Artigo de método

Um modelo de bexiga in vitro de infecção do trato urinário associada a cateter

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 de junho de 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha um modelo in vitro do trato urinário cateterizado, que pode ser usado para estudar populações de células bacterianas planctônicas e associadas ao biofilme em infecções simuladas do trato urinário associadas a cateteres. Este modelo pode ser utilizado para estudar a eficácia de produtos antimicrobianos destinados a controlar infecções do trato urinário.

Resumo

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As infecções do trato urinário associadas a cateteres (CAUTIs) estão entre as infecções mais comuns associadas aos cuidados de saúde. A formação de biofilme nos cateteres urinários é um aspecto fundamental na patogênese dessas infecções, e frequentemente leva ao bloqueio dos cateteres e complicações graves, como pielonefrite e septicemia. Abordagens para modelar e estudar a formação de biofilme neste cenário são essenciais tanto para uma compreensão fundamental dos mecanismos subjacentes à patogênese da CAUTI, quanto para o desenvolvimento e avaliação pré-clínica robusta de estratégias terapêuticas eficazes para controlar a CAUTI e o bloqueio do cateter. Este protocolo descreve um modelo in vitro do trato urinário cateterizado, que replica o sistema de drenagem fechada do cateter utilizado na prática clínica, facilitando o estudo da CAUTI e da formação de biofilme do cateter em condições representativas. Além disso, este protocolo detalha a aplicação do modelo de bexiga in vitro para avaliar a eficácia dos produtos de manutenção de cateteres antimicrobianos, incluindo produtos atualmente disponíveis na cadeia de suprimentos do NHS.

Introdução

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Os cateteres urinários estão entre os dispositivos médicos mais comumente implantados, com uma prevalência estimada de 19% em instalações de cuidados intensivos 1,2,3. Os cateteres são implantados principalmente para auxiliar no gerenciamento do débito urinário em casos de disfunção da bexiga e são inseridos diretamente na bexiga, permitindo que a urina seja eliminada da bexiga por meio de um lúmen central 2,3. Os cateteres urinários podem ser usados de forma intermitente, onde são inseridos na bexiga periodicamente para drenar a urina, ou podem ser utilizados cateteres de demora, onde os cateteres são deixados in situ na bexiga para drenar continuamente a urina 3,4. Apesar de seu uso generalizado, os cateteres urinários são o maior fator de risco para o desenvolvimento de infecções do trato urinário (ITUs), que representam cerca de um quinto das infecções associadas à assistência à saúde 5,6. De fato, o próprio cateter muitas vezes atua como o local inicial da colonização microbiana, fornecendo uma superfície para os uropatógenos aderirem e colonizarem ainda mais o trato urinário 1,6,7,8. Praticamente todos os pacientes submetidos a cateterismo contínuo de longo prazo (onde o cateter é deixado no local por ≥28 dias) apresentarão bacteriúria, com o risco aumentando em ~ 5% para cada dia em que o cateter estiver in situ 2,9,10,11. Proporcionalmente, cerca de 80% das ITUs estão associadas ao uso de cateter urinário6.

As infecções do trato urinário associadas a cateteres (CAUTIs) representam um fardo significativo para os serviços de saúde e estão frequentemente associadas a sintomas de ITU superior mais graves (como ureterite e pielonefrite) do que as ITUs não complicadas, bem como a um risco aumentado de infecções secundárias da corrente sanguínea 1,7,12,13,14 . Os tratamentos padrão para CAUTIs incluem antibioticoterapia, no entanto, essas infecções são frequentemente recalcitrantes ao tratamento antimicrobiano como resultado do desenvolvimento de comunidades complexas de biofilme na superfície do cateter 15,16,17,18,19,20. De fato, estima-se que ~ 80% dos CAUTIs resultam de patógenos do trato urinário formadores de biofilme19. A formação de biofilme é caracterizada pela fixação de células bacterianas às superfícies do cateter e pelo desenvolvimento de comunidades embebidas em uma extensa matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS)21,22,23,24. A produção do EPS é uma característica definidora das comunidades de biofilme e é responsável por muitas das propriedades emergentes exibidas pelas células associadas ao biofilme, como resistência elevada a agentes antimicrobianos e depuração imunológica21 , 22 , 24 . O EPS pode desempenhar um papel direto nesses fenótipos, protegendo fisicamente as células e protegendo-as de antimicrobianos ou efetores imunológicos, bem como indiretamente, facilitando o desenvolvimento de aspectos mais amplos das comunidades de biofilme, como o microambiente físico-químico do biofilme e a formação de células persistentes23 , 24 , 25 , 26 . Além disso, alguns uropatógenos, incluindo Proteus spp., que respondem por ~ 11% dos CAUTIs, possuem enzimas urease potentes, permitindo-lhes hidrolisar a uréia presente na urina e resultando em um aumento geral no pH urinário 2,27,28,29,30. Esse aumento de pH é acompanhado pela precipitação de cristais de fosfato de cálcio e magnésio, que podem ser incorporados ao biofilme em crescimento, resultando em biomineralização e formação de estruturas densas de biofilme cristalino que podem bloquear cateteres. Esses biofilmes cristalinos não apenas tornam o tratamento problemático, mas também podem iniciar complicações graves, como pielonefrite e septicemia 2,28,31,32,33,34.

O complexo nicho ambiental no trato urinário cateterizado e o importante papel da formação de biofilme nessas infecções representam desafios particulares no estudo da patogênese do CAUTI. Modelos laboratoriais simples e amplamente utilizados para estudar e quantificar a formação de biofilme, como ensaios baseados em placas de 96 poços, são inadequados para o estudo da formação de biofilme em CATUI, particularmente biofilmes cristalinos. Por exemplo, esses modelos não levam em conta aspectos-chave do nicho CAUTI, como o complexo ambiente nutritivo fornecido pela urina, como a superfície do cateter afeta a adesão e a subsequente produção de biofilme e o fluxo contínuo do meio urinário 35,36,37,38,39,40. Além disso, os ensaios padrão usados para determinar a suscetibilidade antimicrobiana de uropatógenos geralmente não refletem a suscetibilidade clínica do mundo real. Ensaios de concentração inibitória mínima e testes de suspensão microbiana são frequentemente usados para inferir a suscetibilidade antimicrobiana de patógenos CAUTI, mas normalmente não simulam variáveis importantes do ambiente CAUTI, como o efeito que a presença de um cateter urinário e qualquer formação subsequente de biofilme podem ter na suscetibilidade antimicrobiana 41,42,43.

Este estudo detalha a configuração e o funcionamento de um modelo de bexiga in vitro que simula o ambiente do trato urinário cateterizado e replica um sistema de drenagem fechado por cateter padrão usado na prática clínica, descrito pela primeira vez por Stickler et al.44 em 1999 (Figura 1). Este modelo utiliza cateteres de Foley de tamanho padrão (que estão atualmente disponíveis na cadeia de suprimentos do NHS) e meios de urina artificial (AUM), conforme descrito anteriormente por Nzakizwanayo et al.45para simular a formação de CAUTI e biofilme. O modelo de bexiga in vitro consiste em uma câmara de vidro de parede dupla que atua como a "bexiga" e possui uma saída através da qual um cateter de Foley pode ser inserido na câmara de vidro central. Na parte superior da câmara de vidro central, há uma entrada através da qual o AUM pode ser fornecido à "bexiga" a uma taxa de fluxo biologicamente relevante usando uma bomba peristáltica, que fluirá através do cateter através dos orifícios de drenagem para um saco de lixo. Além disso, a câmara externa é conectada a um circuito de banho-maria, o que permite que os modelos sejam mantidos a uma temperatura constante. O modelo de bexiga in vitro pode ser inoculado através da câmara central, permitindo o estudo de patógenos CAUTI em um nicho biologicamente representativo. Além disso, como os modelos são cateterizados e constantemente abastecidos com AUM fresco, o crescimento e a dinâmica populacional das células planctônicas e associadas ao biofilme podem ser estudados.

