Artigo de método

Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo apresenta métodos para manipulação optogenética em Drosophila melanogaster, utilizando CsChrimson e GtACR2 para ativar e silenciar neurônios específicos. Quatro experimentos são descritos para utilizar a optogenética para explorar comportamentos termotáticos e gustativos, fornecendo insights sobre os mecanismos neurais subjacentes que governam esses processos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A optogenética tornou-se uma técnica fundamental na neurociência, permitindo o controle preciso da atividade neuronal por meio da estimulação da luz. Este estudo apresenta configurações fáceis de implementar para a aplicação de métodos optogenéticos em Drosophila melanogaster. Duas ferramentas optogenéticas, CsChrimson, um canal catiônico ativado por luz vermelha, e GtACR2, um canal aniônico ativado por luz azul, foram empregadas em quatro abordagens experimentais. Três dessas abordagens envolvem experimentos de mosca única: (1) um ensaio de preferência posicional termotático optogenético de luz azul visando células de aquecimento sensíveis à temperatura, (2) um ensaio de preferência posicional optogenética de luz vermelha ativando neurônios sensores amargos e (3) um ensaio de resposta de extensão de probóscide ativando os neurônios sensíveis ao doce. A quarta abordagem (4) é uma configuração de labirinto de moscas para avaliar comportamentos de evitação usando várias moscas. A capacidade de manipular a atividade neural temporal e espacialmente oferece insights poderosos sobre o processamento sensorial e a tomada de decisões, ressaltando o potencial da optogenética para avançar nosso conhecimento da função neural. Esses métodos fornecem uma estrutura acessível e robusta para pesquisas futuras em neurociência para melhorar a compreensão de vias neurais específicas e seus resultados comportamentais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A optogenética surgiu como uma técnica poderosa que combina óptica e genética na neurociência, fornecendo controle preciso e não invasivo sobre a atividade neural por meio da estimulação da luz1. Em Drosophila melanogaster, um organismo modelo amplamente utilizado, as ferramentas optogenéticas permitem a ativação e inibição de neurônios específicos, permitindo que os pesquisadores modulem os circuitos neurais. Dentre as ferramentas utilizadas, CsChrimson e GtACR (rodopsinas do canal aniônico Guillardia theta) fornecem abordagens complementares para o direcionamento neuronal. CsChrimson channelrhodopsina, um canal catiônico sensível à luz vermelha de algas verdes, facilita a ativação neuronal por meio da despolarização quando exposto à luz vermelha, com pico de ativação em aproximadamente 590 nm2. CsChrimson oferece melhor penetração tecidual do que as channelrhodopsinas anteriores e reduz os artefatos comportamentais induzidos pela luz em estudos de Drosophila 2. Em contraste, o GtACR, que inclui variantes como o GtACR2, é um canal de cloreto dependente de luz que silencia os neurônios por meio da hiperpolarização 3,4. O GtACR2 conduz ânions e é ativado pela luz azul com um pico de ativação em torno de 470 nm4. CsChrimson e GtACR2 são ativados por comprimentos de onda distintos de luz, garantindo controle preciso e independente da atividade neuronal sem ativação cruzada5.

Drosophila é um modelo eficaz para pesquisa em neurociência devido à sua relação custo-benefício, facilidade de criação e respostas comportamentais robustas a estímulos ambientais, incluindo comportamentos atraentes e de evitação6. Seu tamanho pequeno e cutícula semitransparente aumentam a penetração da luz, especialmente a luz vermelha de comprimento de onda longo, permitindo uma manipulação optogenética eficiente 7,8. Embora as células de Drosophila não possam produzir retinal suficiente, um cofator crucial para a funcionalidade das channelrodopsinas, a adição de retinal à sua dieta compensa essa limitação, garantindo a ativação efetiva de ferramentas optogenéticas9.

