) Um ímã e uma moeda colados (seta vermelha) em lados opostos da borda externa da roda. (B) Uma plataforma feita de placa de espuma (seta vermelha) usada como palco para o censor do velocímetro. (C) Censor do velocímetro na plataforma (seta vermelha); (D) Censura gravada (seta vermelha) e configuração finalizada da roda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Configuração do aparelho

  1. Utilize o aparato comportamental e divida a caixa de 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) em quatro quadrantes para testar individualmente quatro camundongos ao mesmo tempo.
    1. Corte dois pedaços de placa de espuma branca com base nas seguintes dimensões: L 30 cm, W 40 cm (Figura 2A).
    2. No meio do lado de 40 cm de largura da placa de espuma, faça um corte de 20 cm para permitir a interseção de duas placas de espuma.
    3. Cubra a placa de espuma com papel adesivo à prova d'água para facilitar a limpeza entre os grupos.
    4. Divida a caixa de 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) em quatro quadrantes (20 cm x 20 cm x 30 cm (h) usando duas placas de espuma que se cruzam (Figura 2B).
  2. Coloque uma roda preparada (verifique a configuração da roda acima) no canto de cada quadrante e prenda o fio na parede. Tape os velocímetros ao lado do aparelho Perspex transparente (Figura 2C).

figure-protocol-2
Figura 2: Configuração do aparelho. (A) Placa de espuma cortada e colada; (B) Aparelho de perspex dividido em quatro quadrantes; (C) uma roda colocada no canto de um quadrante com fio de velocímetro colado na parede. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. VWR

NOTA: Além das métricas do velocímetro, utilizamos o software de rastreamento comportamental, o sistema de rastreamento comportamental ANY-maze, para fornecer informações adicionais de rastreamento comportamental.

  1. Realize as sessões VWR diariamente, na fase de luz, à mesma hora todos os dias (das 9h às 11h00). Coloque os ratos sem exercício em arenas idênticas por 2 h, mas com as rodas travadas. Trave as rodas usando cola quente para imobilizar o centro de rotação da roda e desativar a rotação.
  2. Coloque os ratos na sala VWR para habituar por 30-60 min.
  3. Redefina todos os velocímetros.
  4. Coloque cada mouse no canto do quadrante, onde ele possa correr livremente por 2 h.
  5. Após 2 h, retorne os ratos de volta à gaiola e registre os dados do velocímetro.
  6. Limpe as arenas e rodas com etanol 70% entre os dois grupos.

4. CLASSIFICAR

NOTA: Ao final de 5 semanas de VWR, o SORT foi realizado para testar se o exercício melhorou a função do hipocampo de acordo com o protocolo publicado21.

  1. Realize as sessões de habituação e SORT durante a fase de luz em uma sala com iluminação ambiente. Realize sessões de habituação um dia antes do SORT, durante as quais mova os camundongos para gaiolas individuais e leve-os para a sala de testes por pelo menos 30 minutos de aclimatação.
    1. Atribua um dos cantos da arena como o "canto de liberação" e certifique-se de que todos os ratos sejam colocados de frente para o canto de liberação para explorar livremente a arena por 6 min. Retorne os ratos à sua gaiola individual para limpar a arena com 70% de etanol.
  2. Repita a etapa 4.1.1 2x para que cada mouse passe por três sessões de habituação. Assim que as sessões de habituação forem concluídas, devolva todos os ratos às suas gaiolas domésticas.
  3. Após 24 h, retorne os camundongos à sala de testes e deixe-os se habituar em gaiolas individuais por 30-60 minutos antes do teste.
  4. Fixe dois objetos diferentes de forma contrabalançada na arena a 6 x 6 cm de distância de dois cantos sem liberação.
  5. Coloque cada rato voltado para o canto de liberação para explorar livremente os objetos por 10 min. Retorne os ratos de volta às suas gaiolas individuais por 20 min e limpe os objetos e arenas com etanol a 70%.
  6. Mova um dos dois objetos e fixe-o a 6 x 6 cm de distância de um novo canto não liberado sem modificar a localização do outro objeto.
  7. Coloque cada mouse voltado para o canto de liberação para explorar livremente os objetos por 10 minutos antes de voltar para sua gaiola inicial. Registre esse teste usando um software automatizado para medir o tempo de investigação por objeto e calcular o tempo de investigação percentual da seguinte forma:
    % de tempo de investigação = figure-protocol-3

5. Análise estatística

  1. Expresse todos os dados como ± SEM.
  2. Realizar análises estatísticas usando software de análise estatística com significância definida em p ≤ 0,05. Analise os resultados do SORT usando o teste T de Student.

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Resultados

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Neste estudo, 20 camundongos machos C57BL/6 foram aleatoriamente designados para um dos dois grupos: sem exercício (NO-EX) ou exercício (VWR) por 6 semanas. Os parâmetros individuais de corrida foram registrados diariamente em velocímetros e plotados abaixo ± SEM (Figura 3A-C). Ao longo das 6 semanas, os camundongos foram mais ativos na semana 2, durante a qual passaram em média 2.135,87 ± 351,14 s na roda, percorrendo uma distância de 1,16 ± 0,25 km a uma velocidade de 2,25...

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Discussão

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Vários paradigmas de exercício são usados por pesquisadores para avaliar a atividade física e seus efeitos em roedores, incluindo paradigmas de corrida voluntária e forçada. Em comparação com os paradigmas de exercício forçado, o VWR permite que os ratos corram livremente em uma intensidade mais baixa, o que minimiza as condições estressantes22. Atualmente, os investigadores podem coletar parâmetros de exercício de camundongos individuais alojando-os 23,24,25,26,...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ANY-box Sistema de Teste de 5 ComportamentosStoelting65000https://stoeltingco.com/Neuroscience/ANY-box-Multi-Configuration-Behavior-Apparatus~9838
Computador de Bicicleta Velocímetro e Odômetros com FioIPSXP N/AQualquer velocímetro com fio que meça a distsnce, tempo, velocidade poderia funcionar
Revestimento Protetor de Adesivo Transparente Marca Con-TactN/Ahttps://con-tactbrand.com/products/clear-cover%E2%84%A2-clear-matte?_pos=1&_fid=be2dc000c&_ss=c
GraphPad Prism 
  Adesivo Instantâneo 496  Super BonderLoctiteS-24546https://www.uline.com/Product/Detail/S-24546/Adhesives-Glue-Epoxy/Loctite-Instant-Adhesive-496-Super-Bonder?pricode=WB0948&gadtype=pla&id=
S-24546& gad_source=1& gclid=Cjw
KCAjw68K4BhAuEiwAylp3klS0FN
ur-l_xKkue1NUmruDDV48QO5b2tVH
W9Bc08s9eZKmedj-yxBoCgIEQAvD_BwE
Pro Mag Ímã de Neodímio ÍmãAplicadoND018-6Se escolher outros ímãs, certifique-se de que eles são fortes o suficiente para serem detectados pelo censor
  Rodas de Exercício para Animais Pequenos Silent Spinner (mini 11.4 cm)KayteeSKU# 100079369https://www.kaytee.com/all-products/ Placas de Espuma Branca para Pequenos Animais/Roda Silenciosa
Pacon5553https://pacon.com/foam-board-350/pacon-foam-board-20-x-30-white-10pkg-2.html

Referências

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