Estudos anteriores utilizaram modelos de bexiga in vitro para várias aplicações, incluindo o estudo fundamental da formação de biofilme em patógenos CAUTI proeminentes, incluindo Proteus mirabilis e Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Além disso, o modelo in vitro tem sido utilizado para avaliar a eficácia de produtos destinados ao controle de CAUTI ou prevenção de bloqueios 50,51,52. Mais recentemente, modelos têm sido usados para determinar se adaptações e mutações ligadas à RAM impactam a formação de biofilme e a patogênese de CAUTI em P. mirabilis43,46. O modelo de bexiga in vitro também tem sido usado para estudar novos tratamentos antimicrobianos destinados ao tratamento de CAUTI, incluindo revestimentos de cateter teranósticos recém-formulados e tratamentos de terapia fágica47,48. Este protocolo engloba a configuração e execução de modelos de bexiga in vitro, a enumeração de células planctônicas viáveis e associadas ao biofilme do modelo e da superfície do cateter urinário, respectivamente, e a medição do pH urinário para monitorar a produção de urease. Os protocolos também são detalhados para a avaliação de produtos antimicrobianos destinados a tratar ou prevenir CAUTI, incluindo soluções de irrigação da bexiga e géis lubrificantes antimicrobianos, que estão atualmente disponíveis na cadeia de suprimentos do NHS.

Protocolo

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Uma representação esquemática da configuração do modelo de bexiga in vitro é mostrada na Figura 1. Os modelos de bexiga in vitro são projetados para serem compatíveis com cateteres de Foley padrão (as dimensões mostradas na Figura 1 são compatíveis com cateteres franceses de tamanho padrão 14). Esterilize todos os equipamentos de modelo de bexiga in vitro e prenda qualquer tubo de silicone usado no circuito de mídia antes de usar. A adesão estrita à técnica asséptica é necessária em toda a configuração dos modelos in vitro , e recomenda-se que o modelo seja montado em condições estéreis (ou seja, em uma cabine de segurança microbiana de categoria II ou capela de fluxo laminar). Recomenda-se um mínimo de n = 5 repetições para determinar a significância estatística para experimentos em modelos de bexiga in vitro . Os detalhes sobre os reagentes e o equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de meios de urina artificiais

NOTA: O meio de urina artificial (AUM) é recomendado para uso em modelos de bexiga in vitro devido aos altos volumes de meio necessários para experimentação e à variabilidade associada às amostras de urina humana. Este protocolo detalha a preparação do AUM conforme descrito anteriormente e otimizado para uso no modelo de bexiga in vitro por Nzakizwanayo et al. (volume final de 5 L) 43,45,46,48,53,54.

  1. Preparar a solução AUM 1
    1. Pesar os seguintes compostos e adicionar a um frasco de borossilicato de 1 L cheio de 850 ml de água desionizada: 3,25 g de cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl 2,6H 2O), 23 g de cloreto de sódio (NaCl), 11,5 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), 3,25 g de citrato trissódico (Na3C6H5O7), 0,1 g de oxalato de sódio (Na2C2O4), 14 g de fosfato monopotássico (KH2PO4), 8 g de cloreto de potássio (KCl), 5 g de cloreto de amônio (NH4Cl), 25 g de gelatina e 5 g de caldo de soja triptona.
  2. Enquanto agita a solução AUM, meça o pH usando um medidor de pH e ajuste para 5,75 (± 0,02) adicionando 3 M de NaOH ou HCl, conforme apropriado.
    NOTA: NaOH / HCl para ajuste de pH deve ser adicionado ao AUM gota a gota para evitar a precipitação de sal da solução.
  3. Uma vez que o AUM tenha sido ajustado em pH, complete a solução até um volume final de 1 L com água deionizada e esterilize em autoclave.
    NOTA: Uma vez estéril, a solução pode ser armazenada por até três meses em temperatura ambiente (a solução AUM 1 deve ser descartada se houver precipitação ou nebulosidade).
  4. Separadamente, preparar a solução de AUM 2, adicionando 125 g de ureia (CH4N2O) e 2,45 g de cloreto de cálcio (CaCl2) a 400 ml de água desionizada estéril num copo estéril de 500 ml.
    NOTA: A preparação da solução de uréia de cálcio 2 resulta em uma reação endotérmica, portanto, recomenda-se que a solução de AUM 2 seja agitada e aquecida a ~ 50 ° C em uma placa quente/agitador magnético enquanto os compostos se dissolvem para evitar o congelamento.
  5. Uma vez dissolvido a ureia e o cloreto de cálcio, filtre a solução de esterilização 2 usando uma bomba de vácuo e unidades de filtro de nitrocelulose de 0.45 μM, em um frasco de vidro estéril de 500 mL. Uma vez esterilizada, a solução 2 é estável durante três meses a 4 °C ou um mês à temperatura ambiente
    NOTA: A solução de AUM 2 deve ser descartada se for observada precipitação ou nebulosidade.
  6. Em uma capela de fluxo laminar ou cabine de segurança microbiológica de Categoria II, combine assepticamente as soluções AUM 1 e 2 com 3,6 L de água deionizada estéril em um frasco aspirador de vidro estéril de 5 L. O AUM deve ser de cor amarelo pálido e transparente.
  7. Com uma pipeta serológica, retirar 50 ml do volume total de AUM e alíquota para um tubo de centrifugação de 50 ml e reservar para utilização posterior.
  8. Feche o frasco do aspirador usando um tampão de borracha ou papel alumínio e deixe-o em temperatura ambiente até que os modelos in vitro sejam montados.
  9. Remova assepticamente 10 mL de AUM da alíquota de 50 mL e reserve o restante da solução para o preparo do inóculo. Usando um medidor de pH, meça o pH da alíquota AUM de 10 mL, que deve ser ~ pH 6,1 (±0,2). O AUM preparado é estável à temperatura ambiente por cerca de um mês e deve ser descartado se ocorrer precipitação ou nebulosidade.

2. Configuração do modelo de bexiga in vitro

  1. Insira um cateter de Foley na câmara de vidro central do modelo de bexiga in vitro (esquema detalhado na Figura 1). Prenda o cateter no lugar inflando o balão com a seringa de água estéril fornecida e conecte o saco de lixo à porta do cateter.
  2. Conecte o dispositivo modelo de bexiga in vitro 45 ao reservatório AUM por meio de um tubo de conexão. Conecte a tubulação do circuito de mídia à bomba peristáltica de acordo com as instruções do fabricante, garantindo que a tubulação tenha tensão adequada sem ser esticada.
  3. Anexe modelos de bexiga in vitro a suportes de fixação e prenda os sacos de lixo em suportes abaixo dos modelos para garantir o fluxo através dos modelos por gravidade .
  4. Conecte a câmara externa do modelo de bexiga a um banho-maria circulante por meio de tubo de silicone (Figura 1B). Colocar o banho-maria em lume a 37 °C e ligar as bombas de circulação.
    1. Execute banhos-maria por 30 minutos antes de inocular modelos de bexiga in vitro para garantir que a temperatura seja estável a 37 ° C e garantir que o banho-maria permaneça cheio até o nível de água apropriado durante a experimentação.
  5. Remova todos os grampos da tubulação de mídia e configure as bombas peristálticas para funcionar a aproximadamente 0.75 mL/min para replicar a produção de urina humana (~1080 mL/dia). As taxas de fluxo reais serão calculadas durante a experimentação.
  6. Execute o AUM através dos modelos de bexiga in vitro através da bomba peristáltica por 30 minutos antes da inoculação para confirmar que o fluxo do meio está em uma taxa consistente e que o sistema de drenagem estéril está intacto.
  7. Drene qualquer mídia acumulada do saco de lixo antes da experimentação. O volume do meio pode ser medido para calcular as taxas de fluxo exatas (detalhadas na etapa 4).