Para explorar os efeitos da manipulação optogenética em Drosophila, descrevemos quatro experimentos direcionados a diferentes circuitos neurais e comportamentos, cada um utilizando modalidades distintas para avaliar respostas de evitação ou atrativas, variando de ensaios de mosca única a avaliações baseadas em grupo. As células de aquecimento (HC) em Drosophila são neurônios termossensoriais localizados na arista, respondendo a aumentos de temperatura10. Esses neurônios expressam canais iônicos sensíveis ao calor que desencadeiam o comportamento de evitação, afastando as moscas das fontes de calor10,11. Na abordagem 1, empregamos um ensaio de preferência posicional termotático optogenética de luz azul de mosca única para manipular neurônios HC. Ao expressar GtACR2 nesses neurônios, inibimos sua atividade após a exposição à luz azul. As moscas foram expostas a duas opções de temperatura: 25 °C e 31 °C. Sob a luz ambiente, as moscas evitaram o lado de 31 ° C, demonstrando uma resposta termotática típica. No entanto, a ativação da luz azul de GtACR2 silenciou os neurônios HC. Como resultado, as moscas não mostraram preferência significativa de temperatura, sugerindo inibição optogenética bem-sucedida. Além de avaliar a função dos neurônios sensoriais, a expressão de GtACR2 em neurônios sensoriais a jusante permite manipulações optogenéticas semelhantes para estudar os circuitos neurais necessários para modalidades sensoriais específicas5.

O receptor gustativo GR66a em Drosophila é expresso nos palpos labiais na extremidade distal da tromba e nas pernas, mediando a detecção do sabor amargo12,13. Esses neurônios desencadeiam comportamentos de evitação em resposta a substâncias amargas. Na abordagem 2, usamos um ensaio de preferência posicional optogenética de luz vermelha de mosca única para manipular neurônios que expressam GR66a. Ao expressar CsChrimson nesses neurônios, nós os ativamos após a exposição à luz vermelha. As moscas foram colocadas em uma arena com metade exposta à luz vermelha e a outra metade filtrando a luz vermelha. Na ausência de luz vermelha, as moscas não mostraram preferência. No entanto, a ativação da luz vermelha de CsChrimson estimulou os neurônios sensíveis ao amargo, resultando em evitação significativa da área iluminada, confirmando a ativação optogenética bem-sucedida dos neurônios GR66a. Abordagens semelhantes foram usadas para identificar os circuitos a jusante das células de aquecimento suficientes para o comportamento de evitação5.

Nós nos concentramos na ativação optogenética do comportamento apetitivo na abordagem 3. Os neurônios que expressam GR5a, localizados na sensila gustativa no labelo e nas pernas, detectam açúcares e impulsionam o comportamento alimentar. A ativação desses neurônios desencadeia a resposta de extensão da probóscide (PER)14. Usamos um ensaio de resposta de extensão de probóscide optogenética de luz vermelha para ativar os neurônios GR5a. Ao expressar CsChrimson nesses neurônios, nós os estimulamos com luz vermelha. As moscas não estendiam sua tromba em condições de luz ambiente. No entanto, a ativação da luz vermelha de CsChrimson levou à extensão da tromba sem um estímulo doce, demonstrando ativação optogenética bem-sucedida dos neurônios GR5a. Essa abordagem tem sido usada para investigar o circuito neural, incluindo neurônios sensoriais gustativos, neurônios de projeção gustativa e neurônios motores de tromba15,16.

Na abordagem 4, investigamos a ativação optogenética de comportamentos de evitação em grupos de moscas, usando um ensaio de labirinto de moscas optogenética de luz vermelha visando neurônios GR66a. As moscas foram colocadas na interseção de dois tubos: um iluminado com luz vermelha e outro sombreado. A expressão de CsChrimson em neurônios GR66a desencadeou a evitação. Na ausência de luz vermelha, as moscas não mostraram preferência, mas a ativação da luz vermelha levou as moscas que expressam GR66a a evitar a luz vermelha, sugerindo a ativação bem-sucedida da via. Os ensaios de labirinto de moscas têm sido amplamente utilizados para estudar várias modalidades sensoriais, incluindo temperatura, umidade e olfato. Quando combinada com a optogenética, essa abordagem é poderosa para investigar comportamentos atraentes e de evitação 17,18,19.

