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Artigo de método

Identificação de micróglia e macrófagos infiltrantes periféricos na medula espinhal lesada usando citometria de fluxo

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DOI:

10.3791/67967

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24 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

Neste artigo

Resumo

Identificar micróglia (MG) e macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) na medula espinhal lesada é difícil. Neste protocolo, a citometria de fluxo (FCM) foi usada para identificar MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente. Essa tecnologia também pode ser aplicada a outras doenças do sistema nervoso central para entender o papel da MG e da Mø.

Resumo

Em uma medula espinhal saudável, os macrófagos infiltrantes periféricos são quase indetectáveis, e a microglia (MG) participa da manutenção da estabilidade do microambiente da medula espinhal por fagocitose, limpeza de detritos celulares e produção de fatores neurotróficos. Após a lesão medular (LM), os MG são ativados e as células imunes periféricas se infiltram na medula espinhal lesionada. Dentre essas células imunes, a MG ativada e os macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) desempenham papéis cruciais no processo patológico da LM. Essas células podem ser distinguidas em fenótipos pró-inflamatórios (semelhantes a M1) e anti-inflamatórios (semelhantes a M2); no entanto, distingui-los é um desafio devido à sua semelhança na morfologia e muitos marcadores celulares. A citometria de fluxo (FCM), uma técnica amplamente utilizada no campo biomédico, pode detectar simultaneamente vários parâmetros celulares, como tamanho da célula, tamanho da partícula, superfície celular e marcadores intracelulares em um único experimento. Ao longo de anos de pesquisa, o FCM foi tentado para identificar MG e Mø na medula espinhal e foi continuamente otimizado para desenvolver um método de detecção estável. Este método permite a identificação de MG semelhante a M1 / M2 e M1 / M2 semelhante a Mø após SCI, detectando os perfis de expressão de CD45, CD11b, CD68, CCR7 e outros marcadores. Neste protocolo, as células CD11b + CD45- / CD68 + CCR7 + baixo, CD11b + CD45- / CD68 + CCR7 baixo, CD11b + CD45CD68 + CCR7 + alto e CD11b + CD45CD68 + CCR7- alto podem ser identificadas como MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente.

Introdução

A lesão medular (LM) é resultado de danos na medula espinhal causados por vários motivos. A LME apresenta alto índice de incapacidade e, atualmente, não há opções de tratamento eficazes, tornando-se um dos mais graves problemas de saúde pública do mundo 1,2. O processo fisiopatológico da LM é complexo, dividido em duas etapas. Inicialmente, o trauma mecânico da lesão causa imediatamente disfunção celular aguda e morte celular. Então, o dano secundário leva a mais disfunção celular e morte celular ao longo de dias, semanas ou até meses. Dentro dos mecanismos secundários de lesão, a inflamação provou ser um determinante chave da gravidade do dano secundário, ditando a morte celular e a funcionalidade celular3. As características das respostas inflamatórias são a infiltração e ativação de células inflamatórias dentro da medula espinhal lesada, levando a um aumento de células inflamatórias e fatores inflamatórios, criando um microambiente inflamatório e, eventualmente, causando disfunção medular4.

A microglia no sistema nervoso central (SNC) e os macrófagos infiltrantes periféricos desempenham um papel crítico na resposta inflamatória após a lesão medular (LM)5,6. Como macrófagos residentes do SNC, a microglia constitui 5% a 10% das células do SNC e é essencial para a recuperação da LME 7,8. A microglia pode engolir e remover detritos celulares após a LM, mediando a formação de cicatrizes em cicatrização 9,10. No entanto, a ativação excessiva da microglia pode levar a uma resposta inflamatória sustentada e promover a formação de cicatrizes gliais, que impedem a regeneração axonal11. Após a LME, a micróglia ativada exibe principalmente dois fenótipos: M1-like e M2-like12,13. O fenótipo M1-like é pró-inflamatório, promovendo a síntese de fatores inflamatórios que contribuem para a apoptose celular e lesão secundária. A microglia semelhante a M1 também tem efeitos neurotóxicos, exacerbando a lesão e a apoptose neuronal14,15. Em contraste, o fenótipo M2-like tem propriedades anti-inflamatórias e promove angiogênese, remielinização, crescimento axonal e reparo tecidual16,17. A microglia semelhante a M2 desempenha um papel crucial na modulação da inflamação e nos processos de reparo.