3. Inoculação de modelos de bexiga in vitro

  1. Prepare culturas noturnas para modelos de bexiga in vitro , suspendendo um loop cheio de colônias bacterianas cultivadas em ágar sólido em 10 mL de caldo LB. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação.
    NOTA: O modelo de bexiga in vitro pode ser usado para estudar uma variedade de patógenos CAUTI, incluindo cepas positivas para urease, como Proteus mirabilis, e o meio de crescimento usado pode ser modificado de acordo.
  2. Centrifugue todo o volume da cultura durante a noite a 4.500 x g durante 10 min à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 ml de AUM e medir a absorvância a595 nm de diâmetro externo utilizando um espectrómetro.
  3. Normalizar as culturas ressuspensas para uma DOde 595 nm de 1,0 e um volume final de 10 ml em AUM, utilizando a seguinte equação:
    figure-protocol-1
    onde, A1 é a absorbância em OD600 nm da cultura noturna, A2 é a absorbância desejada em OD600 nm do inóculo (1,0), V2 é o volume desejado do inóculo (10 mL) e V1 é o volume necessário de cultura noturna para normalização.
    NOTA: 10 mL de uma suspensão OD595 nm 1.0 garantirão que os modelos sejam inoculados com aproximadamente 1010 UFC da maioria das cepas bacterianas (validadas para Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus), replicando uma infecção estabelecida. O inóculo inicial pode ser modificado dependendo da espécie usada ou do estágio da infecção que está sendo modelado (ou seja, uma densidade de inóculo mais baixa pode ser usada para simular a infecção em estágio inicial)47.
  4. Esterilize modelos de bexiga in vitro usando etanol a 70% e remova a rolha (entrada do meio) para que a câmara interna fique acessível. Remova 10 mL de AUM do volume dentro do modelo de bexiga usando uma pipeta sorológica.
    NOTA: Ao inocular e amostrar modelos in vitro da câmara central, certifique-se de que o trabalho seja rápido e asséptico, sempre use EPI apropriado e descontamine regularmente as luvas e superfícies com etanol a 70%.
  5. Inocular os modelos de bexiga in vitro através da câmara central utilizando toda a suspensão normalizada de 10 ml e misturar bem com uma pipeta serológica. Remover 10 mL da câmara central dos modelos de bexiga in vitro usando uma pipeta sorológica e alíquota em um universal de 15 mL para cálculos posteriores de UFC/mL e medição de pH.
  6. Descontamine completamente as superfícies externas do modelo de bexiga e tampão com etanol 70% e substitua a rolha. Retome o fluxo de mídia brevemente para garantir que o nível de AUM na câmara central atinja o orifício do olho, antes de interromper o fluxo.
  7. Permita que as culturas se estabeleçam no modelo de bexiga por 1 h antes de ligar o fluxo de meio através da bomba peristáltica a ~ 0,75 mL / min.
  8. Enquanto o inóculo se estabelece, preparar diluições a partir da amostra retirada da câmara central.
    1. Diluir em série 100 μL de amostra em 900 μL de PBS estéril até que a amostra seja diluída para 10-7. Colocar 10 μl de manchas das diluições em triplicado em meios sólidos apropriados e incubar a 37 °C durante a noite.
    2. Após a incubação, contar as colónias em cada placa de diluição e calcular o UFC/ml exacto do inóculo inicial.
      NOTA: Se estiver usando espécies que enxameiam, ou seja, Proteus mirabilis, use ágar MacConkey sem sal (peptona 20,0 g / L, lactose 10,0 g / L, sais biliares 5,0 g / L, vermelho neutro 0,075 g / L e ágar 12,0 g / L) para garantir que as colônias individuais ainda sejam visíveis para facilitar a contagem.
  9. Após 1 h de incubação, ligue o fluxo de meio através da bomba peristáltica para começar a executar modelos de bexiga in vitro , observando o tempo em que os modelos são ligados.

4. Cálculo da taxa de fluxo do modelo de bexiga in vitro

  1. Uma vez que os modelos in vitro tenham sido inoculados e o fluxo de meio iniciado, permita que os modelos funcionem por 4 h. Pause brevemente o fluxo do meio e colete todo o volume de AUM residual do saco de resíduos em um balão volumétrico através da porta de drenagem. Observe o volume coletado.
    NOTA: A vazão pode ser calculada a partir do volume de mídia coletado na etapa 2.7., no entanto, taxas de vazão mais precisas podem ser obtidas executando modelos por mais tempo (ou seja, 4 h recomendados), pois isso reduz a probabilidade de ar residual na tubulação do circuito de mídia afetar a vazão calculada.
  2. Retome o fluxo de fluidos através da bomba peristáltica, garantindo que a porta de drenagem do saco de lixo esteja fechada, para manter um sistema de drenagem estéril.
  3. Para calcular a vazão real de modelos in vitro , use a seguinte equação:
    figure-protocol-2
    NOTA: Taxas de fluxo na faixa de 0,55-1,0 mL / min são recomendadas para replicar a produção de urina humana.
  4. Se a taxa de fluxo de mídia for calculada fora da faixa aceitável, descarte a réplica e ajuste a rpm na bomba peristáltica para caber dentro da faixa aceitável.

5. Amostragem de células planctônicas do modelo de bexiga in vitro

NOTA: Modelos de bexiga in vitro devem ser amostrados rotineiramente durante a experimentação para monitorar a dinâmica populacional. Todos os modelos devem ser amostrados imediatamente após a inoculação, no ponto de ativação do fluxo AUM, 4 h após a inoculação (quando a taxa de fluxo é calculada) e no ponto em que os modelos são encerrados (bloqueio ou um ponto final predeterminado). Se estiver executando modelos por >24 h, recomenda-se que as amostras sejam coletadas a cada 24 h para monitorar UFC/mL, e amostras adicionais podem ser coletadas conforme exigido pelos usuários.

  1. Descontaminar a rolha modelo bexiga com etanol 70% e retirá-la para acessar a câmara central.
  2. Evitando a ponta do cateter e o balão, misture suavemente o conteúdo da câmara central usando uma pipeta sorológica.
  3. Usando uma pipeta sorológica, remova uma amostra de 10 mL da câmara e transfira-a para um tubo estéril. Descontaminar imediatamente a rolha com etanol a 70% e substituir, completando o circuito de drenagem estéril e fechado.
  4. Remova 1 mL da amostra usando uma pipeta e alíquota em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para diluições em série.
  5. Meça o pH da amostra restante usando um medidor de pH, garantindo que a amostra esteja completamente misturada e que o medidor de pH seja calibrado antes do uso.
  6. Diluir em série a alíquota reservada de 1 ml da amostra e colocar em placas sobre o meio sólido adequado, conforme descrito anteriormente no passo 3.8, retirando todas as diluições.
    NOTA: Amostras planctônicas retiradas do modelo de bexiga são apropriadas para outras análises, incluindo aplicações genômicas ou de biologia molecular (opcional).