Esses métodos fornecem uma estrutura reprodutível para estudar a ativação optogenética e a inibição dos circuitos neurais de Drosophila . Ao utilizar uma combinação de diferentes channelrhodopsins e ensaios comportamentais acessíveis, este estudo de prova de conceito demonstra a eficácia da manipulação optogenética, fornecendo métodos diretos para manipular funções de circuitos neurais com potenciais aplicações mais amplas na pesquisa em neurociência.

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Protocolo

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1. Tensões, criação de moscas e aspirador de moscas

  1. Tensões e manutenção
    1. As cepas usadas nos experimentos incluem HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). A traseira voa a 25 °C em um meio de fubá padrão sob um ciclo de luz de 12 horas: 12 horas.
      NOTA: 1 L de meio de fubá contém 1 L dH2O, 79 g de dextrose, 7,5 g de ágar, 24 g de fermento em flocos, 57 g de fubá, 2,1 g de metil-4-hidroxibenzoato (dissolvido em 11,1 mL de etanol), 6 g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado e 0,9 g de cloreto de cálcio.
  2. Criação de moscas e preparação experimental
    1. Classifique moscas de 0 a 3 dias. No momento da experimentação, as moscas terão de 3 a 6 dias de idade, garantindo consistência relacionada à idade (Figura 1A).
    2. Divida cada genótipo em quatro grupos 3 dias antes de realizar experimentos: ATR de luz ambiente -, ATR de luz ambiente +, ATR de luz vermelha ou azul - e ATR de luz vermelha ou azul +.
    3. Prepare a solução estoque de ATR 80 mM dissolvendo o ATR em etanol 100%. Suplementar os alimentos com 400 μM de ATR aos grupos ATR +.
    4. Suplementar o alimento com a mesma concentração de etanol mas sem ATR aos grupos ATR.
    5. Retaguarda todos os grupos no escuro22.
    6. Starve Gr5a>CsChrimson voa por 16-24 horas em frascos contendo apenas tecido úmido. Os frascos ATR + contêm 400 μM ATR misturado com água, enquanto os frascos ATR - contêm dH2O misturado com a mesma concentração de etanol.
  3. Aspirador de moscas
    1. Monte o aspirador de moscas (Figura 1B) usando tubos de plástico, rede contra insetos e duas pipetas de transferência de 3 mL.
    2. Corte as pontas e bulbos das pipetas de transferência, garantindo que a ponta de sucção da mosca permita a passagem confortável de uma mosca. Este design permite a aspiração suave das moscas por inalação, minimizando os danos e facilitando a coleta e transferência eficientes de moscas individuais.
    3. Coloque a rede contra insetos sobre o tubo de plástico e prenda as extremidades do bulbo da pipeta ao tubo usando Parafilm.