Os macrófagos periféricos infiltram-se no local da lesão após a LM através de barreiras sangue-medula espinhal danificadas e vasculatura17,18, regulando ainda mais a resposta inflamatória, fagocitose, formação de cicatrizes e regeneração do tecido neural19,20. Macrófagos infiltrantes periféricos podem reduzir a resposta inflamatória após LM, fagocitar restos teciduais21, promover regeneração neural e remodelação da matriz. No entanto, uma resposta inflamatória sustentada mediada por macrófagos infiltrantes periféricos pode levar a lesão secundária, o que é prejudicial à recuperação a longo prazo22,23. Os macrófagos infiltrantes periféricos semelhantes a M1 têm fortes habilidades fagocíticas e de apresentação de antígenos, capazes de limpar células necróticas24. No entanto, sua secreção excessiva de citocinas pró-inflamatórias, espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) pode danificar neurônios e células gliais, levando a uma apoptose neuronal mais grave25. Por outro lado, macrófagos infiltrantes periféricos semelhantes a M2 podem inibir a apoptose neuronal e mitigar a resposta inflamatória após a LME, promovendo assim o reparo do tecido neural26.

A micróglia ativada e os macrófagos infiltrantes periféricos após a LM exibem semelhanças morfológicas e de expressão molecular que os tornam difíceis de diferenciar. A citometria de fluxo (FCM), uma técnica amplamente adotada, é empregada para analisar a expressão da superfície celular e moléculas intracelulares, identificar diferentes subpopulações celulares e, simultaneamente, avaliar múltiplos parâmetros de células individuais. Um ensaio de FCM estável foi realizado para distinguir a micróglia ativada de macrófagos infiltrantes periféricos, facilitando a investigação de seus papéis na LME. Este artigo descreve o método de detecção estável que foi desenvolvido.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Cuidados com Animais da Universidade Médica de Bengbu (nº 2020-050). O cuidado com os animais cumpriu os regulamentos fornecidos pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da China. Um total de 18 camundongos C57/BL6 fêmeas de oito semanas de idade foram obtidos comercialmente e usados. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental e animal

  1. Alojar os ratos em gaiolas ventiladas antes da cirurgia. Mantenha um ciclo claro/escuro de 12 horas e forneça acesso gratuito a alimentos e água. Mantenha a temperatura ambiente em 20-22 °C e a umidade em 30%-70% por uma semana de aclimatação.
  2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos para os camundongos em autoclave e seque-os antes de usar. Submeter os instrumentos e a sala de cirurgia animal à esterilização ultravioleta meia hora antes da cirurgia. Agrupe e rotule os ratos de acordo com o princípio de agrupamento aleatório. Registre e registre seus pesos para uso posterior.
  3. Anestesiar os camundongos com um coquetel de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Raspe o cabelo nas costas das vértebras T8 a T10.