6. Amostragem de células associadas ao biofilme do modelo de bexiga in vitro

  1. Remoção e preparação do cateter
    NOTA: A amostragem de biofilme de modelos de bexiga in vitro é uma análise de endpoint, exigindo a desativação de modelos e a remoção de cateteres para processamento.
    1. Desconecte o saco de lixo do cáteto e drene qualquer urina residual do modelo esvaziando o balão. Remova o cateter da parte inferior do modelo usando uma pinça estéril.
    2. Coloque o cateter removido em uma placa estéril e, usando um bisturi estéril, corte o cateter nos pontos necessários para seccionamento (descritos na Figura 2).
    3. Certifique-se de que as seções do cateter sejam cortadas longitudinalmente para expor o lúmen; em seguida, usando uma pinça estéril, mergulhe a seção do cateter 3 vezes em PBS estéril para remover as células não aderentes.
      NOTA: Se as seções do cateter de imagem a jusante, ou seja, usando MEV, deixe as seções de 1 cm intactas (não corte longitudinalmente) e, em vez disso, remova o excesso de umidade do lúmen com uma toalha de papel estéril antes da fixação.
  2. Ruptura do biofilme para enumeração de UFC/mL
    NOTA: Protocolos detalhando a ruptura de células associadas ao biofilme podem exigir otimização adicional se os biofilmes forem extensivamente cristalinos ou mucóides.
    1. Incube a seção do cateter preparada em tripsina a 0,25% a 37 ° C por 30 min. O volume de tripsina utilizado deve ser o mínimo necessário para cobrir o cateter; por exemplo, para uma seção de cateter de 1 cm cortada perpendicularmente, 1 mL de tripsina a 0.25% é suficiente.
    2. Após a incubação, sonicar a solução contendo o cateter por 10 min. A seção do cateter pode então ser removida e descartada. Para desativar a tripsina, a solução celular deve ser imediatamente diluída em PBS estéril e semeada para contagem de UFC em meio sólido apropriado, conforme descrito anteriormente na etapa 3.8.
  3. Quantificação de biofilme do cateter por meio de coloração violeta cristalina
    1. Adicione as seções de cateter preparadas aos poços em uma placa de fundo plano de tamanho apropriado. Use um volume apropriado de solução de cristal violeta a 0,1% para submergir completamente a seção do cateter e incube estaticamente em temperatura ambiente por 15 min. Certifique-se de que uma seção de cateter estéril também esteja incluída como controle de fundo.
    2. Remova as seções do cateter da placa e transfira para uma nova placa. Lave cada seção do cateter duas vezes em água destilada.
    3. Após o enxágue, transfira as seções do cateter para uma nova placa e cubra com ácido acético a 33%. Incubar por 15 min em temperatura ambiente.
    4. Remova a seção do cateter da placa e, em seguida, usando um leitor de placas, meça OD595 nm para cada replicação, usando os alvéolos que continham as seções estéreis do cateter como controles de fundo.

7. Teste de suscetibilidade antimicrobiana no modelo de bexiga in vitro

NOTA: A maioria das terapias destinadas a controlar a infecção do trato urinário associada ao cateter é compatível com os cateteres de Foley padrão, verifique a compatibilidade antes de iniciar os experimentos com modelos de bexiga in vitro .

  1. Géis lubrificantes antimicrobianos
    NOTA: Para simular o uso de agentes lubrificantes na inserção do cateter, esta etapa deve ser realizada durante a etapa 2.1, imediatamente antes da inserção do cateter de Foley. Após a inserção do cateter, o modelo deve ser conectado imediatamente, e passo 2.6. deve ser omitido para que o gel não seja diluído e drenado antes da inoculação. A inoculação deve ocorrer no mesmo dia da inserção do cateter. Os agentes lubrificantes projetados para uso com cateteres são embalados como seringas individuais, estéreis e de uso único com volume de 6 mL ou 11 mL. Aproximadamente 5 mL de lubrificante são adequados para preencher o colo do modelo de bexiga e revestir a base do modelo.
    1. Usando a técnica asséptica, insira a extremidade da seringa contendo o agente lubrificante no colo do modelo de bexiga e insira 5 mL de gel para preencher o gargalo e entrar na base da câmara.
    2. Gire o modelo para que a base fique uniformemente revestida com gel e, em seguida, insira um cateter de Foley no modelo empurrando a ponta do cateter através do gel e prenda enchendo o balão normalmente.
    3. Conecte o modelo ao restante da configuração e encha o lúmen do modelo com urina até que comece a drenar. Assim que a urina começar a drenar pelo orifício do cateter, pare a bomba para evitar a perda de gel antes da inoculação.
      1. Incube os modelos por 30 min para permitir que a urina atinja 37 ° C e, em seguida, inocule os modelos conforme descrito anteriormente para garantir a uniformidade do tempo de difusão dos componentes do gel no volume de urina.
    4. Inocular o modelo conforme descrito no passo 3.5 e deixá-lo incubar durante 1 h antes de ligar as bombas peristálticas. No momento de ligar a bomba, pegue uma amostra planctônica de 1 mL e diluições em placas para contagens de UFC, conforme descrito na etapa 3.8.
  2. Soluções de irrigação
    NOTA: As soluções de irrigação geralmente estão disponíveis a granel ou como "bolsas" individuais, estéreis e de uso único. Se estiver usando soluções individuais, certifique-se de que sejam compatíveis com as portas de drenagem dos cateteres a serem usados antes da experimentação. Se estiver usando soluções de irrigação a granel, certifique-se de que cateteres de lúmen triplo sejam usados e que as instruções do fabricante sejam seguidas para determinar o volume/prazo de administração do produto.
    1. Antes do tratamento, execute modelos in vitro por pelo menos 4 h para garantir que as comunidades associadas ao biofilme tenham tempo adequado para se estabelecer. Depois de os modelos terem funcionado durante 4 h, faça uma pausa no fluxo do meio e retire uma amostra de pré-tratamento da câmara interna dos modelos in vitro , conforme detalhado no passo 5.
      NOTA: Se estiver usando soluções de irrigação a granel, prossiga para a etapa 7.2.5.
    2. Se estiver usando uma "bolsa" de irrigação individual, desconecte o saco de lixo do cateter e use a tampa fornecida com a bolsa para selar o saco de lixo. Conecte imediatamente a bolsa de solução de irrigação ao cateter e, usando uma leve pressão, esprema o produto no lúmen central. Aplique conforme indicado pelas instruções do fabricante (ou seja, aplicação de 15 minutos).
    3. Uma vez concluído o tratamento recomendado, deixe a solução residual escorrer da câmara interna através do orifício do olho do cateter para a bolsa de irrigação e, em seguida, desconecte a bolsa. O conteúdo restante da bolsa pode ser descartado ou usado para outras aplicações a jusante.
    4. Esterilize a porta de drenagem do cateter e a porta de conexão do saco de lixo com etanol a 70% e reconecte-as, completando um sistema de drenagem estéril e fechado.
      NOTA: Continue para a etapa 7.2.7 se estiver usando bolsas de irrigação.
    5. Se estiver usando um cateter de lúmen triplo, desinfete a porta do lúmen de irrigação com etanol a 70% e comece imediatamente a irrigar usando uma seringa estéril de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Meça o volume de urina residual no saco de resíduos antes de irrigar para que isso possa ser contabilizado em qualquer tempo de bloqueio a jusante ou cálculos de taxa de fluxo.
    6. Quando a irrigação estiver concluída, descarte a seringa e qualquer solução de irrigação residual deixada no saco de resíduos.
    7. Pegue uma amostra pós-tratamento da câmara central do modelo de bexiga in vitro , conforme detalhado na etapa 5, e retome o fluxo de AUM através da bomba peristáltica para continuar a experimentação.