2. Ensaio de preferência posicional termotático optogenética de luz azul de mosca única

  1. Cepas de Drosophila e criação de moscas
    1. Cruze a linha de driver HC-Gal410 para UAS-GtACR23, resultando no genótipo experimental HC>GtACR2. As moscas HC>GtACR2 expressam GtACR2 em células de aquecimento.
      NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.
  2. Configuração e execução do ensaio experimental
    1. Alinhe duas placas de aço em placas quentes separadas para que suas bordas se encontrem. Coloque um protetor de folha de plástico por cima, prendendo-o com fita adesiva para minimizar o movimento. Posicione um pedaço de papel branco no protetor de folha para reduzir os sinais de ruído de fundo (Figura 1C).
      NOTA: Substitua o white paper no início de cada experimento ou quando estiver sujo.
    2. Coloque uma tampa de plástico transparente (2 mm de altura × 58 mm de largura × 83 mm de comprimento) em cima do papel branco. Esta capa permite que a mosca ande livremente, impedindo-a de voar.
    3. Faça um furo no fundo de uma caixa de espuma de poliestireno (27 cm de altura × 22 cm de largura × 16 cm de comprimento) para aderir à câmera e à luz azul (1.000 mA) aproximadamente 12 cm acima da superfície experimental.
    4. Posicione a câmera e a luz azul para minimizar o brilho enquanto ativa a ativação.
      NOTA: Um pré-teste pode ser necessário para determinar a faixa de ativação da luz azul.
    5. Configure a câmera para gravar com as seguintes configurações: lapso de tempo de 1 s, campo estreito, 4000 × 3000 pixels.
    6. Ajuste as configurações da placa de aquecimento para manter uma temperatura de superfície de 25 ± 1 °C e 31 ± 1 °C nas respectivas placas de aço.
      NOTA: Para condições que requerem temperaturas abaixo de 25 °C, são necessários métodos alternativos de resfriamento, como dispositivos Peltier ou gelo. Se as temperaturas das chapas de aço excederem os níveis desejados, borrife a superfície com água destilada para atingir e manter as condições necessárias. Em seguida, use um guardanapo para absorver o excesso de umidade do protetor de folha de plástico.
    7. Antes e depois de cada tentativa, monitore as temperaturas usando uma sonda de temperatura de superfície.
      NOTA: O controle preciso da temperatura é crucial, pois as flutuações podem afetar os resultados.
    8. Coloque a tampa plástica no lado de 25 °C. Usando um aspirador de moscas, solte suavemente uma única mosca sob a cobertura. Posicione a caixa acima da área experimental para criar luz fraca (<10 lux) e permitir que a mosca se aclimate por 1 min.
    9. Após o período de aclimatação, levante a caixa e ajuste rapidamente a tampa plástica, posicionando-a com o centro da tampa alinhado com o limite da chapa de aço para garantir uma cobertura uniforme dos lados de 25 °C e 31 °C.
      NOTA: Durante este processo, a temperatura do ar e a temperatura dentro da tampa no lado de 31 °C aumentam para cerca de 27 °C em 5 s (Figura Suplementar 1), o suficiente para ativar as células de aquecimento11.
    10. Inicie o teste ligando a câmera e a luz azul (20 kLux).
      NOTA: Não acenda a luz azul em condições de luz ambiente. Ligue a câmera e grave alguns quadros antes de acender a luz azul em caso de movimento.
    11. Após mais de 2 minutos, termine o teste desligando a câmera e a luz. Descarte as moscas usando o aspirador.
      NOTA: Grave alguns quadros extras em caso de movimento ao desligar a câmera.
  3. Análise comportamental e estatística
    1. Analise apenas os dados das moscas que permanecem no lado de 25 °C no início do ensaio.
      NOTA: Rejeitar os dados das moscas que iniciam ensaios no lado de 31 °C, que apresentam frequentemente preferências alteradas23. Rejeitar os ensaios que envolvam moscas que não se aproximem do limite do lado de 31 °C, certificando-se de que escolheram entre as temperaturas. Descarte os dados das moscas que permanecem estacionárias por mais de 30 s.
    2. Analisar os resultados utilizando os procedimentos descritos anteriormente23. Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença de tempo que a mosca passou em cada zona de temperatura e o tempo total, conforme mostrado na seguinte fórmula:
      figure-protocol-1
      NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise dos dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado.