2. Preparação do modelo de camundongo SCI

  1. Desinfetar a área cirúrgica com um swab de iodo da cabeça à cauda, centrando-se em T9, seguido de desinfecção com um swab com álcool 75%. Faça uma incisão de 1 cm na pele centrada em T9. Disseque a fáscia, o músculo e os ligamentos ao redor de T9 por 1 cm.
    1. Descole o músculo adjacente ao processo espinhoso T9 para expor T9. Use uma tesoura oftálmica para descobrir e remover a lâmina entre T9 e T10, expondo totalmente a medula espinhal localizada em T9, que tem aproximadamente 2 mm de diâmetro.
      NOTA: Ao levantar a lâmina T9, certifique-se de que a tesoura não toque na medula espinhal.
  2. Estabilize a coluna clampeando os processos espinhosos de T7 e T11. Crie um modelo SCI moderado usando uma haste com um diâmetro de 1,3 mm e uma força de 0,5 N. Observe a cauda se curvando para cima e o membro posterior se contorcendo após o SCI. Para camundongos operados simuladamente, realize apenas laminectomia sem contusão.
  3. Obtenha hemostasia no local da incisão. Realize o fechamento em camadas usando suturas cirúrgicas estéreis 5-0. Para aproximação muscular, agarrar a fáscia profunda com pinça Adson com dentes e suturar a camada de panículo carnoso usando monofilamento absorvível 5-0, inserindo a agulha perpendicularmente a 2 mm da borda da ferida para obter mordidas simétricas de espessura total (2-3 mm de profundidade) espaçadas de 3 mm.
    1. Amarre nós quadrados com tensão controlada para alinhar os planos fasciais anatomicamente. Reposicione as bordas da pele usando uma tesoura micro Iris para criar uma eversão epidérmica de 1 mm. Alinhe a derme precisamente com a pinça de relojoeiro e prenda com suturas simples interrompidas 5-0 não absorvíveis espaçadas de 2 mm, garantindo uma coaptação uniforme sem espaço morto subcutâneo.
    2. Desinfete a linha de sutura com cotonetes de iodo usando movimentos unidirecionais do centro da ferida para fora. Passe suavemente qualquer sangue residual com gaze umedecida em solução salina e aplique uma fina camada de pomada antibiótica tripla ao longo da incisão.
  4. Após a cirurgia, coloque os ratos em uma gaiola mantida em temperatura e umidade adequadas. Forneça cuidados com a micção duas vezes ao dia (manhã e noite) para ajudar os ratos até que eles recuperem a micção independente.
  5. Injete em cada camundongo por via subcutânea 0,5 mL de solução salina e antibióticos (gentamicina, 2000-2500 U / camundongo) diariamente para prevenir infecções.

3. Isolamento do tecido da medula espinhal de camundongos C57 / BL6

  1. Anestesiar os camundongos antes da cirurgia (etapa 1.3). Depois de totalmente anestesiado, fixe-os na mesa cirúrgica em decúbito dorsal. Camundongos operados de forma simulada são tratados de forma semelhante.
  2. Faça uma incisão transversal na cavidade torácica, abaixo do esterno e ao longo do diafragma para expor o coração. Estabilize suavemente o coração com hemostáticos e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo apical, avançando-a para a aorta.
    1. Corte imediatamente a aurícula direita e inicie a perfusão a uma taxa de 250 mL/h com 10 mL de solução de PBS. A perfusão é considerada bem-sucedida quando o líquido drenado da aurícula direita muda de vermelho sangrento para claro e incolor, ou quando o fígado faz a transição de vermelho para branco27.
  3. Passe a coluna vertebral na extremidade da cauda do camundongo para expor o forame vertebral. Usando uma tesoura oftálmica, disseque cuidadosamente o tecido da medula espinhal 0,5 cm acima e abaixo do local da lesão. Colocar o tecido isolado da medula espinal numa placa de cultura estéril e isenta de enzimas, contendo 5% de tampão de coloração, e guardá-lo em gelo a 4 °C para utilização posterior na centrifugação com gradiente de densidade de polivinilpirrolidona (PVP) revestida com sílica coloidal.
    NOTA: Ao dissecar a medula espinhal perto do centro da lesão, certifique-se da integridade do tecido para evitar rasgar ou danificar a medula espinhal no local da lesão. O tampão de coloração a 5% (SB) consiste em 2,5 mL de soro fetal bovino (FBS) e 47,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).