8. Terminando a experimentação do modelo de bexiga in vitro

NOTA: Organismos positivos para urease, como P. mirabilis , podem causar bloqueio de cateteres urinários por meio da formação de biofilme cristalino. O bloqueio pode, portanto, ser usado como um desfecho biologicamente relevante para modelos de bexiga in vitro e é identificado visivelmente pela oclusão completa dos orifícios oculares do cateter com biofilmes cristalinos e um aumento no volume de AUM na câmara central da "bexiga" de vidro (Figura 3).

  1. Uma vez que os modelos de bexiga in vitro tenham corrido até o ponto final predeterminado, que pode ser um bloqueio ou um tempo de execução definido, desligue o fluxo de AUM através da bomba peristáltica e colete uma amostra de ponto final da câmara central, conforme descrito na etapa 5.
  2. Desligue o fluxo do banho-maria e desconecte o circuito de mídia e a tubulação do circuito do banho-maria dos modelos de bexiga in vitro .
  3. Remova as rolhas dos modelos de bexiga in vitro e remova todo o volume de urina residual usando uma pipeta sorológica. Descarte qualquer mídia contaminada adequadamente (ou seja, esterilize em autoclave).
  4. Escorra os sacos de lixo e descarte qualquer meio residual. Desconecte os sacos de resíduos do cateter da porta do cateter e descarte-os.
  5. Usando uma seringa, esvazie lentamente os balões do cateter antes de removê-los dos modelos.
    NOTA: Se estiver usando espécies bacterianas positivas para urease, os cateteres podem ficar "presos" às paredes de vidro dos modelos in vitro . Evite aplicar grandes quantidades de força aos cateteres e, em vez disso, prossiga para a etapa 8.6.
  6. Mergulhe os modelos in vitro em solução de limpeza antimicrobiana a 5% (consulte a Tabela de Materiais) durante a noite e, em seguida, lave bem com água para garantir que qualquer desinfetante residual seja removido. Autoclave para esterilizar.
    NOTA: Se estiver usando espécies positivas para urease, adicione 5% p / v de ácido cítrico à solução desinfetante para ajudar a dissolver qualquer biomineralização na câmara central. Esta solução ácida também ajudará a liberar quaisquer cateteres que tenham ficado presos aos modelos, quebrando os depósitos de biofilme cristalino.
  7. Desconecte a tubulação do circuito de mídia do reservatório AUM e descarte qualquer mídia residual. Lave através da tubulação com água para remover qualquer AUM residual e autoclave.
  8. Para calcular o tempo exato de bloqueio, anote o volume final no saco de lixo e use a equação na etapa 4.4 e a taxa de fluxo calculada anteriormente para determinar o tempo de bloqueio.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A operação bem-sucedida do modelo de bexiga in vitro depende da prática de uma boa técnica asséptica e da observação cuidadosa da turbidez do meio durante a experimentação (Figura 3). Antes da inoculação, o AUM estéril era de cor amarelo pálido e transparente na câmara central do modelo de bexiga in vitro (Figura 3A). O AUM no reservatório do meio deve permanecer claro durante toda a experimentação, pois quaisquer alterações de turbidez que ocorram podem indicar precipitação de sais da solução ou contaminação do meio. Se o AUM no reservatório de mídia ou na tubulação do circuito de mídia ficar turvo ou mostrar uma mudança drástica na cor, as réplicas devem ser descartadas e repetidas. Após a inoculação, um aumento na turbidez do AUM na câmara central do modelo de bexiga in vitro é claramente visível ( Figura 3B ). Mudanças na turbidez são frequentemente mais pronunciadas em organismos positivos para urease, como P. mirabilis, mas ainda devem ser visíveis após a inoculação em organismos negativos para urease. Após o início do fluxo de AUM, uma redução na turbidez do AUM é frequentemente observada à medida que as células planctônicas são eliminadas e não indica falta de células viáveis no modelo. A observação do nível do meio na câmara central também pode ser usada para determinar o tempo de bloqueio se forem utilizados organismos positivos para urease (Figura 3C). À medida que os modelos estão funcionando, o orifício e a ponta do cateter devem estar completamente visíveis para indicar a drenagem adequada para os sacos de lixo. Após o bloqueio, o nível de AUM na câmara central subirá acima dos orifícios e da ponta do cateter, indicando que o experimento está pronto para qualquer leitura e término do ponto final. Durante a experimentação, os efeitos da pressão no circuito de mídia do modelo da bexiga in vitro podem fazer com que os modelos pareçam bloqueados. Se houver suspeita de bloqueio, verifique se o circuito AUM, o cateter e a tubulação do saco de resíduos estão esticados antes de encerrar o ensaio, pois quaisquer bolhas de ar ou dobras potenciais na tubulação podem causar "eclusas de ar" e impedir a drenagem do cateter.

Durante experimentos de modelo de bexiga in vitro , a amostragem planctônica pode fornecer informações valiosas sobre a dinâmica de crescimento dentro do modelo, bem como a progressão do CAUTI. O crescimento celular, o pH e a formação de biofilme podem ser monitorados durante a experimentação sem a necessidade de encerrar os modelos (Figura 4). Se estiver usando organismos positivos para urease, os cálculos do tempo de bloqueio podem ser utilizados como uma medida da taxa de formação de biofilme e usados para comparar as propriedades de diferentes cepas bacterianas (Figura 4). A comparação de uma cepa de tipo selvagem de P. mirabilis e um mutante LPS (mini-tn5 inserção em waaC) demonstrou uma extensão do tempo de bloqueio e, portanto, reduziu a formação de biofilme no mutante (Figura 4). Organismos negativos para urease normalmente não bloqueiam modelos de bexiga in vitro e, portanto, recomenda-se que um ponto final definido seja determinado antes da experimentação. Em alguns casos, organismos negativos para urease podem resultar em bloqueio do cateter. Por exemplo, cepas negativas de urease de Klebsiella pneumoniae podem produzir biofilmes mucoides extensos, no entanto, eles geralmente levam muito mais tempo do que os biofilmes positivos para urease para bloquear a drenagem, portanto, um ponto final definido ainda é recomendado.

A medição do pH durante a experimentação do modelo da bexiga também pode fornecer informações sobre as diferenças entre cepas, bem como o progresso do CAUTI. Se forem utilizados organismos negativos para urease, o pH na câmara central do modelo de bexiga in vitro deve permanecer estável durante a experimentação, embora pequenas flutuações no pH sejam esperadas à medida que a dinâmica populacional muda ao longo do experimento. A inoculação de modelos in vitro com organismos positivos para urease resulta em um aumento significativo do pH ao longo do tempo, com o pH mais alto geralmente sendo observado no momento do bloqueio, onde leituras de pH tão altas quanto ~ 8-9 podem ser observadas ( Figura 4B ).