3. Ensaio de preferência posicional optogenética de luz vermelha de mosca única

  1. Cepas de Drosophila e criação de moscas
    1. Cruze a linha de driver Gr66a-Gal421 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental Gr66a>CsChrimson. As moscas Gr66a>CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios de sabor amargo.
      NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.
  2. Configuração e execução do ensaio experimental
    1. Conduza o ensaio em uma sala escura ou ambiente escuro para garantir a ativação controlada de CsChrimson ( Figura 1D ).
    2. Posicione uma câmara de vídeo cerca de 45 cm acima da superfície experimental.
      1. Use uma câmera de vídeo sem filtro infravermelho. Se uma câmara de vídeo tiver um filtro infravermelho passa-curto interno que bloqueia comprimentos de onda superiores a 700 nm, remova-o.
      2. Cole um filtro passa-longo de 830 nm sobre a lente usando super cola para capturar os comprimentos de onda infravermelhos. Este ajuste é essencial para registrar o movimento da mosca sob condições de luz infravermelha.
    3. Posicione uma fonte de luz vermelha24 aproximadamente 45 cm acima da superfície experimental, garantindo uma intensidade de luz de cerca de 2.5 kLux (1,000 mA).
      NOTA: Recomenda-se proteção ocular adequada que possa filtrar o laser/luz vermelha. Os óculos de segurança a laser ajudam a prevenir possíveis danos aos olhos devido à exposição direta à luz vermelha intensa.
    4. Use uma luz infravermelha para visualizar as moscas dentro da configuração. Mantenha-o ligado durante todo o experimento.
      NOTA: Evite o brilho na área experimental causado pela luz infravermelha; O brilho pode complicar a análise de dados.
    5. Use cola para prender um filtro infravermelho passa-longo de 780 nm na metade da tampa plástica.
      NOTA: Use qualquer filtro passa-longo que bloqueie comprimentos de onda abaixo de 780 nm. O lado não filtrado permite a passagem da luz vermelha e do infravermelho, enquanto o lado filtrado permite apenas a passagem da luz infravermelha.
    6. Coloque um material preto fosco embaixo da área experimental para minimizar o ruído de fundo.
    7. Coloque uma única mosca sob uma cobertura de plástico transparente (2 mm de altura × 58 mm de largura × 83 mm de comprimento) usando um aspirador de moscas e deixe-a aclimatar por 1 min.
    8. Aguarde até que a mosca esteja visível no lado não filtrado. Inicie o teste ligando a câmera de vídeo e a luz vermelha.
      NOTA: A câmara de vídeo é suscetível a movimentos imediatamente após o arranque. Prenda bem a câmera durante a gravação e ligue-a vários segundos antes de gravar para evitar movimentos aberrantes que podem complicar a análise. Não acenda a luz vermelha até o início do teste.
    9. Registre o movimento da mosca por 1 min.
      NOTA: Descarte as tentativas em que a mosca não se aproxima da linha média ou não se move por mais de 15 s.
    10. Após 1 min, termine o teste desligando a câmara de vídeo e a luz. Descarte as moscas usando o aspirador.
      NOTA: Grave alguns quadros extras para evitar os efeitos do movimento ao desligar a câmera.
  3. Análise comportamental e estatística
    1. Analisar os resultados utilizando os procedimentos descritos anteriormente23. Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença entre o tempo que a mosca passou na área sem o filtro e a área com o filtro e o tempo total, conforme mostrado na fórmula a seguir:
      figure-protocol-2
      NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise dos dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado.

4. Resposta de extensão de probóscide optogenética de luz vermelha

  1. Cepas de Drosophila e criação de moscas
    1. Cruze a linha de driver Gr5a-Gal420 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental conhecido como Gr5a>CsChrimson. As moscas Gr5a>CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios receptores de sabor doce.
      NOTA: Certifique-se de que um número igual de moscas machos e fêmeas seja usado para cada condição.
    2. Voos de fome por 16-24 h com ATR (ATR +) ou sem (ATR -) antes do teste.
      NOTA: Períodos de fome mais longos podem ser necessários para obter uma resposta forte.
  2. Configuração e execução do ensaio experimental
    1. Anestesiar moscas resfriando no gelo (Figura 1E).
      NOTA: Evite o contato direto entre moscas e gelo. Limite o tempo de resfriamento a cerca de 1 min; O resfriamento prolongado pode resultar em problemas de recuperação e mortalidade.
    2. Use a ponta de uma ponta de pipeta de 1000 μL para aplicar 7 a 10 pequenos pontos de cola nas lâminas de vidro.
      NOTA: Pequenas gotas de cola no slide garantem que a mosca não fique submersa e ajudam a evitar que a cola grude em sua tromba ou pernas.
    3. Posicione uma mosca, com o lado ventral para cima, em cada ponto de cola. Certifique-se de que o tórax e as asas entrem em contato com a cola para minimizar o movimento. Espalhe as asas para cada lado para aumentar a área da superfície adesiva.
      NOTA: Evite colocar moscas muito próximas umas das outras, o que pode ativar inadvertidamente várias moscas durante a exposição à luz.
    4. Deixe a cola secar por cerca de 10 min.
    5. Transfira as lâminas para uma caixa de umidade (uma caixa de plástico com toalhas de papel molhadas) e deixe as moscas se recuperarem por 2 h.
    6. Coloque a lâmina sob o microscópio. Use uma seringa para fornecer uma gota de água para saciar as moscas, evitando extensões de tromba induzidas pela sede.
    7. Segure manualmente um ponteiro laser vermelho para acender a luz vermelha na tromba/cabeça de uma única mosca (700 lux) enquanto observa a resposta PER através do microscópio.
      NOTA: A proteção para os olhos que pode filtrar o laser/luz vermelha é essencial ao observar a luz vermelha através do microscópio.
    8. Observe e registre a extensão da tromba dentro de uma janela de 30 segundos. Marque cada mosca usando o seguinte sistema de registro: 0 indica nenhuma extensão, 0,5 indica extensão de 1-2 s, 1 indica que a extensão dura mais de 3 s.
    9. Depois de testar a extensão da tromba induzida por luz, examine a resposta à sacarose a 4% usando uma seringa. Expulse uma gota de sacarose na ponta da agulha e aproxime-a da tromba da mosca.
      NOTA: Descarte os dados das moscas que não respondem à gota de sacarose.
  3. Análise comportamental e estatística
    1. Realize análises estatísticas usando um software de análise de dados apropriado.
      NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras.