4. Centrifugação com gradiente de densidade usando sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona

  1. Coloque o tecido da medula espinhal em um filtro de células de 300 mesh e triture-o usando o êmbolo de uma seringa descartável de 5 mL / 10 mL. Após a moagem, filtre a suspensão da célula através do filtro de 300 malhas em um tubo de centrífuga de 15 mL para centrifugação (5 min, 110 x g, temperatura ambiente).
    1. Após centrifugação, adicionar 1 ml de solução de digestão de células de tripsina ao sedimento celular e incubá-lo numa incubadora de cultura de células a 37 °C durante 15 min. Pare a digestão adicionando 1,5 mL de soro fetal bovino e centrifugue novamente (110 x g, 5 min, temperatura ambiente). Ressuspenda o sedimento celular em 1 mL de tampão de coloração a 5% (SB).
  2. Adicione sequencialmente 4 mL de solução de polivinilpirrolidona revestida com sílica coloidal a 70%, 4 mL de solução de polivinilpirrolidona revestida com sílica coloidal a 30% e 1 mL da solução de células ressuspensas com SB a 5% a um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a mistura (300 x g, 30 min, 20 °C).
    NOTA: Prepare o reagente de separação de polivinilpirrolidona revestido com sílica coloidal como uma mistura 9:1 de polivinilpirrolidona revestida com sílica coloidal e PBS 10×. Dilua a solução de polivinilpirrolidona revestida com sílica coloidal a 70% com PBS 1× e a solução de polivinilpirrolidona revestida com sílica coloidal a 30% com meio de cultura de células DMEM ou RPMI 1640.
  3. Após a centrifugação, as células formarão camadas no tubo de centrífuga (Figura 1). Descarte os detritos celulares e as camadas de plaquetas acima da marca de calibração de 8 mL. Aspire cuidadosamente a solução restante (até a marca de calibração de 1,5 mL) e descarte o sedimento abaixo da marca.
    1. Transfira a solução restante para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 1× PBS para elevar o volume total para 15 mL para centrifugação (400 x g, 5 min, 4 ° C).
  4. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em SB a 5%. Transferir a solução para um tubo de citometria de fluxo (FCM) para lavagem e centrifugação (110 x g, 5 min, 4 °C). Ressuspenda o sedimento celular no tubo FCM com 200 μL de 5% de SB.

5. Coloração FCM

  1. Divida 200 μL da suspensão celular igualmente em dois novos tubos de citometria de fluxo. Rotule um tubo como "Controle de Isotipo" e o outro como "Coloração Específica".
  2. Procedimento de coloração
    1. Ao tubo "Controle de Isotipo", adicione os seguintes anticorpos compatíveis com o isotipo: Rat IgG2b kappa marcado com PE, Rat IgG2b kappa marcado com FITC, Rat IgG2b kappa marcado com APC e Rat IgG2b kappa marcado com APC-eFluor 780.
    2. Ao tubo "Specific Staining", adicione o seguinte painel de anticorpos marcados com fluorescência de acordo com as proporções de diluição recomendadas: Rat anti-mouse CD45 APC, Rat anti-mouse CD11b PE, Rat anti-mouse CD68 FITC e Rat anti-mouse CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Incubar os tubos à temperatura ambiente, protegidos da luz, durante 30 min.
  3. Lave as células coradas duas vezes, adicionando 1 mL de SB de cada vez. Centrifugar as células (110 x g, 5 min, 4 °C). Finalmente, fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 2% para análise de citometria de fluxo.

6. Detecção de FCM

NOTA: Para obter detalhes sobre o procedimento, consulte os relatórios anteriores27,28.