A enumeração de UFC/mL planctônica é um componente importante da modelagem da bexiga in vitro , permitindo que os operadores avaliem se a inoculação foi bem-sucedida e monitorem o progresso da experimentação. A medição de UFC/mL no final da experimentação pode destacar quaisquer diferenças na colonização da bexiga entre diferentes cepas bacterianas. Ao comparar a cepa mutante mini-Tn5 de P. mirabilis com a selvagem, foi observada uma redução significativa na UFC/mL no momento do bloqueio (Figura 4C). Além disso, a enumeração de UFC de biofilmes na superfície do cateter e a quantificação da biomassa do biofilme podem fornecer informações sobre a capacidade de diferentes patógenos de colonizar o trato urinário cateterizado. Corantes de cristal violeta foram usados para determinar diferenças na formação de biofilme entre uma cepa de P. mirabilis de tipo selvagem HI4320 e isolados passados em clorexidina (Figura 5). Medições de densidade óptica a 595 nm demonstraram que os isolados passados na clorexidina exibiram uma redução na formação de biofilme em comparação com os selvagens e controles passados na ausência de clorexidina.

Como o objetivo do modelo de bexiga in vitro é replicar com precisão o nicho CAUTI, os modelos também podem ser utilizados para estudar os efeitos da terapêutica antimicrobiana destinada a tratar CAUTI em um ambiente clinicamente relevante. Para organismos positivos para urease, comparar os tempos de bloqueio de modelos tratados com modelos não tratados pode fornecer informações úteis sobre a eficácia do tratamento. O tratamento de modelos de bexiga in vitro inoculados com P. mirabilis com uma solução de irrigação de bexiga com clorexidina a 0,02% estendeu significativamente o tempo de bloqueio em comparação com modelos que não foram tratados ou tratados com solução salina a 0,9% (Figura 6A). Além disso, o modelo de bexiga in vitro pode ser utilizado para estudar a atividade bactericida de terapêuticas antimicrobianas. O monitoramento de alterações na UFC/mL de células planctônicas e associadas ao biofilme após o tratamento antimicrobiano pode indicar se os tratamentos são eficazes. O tratamento de modelos de bexiga in vitro inoculados com P. mirabilis demonstrou uma redução de >7 log na UFC/mL planctônica imediatamente após o tratamento, em comparação com modelos não tratados e irrigados com solução salina a 0,9% quando aplicados de acordo com as instruções do fabricante (Figura 6B).

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Figura 1: Esquema dos principais componentes do modelo de bexiga in vitro . (A) O modelo de bexiga (sistema de drenagem fechado): (1) câmara de vidro de parede dupla simulando a bexiga (2) entrada de meio, AU é fornecida via bomba peristáltica para a câmara interna do modelo de bexiga (3) entrada de água fornecida via banho-maria circulante para a câmara externa (4) saída de água (5) cateter de Foley, inserido na câmara interna (6) ponto de conexão do lúmen de drenagem; ponto de conexão para saco de lixo/bolsas de irrigação (7) saco de drenagem coletando o fluxo de urina. (B) Esquema que descreve a configuração do modelo de bexiga in vitro e a direção do fluxo de meio e água através do modelo. A urina artificial é armazenada em um reservatório de mídia (1) à temperatura ambiente e fornecida ao modelo por meio de uma bomba peristáltica (2) a uma taxa de fluxo constante de ~ 0,75 mL min-1 durante o experimento. O meio flui para a câmara central do vaso de vidro de parede dupla que representa a bexiga (3) e drena através do orifício do olho de um cateter de Foley (4) para uma bolsa de drenagem (5), completando o sistema de drenagem fechado estéril. O modelo de bexiga in vitro é mantido a uma temperatura constante de 37 °C através de um banho-maria circulante (6), que flui através da câmara exterior do recipiente de vidro de parede dupla. As linhas tracejadas representam tubos de silicone e as setas representam a direção do fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Secção de cateteres urinários para processar células associadas ao biofilme. Pontos de exemplo em um cateter urinário para dissecção para quantificação de biofilme a jusante. (A) Os cateteres são primeiro seccionados latitudinalmente na região de 8 cm proximal à ponta/orifícios oculares (onde se observa a maior parte da formação de biofilme). Cortes de 1 cm são removidos com bisturi, geralmente evitando a região que contém o balão do cateter desinsuflado devido às dificuldades de reprodutibilidade do processamento (1-3). (B) Uma vez que os cateteres são inicialmente seccionados em pedaços de 1 cm, outro corte longitudinal é feito no lúmen central para expor qualquer biofilme presente para posterior quantificação do biofilme, ou seja, enumeração de UFC / mL de coloração violeta de cristal. As linhas tracejadas representam pontos de dissecação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Estágios de um experimento em modelo de bexiga in vitro . Imagens da câmara central modelo de bexiga in vitro , ao longo de diferentes estágios de experimentação. (A) AUM na câmara central do modelo de bexiga in vitro antes da inoculação. O meio na câmara central é completamente transparente, indicando esterilização bem-sucedida, e a ponta do cateter e os orifícios dos olhos são visíveis acima da linha do meio, indicando que o cateter está drenando com sucesso. (B) Meio na câmara central do modelo de bexiga in vitro após a inoculação com P. mirabilis (4 h pós-inoculação). A inoculação bem-sucedida é indicada pelo aumento da turbidez do meio. A visibilidade da ponta do cateter e dos orifícios dos olhos indica que o AUM está sendo drenado com sucesso através do cateter e que o bloqueio não ocorreu. (C) Um exemplo de um modelo de bexiga bloqueada in vitro . A inoculação com P. mirabilis e a subsequente formação e mineralização de biofilme resultaram no bloqueio dos orifícios oculares do cateter, impedindo a drenagem e fazendo com que o nível do meio na câmara central subisse acima da ponta do cateter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: As medições finais para um modelo de bexiga in vitro são executadas até o bloqueio. Exemplo de medições de endpoint no momento do bloqueio de um modelo de bexiga in vitro inoculado com uma cepa clínica de P. mirabilis, RS47 (WT), e uma cepa mutante com formação de biofilme atenuada, RS47-2 (Mutante). (A) Tempo de bloqueio (h) de WT e cepas mutantes de P. mirabilis. (B) pH de modelos de bexiga in vitro no momento do bloqueio. (C) UFC/mL de células planctônicas em câmara modelo de bexiga in vitro no momento do bloqueio. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram o erro padrão da média (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Essa figura foi modificada de Clarke et al.46. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Medições de células associadas ao biofilme do modelo de bexiga in vitro . Quantificação da formação de biofilme de P. mirabilis , comparando a cepa selvagem HI4320 com populações adaptadas passadas com ou sem clorexidina (CHD) por meio de coloração violeta de cristal e medição da densidade óptica (OD) a 595 nm. PESO: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controles de passagem sem exposição a DCC; 2, 4, 6: HI4320 passou em 4 μg/mL CHD. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Medições de modelos de bexiga in vitro após tratamento antimicrobiano. Amostras planctônicas foram retiradas de um modelo de bexiga in vitro inoculado com P. mirabilis, após irrigação com solução antimicrobiana de clorexidina a 0,02% (100 mL) ou controle salino a 0,9%. (A) Tempo de bloqueio de modelos de bexiga in vitro após irrigação. (B) UFC/mL planctônica imediatamente após o tratamento de irrigação. Todos os dados representam a média de cinco repetições biológicas. As barras de erro mostram SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trato urinário cateterizado representa um nicho biológico complexo que pode ser difícil de replicar em um ambiente de laboratório. O modelo de bexiga in vitro foi projetado com o objetivo de simular CAUTI e utiliza cateteres urinários padrão para replicar o sistema de drenagem estéril e fechado usado na prática clínica. O trato urinário cateterizado é altamente suscetível à infecção, como evidenciado pelo fato de os cateteres vesinários serem o maior fator de risco para o desenvolvimento de CAUTI 6,55. Proporcionalmente, a técnica asséptica cuidadosa é fundamental para o sucesso da execução de modelos de bexiga in vitro. A turbidez do AUM é um indicador claro de esterilidade, pois os meios contaminados ou vencidos ficarão turvos com o tempo, exigindo que todas as réplicas sejam descartadas. Uma técnica asséptica cuidadosa também deve ser utilizada ao inocular e amostrar o modelo de bexiga in vitro, pois a abertura da câmara central para adicionar o inóculo preparado quebra o sistema de drenagem estéril e fechado, tornando o modelo de bexiga in vitro suscetível à contaminação. Para evitar a contaminação da câmara central, cateteres de lúmen triplo podem ser utilizados para amostrar a população de células planctônicas (apertando o lúmen residual e drenando através do lúmen adicional). Espera-se alguma lavagem no ponto de tempo de 4 horas, mas a solução de problemas pode ser necessária se nenhuma célula planctônica viável for enumerada neste ponto. Se nenhuma célula viável for enumerada após 4 h, a densidade do inóculo ou a formulação de AUM utilizada pode precisar ser otimizada para melhor suportar a colonização bacteriana. Além disso, a lavagem do inóculo pode indicar um problema com o circuito do meio; dobras dentro do tubo podem impedir a drenagem adequada, resultando no acúmulo de metabólitos tóxicos que podem impedir o crescimento bacteriano, enquanto qualquer desinfetante residual usado para lavar através do tubo de mídia pode ter um efeito bactericida.