5. Ensaio optogenético do labirinto da mosca da Vermelho-luz

  1. Cepas de Drosophila e criação de moscas
    1. Cruze a linha de driver Gr66a-Gal421 para UAS-CsChrimson2, resultando no genótipo experimental Gr66a>CsChrimson. As moscas Gr66a>CsChrimson expressam CsChrimson em neurônios de sabor amargo.
      NOTA: Certifique-se de que cada grupo contenha um número igual de moscas machos e fêmeas.
  2. Montagem do labirinto de moscas
    1. Faça o labirinto de moscas conforme mostrado na Figura 1F.
      NOTA: Como alternativa, imprima em 3D os componentes do labirinto de moscas, montando conforme detalhado anteriormente25.
    2. Corte três tubos de cultura de plástico de 5 mL em comprimentos adequados para fazer um tubo de carregamento, um tubo de teste transparente descoberto e um tubo de ensaio coberto com papel alumínio. Prenda os tubos ao labirinto de moscas conforme mostrado na Figura 1F.
      1. Dependendo do material do labirinto, corte os tubos de ensaio para garantir uma distância igual para cada condição de teste. Com base no comprimento da câmara de retenção, encurte o tubo de ensaio descoberto em um labirinto transparente, enquanto encurta o tubo de teste coberto de folha metálica se o labirinto for opaco.
  3. Configuração e execução do ensaio experimental
    1. Em condições de pouca luz, coloque 10 machos e 10 fêmeas no tubo de carregamento. Conecte o tubo de carregamento à câmara de retenção. Incline o elevador e bata suavemente no tubo para mover as moscas para a câmara de retenção.
      NOTA: Abaixe o elevador de forma que apenas metade da câmara de retenção fique aberta. Essa manipulação facilita a transferência de moscas do tubo de carregamento para a câmara de retenção.
    2. Depois que as moscas forem transferidas para a câmara de retenção, use o elevador para abaixar as moscas entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Em seguida, remova o tubo de carregamento.
    3. Posicione o labirinto de moscas a aproximadamente 13 cm de distância da fonte de luz vermelha (1000 mA) sem acender a luz.
    4. Abaixe o elevador até que a câmara de retenção se alinhe com os orifícios do tubo de teste, permitindo que as moscas se movam livremente entre os tubos de ensaio envoltos em papel alumínio e os descobertos. Simultaneamente, acenda a luz vermelha para ativar o CsChrimson. Certifique-se de que a intensidade da luz vermelha na superfície do tubo de ensaio descoberto seja de cerca de 40 kLux.
      NOTA: Não acenda a luz vermelha até que a câmara de retenção esteja abaixada e alinhada com os orifícios do tubo de teste. Recomenda-se proteção ocular adequada que possa filtrar o laser/luz vermelha devido ao intenso brilho da luz vermelha.
    5. As moscas escolhem entre o tubo exposto à luz vermelha e o tubo sombreado por um minuto.
    6. Após 1 min, levante o elevador entre o tubo de carregamento e os orifícios do tubo de teste. Conte as moscas em cada tubo.
      NOTA: Apenas moscas ativas e não feridas são contadas.
    7. Limpe o elevador e o labirinto usando dH2O após cada tentativa.
  4. Análise de dados e estatística
    1. Calcule o índice de preferência (PI) como a razão entre a diferença no número de moscas entre tubos descobertos e cobertos e o número total de moscas, conforme mostrado na fórmula a seguir:
      figure-protocol-3
      NOTA: Os detalhes estatísticos dos experimentos são fornecidos nas legendas das figuras. A análise de dados é realizada usando um software de análise de dados apropriado