  1. Analise as amostras usando o citômetro de fluxo com o software compatível (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Primeiro, analise o tubo de controle do isotipo para estabelecer o gráfico primário (FSC no eixo x e SSC no eixo y). Ajuste as tensões de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para posicionar a população de células dentro de uma faixa apropriada.
    2. Configure dois gráficos adicionais: um com IgG-APC no eixo x e IgG-PE no eixo y. Outro com IgG-FITC no eixo x e IgG APC-Cy7 (nota: APC-eFluor 780 foi detectado neste canal) no eixo y.
    3. Ajuste as tensões do canal de fluorescência para IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC e IgG APC-Cy7 para posicionar a população de células dentro do 103 da região duplamente negativa.
  2. Uma vez que as tensões FSC e SSC, bem como as tensões do canal de fluorescência, tenham sido ajustadas e otimizadas usando o tubo de controle de isotipo, essas configurações devem permanecer inalteradas. Prossiga para analisar os tubos experimentais corados com anticorpos.
    1. Estabelecer um gráfico primário com CD11b-PE no eixo x e SSC no eixo y. Configure outro gráfico com CD68-FITC no eixo x e CCR7 APC-Cy7 no eixo y. Usando o tubo de controle de isotipo como referência, defina os valores de linha de base e delineie a "região" para células CD11b + . No gráfico primário, bloqueie a região da célula CD11b + e defina-a como a "porta P1 ".
    2. Em seguida, selecione o gráfico com CD68-FITC no eixo x e CCR7 APC-Cy7 no eixo y. Clique com o botão direito do mouse e escolha Mostrar População e, em seguida, escolha P1. Isso exibirá as populações de células dentro do grupo CD11b + que expressam CD68 + / CCR7 + ou CD68 + / CCR7-. Colete 50.000 eventos por amostra.
    3. Depois de adquirir os dados, ajuste a compensação de fluorescência conforme necessário. Analise e determine a porcentagem de células CD11b + CD68 + CCR7 + (semelhantes a M1) e células CD11b + CD68 + CCR7- (semelhantes a M2). A porcentagem média de células marcadas positivamente é expressa como uma porcentagem da população total da amostra.
  3. Usando os parâmetros de tensão bem ajustados do tubo de controle do isotipo, prossiga com a análise dos tubos experimentais.
    1. Primeiro, estabelecer um gráfico com CD45-APC e CD11b-PE, seguido de dois gráficos com CD68-FITC e CCR7 APC-Cy7. Colete 50.000 eventos por amostra e, após adquirir os dados, ajuste a compensação de fluorescência.
    2. Nos gráficos de pseudocores CD45 / CD11b, analise as "regiões" para células CD11b + CD45- / baixo e CD11b + CD45alto para cada amostra. Em seguida, analise as células CD68+ CCR7+ e as células CD68+ CCR7- dentro dessas duas regiões.
    3. Integre as análises para determinar as porcentagens das seguintes populações de células: CD11b + CD45 - / CD68 + CCR7 + baixo (micróglia semelhante a M1), CD11b + CD45 - / CD68 + baixo CCR7- (micróglia semelhante a M2), CD11b + CD45alto CD68 + CCR7 + (macrófagos semelhantes a M1), CD11b + CD45 CD68 alto + CCR7- (macrófagos semelhantes a M2).
      NOTA: A porcentagem média de células marcadas positivamente é expressa como uma porcentagem da população total da amostra.

7. Análise de dados do FCM

  1. Inicie o software de análise de citometria de fluxo e arraste os arquivos de experimento de citometria de fluxo para a seção "Todas as amostras" na interface. Os experimentos de citometria de fluxo serão exibidos abaixo de "Todas as amostras" na interface. Comece analisando o tubo de controle do isotipo para determinar o limite entre os sinais de fluorescência positivos e negativos.
    1. Clique duas vezes na amostra do tubo de controle de isotipo para abrir uma janela gráfica exibindo um gráfico Selecione FSC-A para o eixo x e SSC-A para o eixo y. Clique no botão Rectangular Gate na parte superior da interface e use o retângulo para selecionar a área após a remoção de detritos celulares (Figura 2A).
    2. Clique duas vezes na área selecionada para gerar uma nova janela gráfica. Escolha FITC para o eixo x e Histograma para o eixo y. Clique no botão Region Gate na parte superior da interface para definir uma porta no histograma de parâmetro único para determinar o limite entre os sinais de fluorescência negativos e positivos. A porta da região definirá a área positiva (Figura 2A).
      NOTA: A área com valores menores de FSC representa detritos celulares.
    3. Para cada um dos quatro anticorpos fluorescentes utilizados no ensaio, determinar o limiar entre os sinais negativos e positivos utilizando a amostra de tubo de controlo do isotipo. No eixo x, altere sequencialmente os fluorocromos para PE, APC e APC-Cy7, mantendo o eixo y como histograma.
    4. Use a ferramenta de porta de região no histograma de parâmetro único para definir portas e determinar o limite entre sinais negativos e positivos para cada um dos quatro anticorpos fluorescentes (Figura 2A).
  2. Para analisar as proporções de células semelhantes a M1 e M2:
    1. Clique duas vezes na amostra de tubo experimental para exibir um gráfico de pontos bidimensional. Selecione FSC-A para o eixo x e SSC-A para o eixo y. Clique no botão Rectangular Gate na parte superior da interface e use o retângulo para selecionar a área após a remoção de detritos celulares (Figura 2B).
    2. Clique duas vezes na área selecionada para gerar uma nova janela gráfica. Escolha CD11b-PE para o eixo x e SSC-A para o eixo y. Clique no botão Rectangular Gate na parte superior da interface e, usando o limite positivo/negativo PE definido pelo controle de isotipo como referência, defina a porta CD11b+ (Figura 2B).
    3. Clique duas vezes na área da porta CD11b+ para gerar uma nova janela gráfica. Selecione CD68-FITC para o eixo x e CCR7 APC-Cy7 para o eixo y. Clique no botão Cross Gate . Usando os limiares positivo/negativo FITC e APC-Cy7 definidos pelo controle de isotipo como referências, use a porta cruzada para categorizar as células, determinando as proporções de células CD11b + CD68 + CCR7 + (M1-like) e CD11b + CD68 + CCR7- (M2-like) (Figura 2B).
      NOTA: Os princípios de gating para analisar as proporções de macrófagos semelhantes a M1 (M1-like Mø), macrófagos semelhantes a M2 (M2-like Mø), micróglia semelhante a M1 (M1-like MG) e microglia semelhante a M2 (M2-like MG) são consistentes com aqueles usados para analisar células semelhantes a M1 e M2. Os limiares para distinguir sinais de fluorescência positivos e negativos são baseados no tubo de controle do isotipo, que serve como referência para definir as portas. O processo de operação do software é ilustrado na Figura 2B, e os perfis de expressão do marcador usados para determinar as proporções das células são descritos em detalhes na seção de resultados representativos.