Este protocolo detalha a preparação de AUM conforme descrito anteriormente por Nzakizwanayo et al., pois foi previamente validado para uso no modelo de bexiga in vitro com patógenos CAUTI proeminentes, incluindo Proteus mirabilis e Escherichia coli 43,45,46,48 . No entanto, há espaço para modificar a formulação de AUM utilizada no protocolo para selecionar o crescimento de outros patógenos. Numerosas formulações AUM diversas foram publicadas e podem ser usadas no circuito de mídia 28,56,57,58,59,60. Além disso, o AUM no reservatório de mídia pode ser suplementado com nutrientes ou antibióticos para selecionar o crescimento de patógenos específicos. Historicamente, os modelos de bexiga in vitro também foram fornecidos com urina humana combinada, no entanto, os grandes volumes de meios necessários para executar uma réplica de modelo de bexiga in vitro podem tornar a coleta de amostras humanas impraticável53,54. Além disso, a composição da urina humana pode variar muito entre as amostras dos pacientes, afetando a reprodutibilidade do experimento, pois as diferenças na concentração de hormônios, sais e proteínas, bem como o estado de hidratação, demonstraram afetar o crescimento bacteriano e a formação de biofilme 38,39,61,62.

O protocolo acima detalha a inoculação do modelo de bexiga in vitro com ~ 1010 UFC / mL replicando CAUTI em estágio avançado. No entanto, o local de inoculação do modelo de bexiga in vitro pode ser modificado em ensaios futuros para melhor replicar os estágios iniciais da CAUTI, ou seja, colonização inicial do cateter urinário e ascensão para a bexiga. A contaminação manual dos cateteres de Foley com um inóculo bacteriano conhecido antes da configuração dos modelos in vitro pode fornecer informações sobre os estágios iniciais da CAUTI. De fato, a densidade do inóculo foi modificada em trabalhos anteriores para replicar a infecção em estágio inicial; por exemplo, Nzakizwanayo et al. inoculados in vitro modelos de bexiga com menor UFC/mL inicial (ca. 103 UFC/mL) para replicar a infecção em estágio inicial47. No entanto, vale a pena notar que a alteração da densidade do inóculo pode resultar em maior tempo de bloqueio e requer validação adicional antes da experimentação.

Além disso, embora o protocolo detalhe a inoculação do modelo in vitro com monocultura bacteriana, há espaço para inocular modelos com patógenos fúngicos. Trabalhos anteriores sugeriram que até 8% das CAUTIs resultam da infecção por Candida spp., que são capazes de produzir biofilmes que muitas vezes são recalcitrantes ao tratamento antifúngico27,63. Além disso, o modelo de bexiga in vitro pode ser modificado para acomodar o estudo de CAUTI polimicrobiana. De fato, tem sido sugerido que até 86% das CAUTIs são polimicrobianas, e essas infecções estão frequentemente associadas a sintomas mais graves e a uma taxa de mortalidade mais alta do que a infecção por monoespécie 27,64,65,69. Modelos in vitro podem ser inoculados com várias espécies para estudar a formação de biofilmes polimicrobianos e a progressão de CAUTI, mas a validação cuidadosa das comunidades polimicrobianas e a modificação da densidade do inóculo devem ser realizadas antes da inoculação. Estudos anteriores utilizaram o modelo de bexiga in vitro para monitorar as diferenças na formação de biofilme em uma única espécie P. mirabilis CAUTI em comparação com CAUTI de espécie dupla com E. faecalis, destacando a interação metabólica entre as cepas, o que resultou em maior formação de biofilme em comparação com a infecção de uma única espécie70.

Uma grande vantagem de usar o modelo de bexiga in vitro para estudar CAUTI é a capacidade de observar a formação de biofilme na superfície de um cateter urinário padrão. A formação de biofilmes no CAUTI é frequentemente iniciada pela formação de filmes condicionantes no lúmen do cateter, compostos por componentes orgânicos da urina aos quais os uropatógenos podem aderir, antes de proliferar e formar biofilmes maduros 2,18,71,72,73. Os ensaios padrão usados para estudar a formação de biofilme geralmente utilizam meios de crescimento bacteriano padrão em vez de AUM e geralmente são baseados na adesão a microplacas ou pinos de poliestireno, ou seja, o dispositivo Calgary; no entanto, trabalhos anteriores sugeriram que o ambiente de nutrientes, pH e níveis de oxigênio do sistema, bem como propriedades físicas, como fluxo e diferença na estrutura da superfície (silicone vs plásticos), podem afetar a formação de biofilme 36,37,74,75,76,77,78. Além disso, a cultura de bactérias com extensa atividade de urease, como P. mirabilis em um sistema fechado em AUM, pode resultar no acúmulo de metabólitos tóxicos, o que pode resultar em morte celular78,79. Isso é mitigado no modelo de bexiga in vitro, pois o AUM na câmara central é constantemente substituído por meio fresco através do circuito de meios, permitindo o estudo de biofilmes de CAUTI em condições clinicamente mais relevantes45. O funcionamento diário do modelo de bexiga in vitro e o ponto final selecionado para os modelos dependem em grande parte se os modelos são inoculados com organismos positivos ou negativos para urease. Teoricamente, os modelos in vitro poderiam funcionar indefinidamente se fornecidos com um volume adequado de AUM e se a esterilidade do modelo for mantida; No entanto, é recomendável que um endpoint seja selecionado antes da experimentação, seja um bloqueio ou um número arbitrário de dias. Geralmente, recomenda-se que os modelos in vitro inoculados com organismos negativos para urease sejam executados por ≤7 dias para simular o ambiente clínico, pois isso normalmente é suficiente para observar a formação de biofilme na maioria dos organismos, mantendo-se em linha com as intervenções clínicas, pois as melhores práticas padrão indicam que os cateteres devem ser substituídos uma vez visivelmente infectados 1,2, 3,47,48. Embora os organismos positivos para urease provavelmente produzam biofilmes cristalinos, há uma grande variação dentro das cepas positivas para urease no tempo de bloqueio do modelo de bexiga in vitro, com algumas cepas de Proteus mirabilis causando bloqueio do cateter em menos de 10 h e outras levando mais de 30 h para bloquear39,46. Um teste de urease padrão pode ser usado antes da experimentação do modelo de bexiga in vitro para determinar se os modelos devem ser executados para bloqueio ou um endpoint predefinido80.