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ensaio de preferência posicional termotático optogenética de luz azul de mosca única
Quatro condições foram testadas: luz ambiente sem suplementação de ATR (luz ambiente, ATR -), luz ambiente com suplementação ATR (luz ambiente, ATR +), luz azul sem suplementação ATR (azul, ATR -) e luz azul com suplementação ATR (azul, ATR +). As três primeiras condições serviram como controles. Em experimentos de controle, as moscas evitaram o lado de 31 ° C. Na luz azul com suplementação de ATR, as moscas não exibi...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A manipulação optogenética transformou o campo da neurociência, permitindo o controle preciso dos circuitos neurais com precisão espaço-temporal27. Um circuito neural inclui populações de neurônios interconectados por sinapses, desempenhando funções específicas após a ativação. O conectoma de todo o cérebro da Drosophila foi concluído, oferecendo informações abrangentes sobre as vias sinápticas dentro do cérebro da Drosophila 28...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste artigo. Todos os autores revelaram quaisquer conflitos potenciais e afirmam não ter relações financeiras ou pessoais que possam influenciar o trabalho apresentado neste estudo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagramas esquemáticos para todas as figuras foram criados com Biorender.com. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) para L.N. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
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Tubos de Cultura VWR de 5 mL, Plástico, com Tampas de Posição DuplaVWR60818-664
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Linha de mosca: Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57592
Linha de mosca: Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57670
Linha de mosca: HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabUm presente gentil
Linha de mosca: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
Linha de mosca: UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabUm presente gentil
Flystuff 62-101 Fubá Amarelo (11,3 Kg), Amarelo, 11,3 Kg/UnidadeGenesee Scientific62-101
Levedura Seca Inativa Flystuff 62-107, 10 Kg, Flocos Nutricionais, 10 Kg/UnidadeGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Mesh, 5 Kg (11.02 lbs)/UnidadeGenesee Scientific66-103
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LEE Filters 100&vezes; 100 mm Infravermelho Vermelho # 87 Filtro de Poliéster InfravermelhoB & H PhotoLE8744
Filtro Longpass, Vidro Colorido, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
Metil 4-hidroxibenzoato, 99%, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific 
MicroWell Mini Bandeja 60 Poços, Perfil Baixo NS PSThermal Scientific NUNC 439225As tampas são usadas como a "tampa de plástico"
Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µ L Pontas de Pipeta Ergonômicas Olympus de Baixa Encadernação, Racked, Estéril, 8 Racks de 96 Pontas/UnidadeFilme de Vedação Eppendorf24-160RS
Parafilm MHeathrow ScientificHS234526B4 in x 125 pés
Cloreto de potássio, ACS, 99.0-100.5%, Thermo Fisher Scientific 
Software de análise de dadosPrismGraphPadVersão 9
Pipetas de Transferência Graduada SamcoThermo Fisher Scientific 225de 3 mL
Fisher Scientific12-544-2  Microscópio estéreo de 5 mm x 75 mm x 1,0 mm
OLYMPUSCZ61
(27 cm de altura e tempos; 22 cm de largura e tempos; 16 cm de comprimento)
SacaroseFisher Scientific225911
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Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & amp Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & amp Lyle, Pó, 50 lbs/UnidadeRastreável Genesee Scientific62-113
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Referências

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