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Resultados

As células imunes do tecido da medula espinhal são separadas usando sílica coloidal revestida com centrifugação por gradiente de densidade de polivinilpirrolidona. Durante o processo de centrifugação, as células são distribuídas em diferentes camadas de acordo com suas densidades flutuantes, conseguindo assim a separação celular (Figura 1). De cima para baixo, a distribuição é a seguinte: detritos celulares, camada rica em células mononucleares, camada rica em linfócitos e, na parte inferior...

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Discussão

A criação bem-sucedida de um modelo animal de LME é essencial. O modelo SCI foi estabelecido expondo a medula espinhal no segmento T9 a uma força de 0,5 N. O sucesso do modelo animal foi demonstrado pela cauda do camundongo se enrolando, ambos os membros posteriores experimentando espasmos e os membros posteriores paralisados, impossibilitando o camundongo de andar após o SCI (consulte a etapa 2.3). Os cuidados pós-operatórios são críticos para a sobrevivência do camundongo. Os cuidados ...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesse foi declarado.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82072416); e o fundo da equipe de inovação científica e tecnológica de alto nível do Primeiro Hospital Afiliado da Faculdade de Medicina de Bengbu (BYYFY2022TD001).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 e vezes; PBS  SolarbioPág. 1020
10 vezes; PBS  SolarbioPág. 1022
18 camundongos C57/BL6 fêmeas de oito semanas de idade Cavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, China
APC-eFluor 780-marcado com Rato anti-rato CCR7 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820.25μ g/teste
APC-eFluor 780-labeled Rat IgG2b kappa  Controle de isotipoInvitrogen47-4321-820.25μ g/teste
Anti-rato marcado com APC CD45 de rato (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820.125μ g/teste
Rat IgG2b kappa marcado com APC  Controle de isotipoInvitrogen17-4031-820.125μ g/teste
DMEMGibco11965092
Soro fetal bovinoLonseraS711-001
Ratinho anti-camundongo CD68 marcado com FITC (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-166760.25μ g/teste
Rat IgG2b kappa marcado com FITC Controle de isotipoInvitrogen11-4031-820.25μ g/teste
ParaformaldeídoBiosharp23319084
Ratinho anti-rato CD11b marcado com PE (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810.25μ g/teste
Rato IgG2b kappa marcado com PE  Controle de isotipoInvitrogen12-4031-820.25μ g/teste
Percoll  SolarbioPág. 8370
Solução de tripsinaBiosharpBL526A

Referências

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