Talvez a principal limitação de usar o modelo de bexiga in vitro para estudar a formação de biofilme seja que as medições de biofilme são uma leitura final, pois exigem a remoção e dissecção do cateter urinário. Por outro lado, amostras planctônicas podem ser retiradas do modelo de bexiga in vitro em qualquer ponto durante a experimentação. Além disso, uma vez que as amostras de biofilme são retiradas dos modelos de bexiga in vitro, várias técnicas extras a jusante podem ser usadas para quantificar melhor a produção de biofilme. Estudos anteriores utilizaram fotometria de chama para quantificar a quantidade de cálcio e magnésio presentes em biofilmes cristalinos, e colorações mais complexas podem ser usadas para identificar com precisão os componentes da matriz EPS de biofilmes negativos para urease 45,73,81,82,83,84.

Este trabalho também descreve a aplicação do modelo de bexiga in vitro para estudar os efeitos da terapêutica voltada para o tratamento da CAUTI. O modelo de bexiga in vitro simula aspectos importantes do nicho CAUTI, como o uso de AUM, bem como a formação de biofilme clinicamente relevante e o aumento da carga orgânica observada no CAUTI. Terapêuticas como antibióticos podem ser adicionadas diretamente ao tanque de AUM para simular a biodisponibilidade de medicamentos clinicamente relevantes, e estudos anteriores utilizaram medicamentos reaproveitados, como tioridazina e fluoxetina, para demonstrar um efeito antibiofilme81. Além disso, ensaios de concentração inibitória mínima e testes de suspensão bacteriana são frequentemente usados para inferir a atividade antimicrobiana dos biocidas, embora haja poucas evidências que sugiram que os ensaios se correlacionem com a suscetibilidade aos biocidas do mundo real 41,85,86,87,88. O modelo de bexiga in vitro é vantajoso para o teste de produtos biocidas destinados ao tratamento ou prevenção da CAUTI, pois a presença do cateter urinário e a simulação mais representativa do nicho da CAUTI significam que produtos como géis lubrificantes antimicrobianos e soluções de irrigação podem ser testados de acordo com as instruções do fabricante. Estudos anteriores também usaram o modelo de bexiga in vitro para determinar a eficácia da terapia fágica e demonstraram que o tratamento com fagos pode estender o tempo de P. mirabilis para bloquear o modelo de bexiga in vitro em mais de 100 h47. O uso de um cateter de Foley de tamanho padrão no modelo de bexiga in vitro também significa que novos cateteres revestidos podem ser testados quanto à atividade antimicrobiana. Trabalhos anteriores de Slate et al. demonstraram que cateteres revestidos com um revestimento teranóstico de ciprofloxacina podem estender o tempo de bloqueio de P. mirabilis em ~ 60 h em um modelo de bexiga in vitro 48. Isso destaca a potencial aplicação do modelo de bexiga in vitro no estudo de novas terapêuticas destinadas ao tratamento de CAUTI, permitindo uma avaliação mais precisa de antimicrobianos em um nicho de CAUTI simulado biologicamente relevante.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Jonathan Nzakizwanayo e ao Dr. Anthony J. Slate por sua experiência compartilhada no desenvolvimento deste protocolo. O trabalho na Universidade de Bath foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica GW4 Biomed DTP como uma bolsa de estudos para V.B. (MR/N0137941/1). BVJ também é apoiado por financiamento do Dunhill Medical Trust (RPGF1906 \ 171). A pesquisa da O.E.C. foi financiada pela Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). A Figura 1 é criada com Biorender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Extensão de Cabeçote de Carga Rápida 313Watson-Marlow313Bomba peristáltica - extensão extra do cabeçote 
Bomba de controle manual de velocidade variável 323S/DWatson-Marlow323S/DBomba peristáltica
3L Sacos de cama, estéreis com torneiras de alavanca Great Bear Healthcare GDW173
Tubulação de silicone curada com platina de 3 mm de diâmetro internoFisher10111801(conecte a tubulação da bomba aos modelos)
Tubulação de silicone curada com platina de diâmetro interno de 5 mmFisher10539201(conecte a tubulação da bomba ao reservatório AUM)
cloreto de amônio (NH4Cl)Fisher11473713
sulfato de sódio anidro (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Fisher10712807Usado para conectar diferentes comprimentos de tubulação no circuito AUM
Cabides de saco de cama Great Bear Healthcare 10705P
Braçadeiras de tubo de torneira de aperto Bochem, diâmetro de 25 mmCloreto de cálcio 11805101Fisher
(CaCl2)Ácidomonohidratado 10021681
 MerckC1909-500GUsado para remover biofilme cristalino de modelos pós-experimentação 
Marca Fisher  Pipetas de vidro graduadas Classe B Tipo 1Fisher11992168Usado para fornecer modelos de blader in vitro com AUM via gelatina de rolha perfurada
VWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Software analítico usado para representar graficamente os resultados do modelo de bexiga in vitro e análise estatística. 
Medidor de pH de bancada Hanna HI 2211-02Phillip Harris PP00057414
Modelo in vitro bexiga --Equipamento sob medida, conforme descrito anteriormente por Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 mL gel lubrificantemydoctorshop.co.uk40-006Géis lubrificantes utilizados no ponto 7.1.; outros fornecedores estão disponíveis.
Conector cônico irregular Kartell PlastilabFisher 11914289Usado para conectar tubos de diferentes diâmetros
Ágar MacConkey sem sal (desidratado)Fisher10472643Para a enumeração de colônias únicas de bactérias em enxame, ou seja, Proteus mirabilis
cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
fosfato monopotássico (KH2PO4)Conector
NalgeneFisher10186070Usado para executar vários circuitos AUM a partir de um reservatório AUM (1-4 modelos por tanque) 
cloreto de potássio (KCl)Fisher10375810
Pyrex Frasco Aspirador com Soquete Lateral de Vidro Moído, Capacidade: 5000 mLReservatório Fisher11347884AUM
Rolhas de borracha com furo, Diâmetro externo: 37mm, Vermelho, Diâmetro: 37mmFisher11517612Usado em reservatório AUM e para fornecer modelos in vitro com AUM
Tamanho 14 Cateter Foley de silicone francês 100% com seringa estéril de água para inflação Great Bear Healthcare 4833-0514
cloreto de sódio (NaCl)Fisher10735921
oxalato de sódio (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse concentrado limpador biocida 5L Fisher12447580Usado para esterilizar modelos pós-experimentação
citrato trissódico (Na3C6H5O7)Fisher11434993
triptona caldo de sojaFisher10198002
uréia (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Bolsa de irrigação de bexiga salina usada na seção 7.2. 
Tubo de silicone curado com platina de diâmetro interno Watson-Marlow Pumpsil de 1,6 mmFisher12406280Tubo de circuito AUM espesso (para uso em bomba perstálgica)
Tubulação de circuito AUM pequeno Tubulação de circuito AUM médio Conector cônico cítrico Fisher em forma de Y Fisher 10573181

Referências

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