Um Fluxo de Trabalho Computacional Bilíngue para Identificar Potenciais Inibidores de PLK1 na Língua de Sinais Americana e no Inglês

Summary

Este protocolo bilíngue fornece um fluxo de trabalho computacional de descoberta de fármacos avaliando as interações proteína-ligando das Quinases Tipo Polo 1 a 3 (PLK1–3) e das propriedades de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção, Toxicidade e Estabilidade (ADMET-S) de moléculas naturais provenientes de bancos de dados.

Abstract

A Quinase Tipo Polo 1 (PLK1) desempenha papéis essenciais nas fases S, G2 e M do ciclo celular, e sua superexpressão é frequentemente observada em múltiplos tipos de câncer, incluindo o câncer de mama, onde contribui para instabilidade genômica e apoptose desregulada. Ao contrário dos inibidores convencionais ATP-competitivos que têm como alvo o domínio quinase, a inibição seletiva do domínio polo-box (PBD) da PLK1 oferece uma estratégia promissora para interromper as interações proteína-ligante, críticas para a progressão mitótica, desencadeando assim a apoptose em células cancerígenas. No entanto, a alta semelhança estrutural entre PLK1 e seus homólogos (PLK2 e PLK3), que são vitais para a função neurológica e a resposta ao estresse, respectivamente, exige uma seletividade excepcional para evitar efeitos fora do alvo. Para enfrentar esse desafio, o protocolo envolve um fluxo de trabalho computacional bilíngue (Língua de Sinais Americana e Inglês) que integra triagem virtual, agrupamento estrutural, acoplamento proteína-ligante, previsão de afinidade de ligação, perfilamento ADMET-S e análise de estabilidade quântica (QM). A partir do banco de dados de produtos naturais SuperNatural 3.0, os compostos foram filtrados usando critérios de relevância do câncer de mama e similaridade com medicamentos, agrupados para garantir diversidade química e avaliados suas interações com as estruturas PLK1-, PLK2- e PLK3-PBD. Embora o acoplamento virtual e as avaliações in silico ADMET-S não possam confirmar definitivamente a seletividade ou o mecanismo de ação, este estudo gera hipóteses testáveis e prioriza um conjunto focado de candidatos derivados de produtos naturais para futuras simulações de dinâmica molecular, validação bioquímica ou triagem experimental.

Introduction

Quinases semelhantes a pólos (PLKs) são uma família de quinases proteicas estruturalmente compostas por um domínio N-terminal e um C-terminal, consistindo em um ou dois domínios de caixa polo (PBD)^1,2.  O número e a diversidade funcional desses domínios de caixas de polo variam entre os diferentes membros da família PLK. PLK1 está envolvida nas fases S, G2 e M da divisão celular. No ciclo celular, o PLK1 funciona como um ponto de verificação de danos ao DNA na fase S e como regulador da condensação cromossômica e maturação do centrossomo na fase G2. PLK1 também promove a entrada mitótica na fase M, seguida pela montagem do fuso, entrada na anáfase e citocinese ^3,4. A superexpressão de PLK1 leva à instabilidade genética devido à formação anormal de centrossomos, resultando em maus funcionamentos dos ciclos celulares que tornam as células incapazes de regular a apoptose.  Essa superexpressão é observada em cânceres de pulmão, cabeça e pescoço, esôfago, gástrico, colorretal e mama^. Portanto, a inibição de PLK1 por agentes que visam a PBD pode desencadear a apoptose ^5,6. Esse fluxo de trabalho visa alcançar alta seletividade para evitar inibir PLK2 e PLK3, que são cruciais para a função neurológica e o manejo do estresse^{genotóxico 3}.

O PLK2 atua como supressor tumoral em certos contextos, regulando a transição G1/S e promovendo a degradação da ciclina E para prevenir a proliferação celular descontrolada. O PLK3 apresenta um papel complexo tanto na regulação do ciclo celular quanto na resposta ao estresse genotóxico, contribuindo para a manutenção da integridade do genoma por meio de seu envolvimento na ativação de pontos de verificação de danos ao DNA e indução^{da apoptose7.} Importante ressaltar que, embora a inibição do PLK1 tenha surgido como uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento do câncer, os papéis essenciais do PLK2 e PLK3 no funcionamento neurológico e na resposta ao estresse exigem o desenvolvimento de inibidores altamente seletivos para minimizar os efeitos off-target sobre essas quinases^{cruciais 3}. Esse contexto biológico e semelhanças estruturais acima de 38%³ ressaltam a importância de identificar compostos que visem especificamente o domínio da caixa de polo (PBD) de PLK1 sem interferir nas funções protetoras de PLK2 e PLK3 na fisiologia celular normal.

Inibidores conhecidos de quinase semelhante ao polo (PLK), especialmente aqueles que visam o PLK1, foram amplamente estudados devido às suas potenciais aplicações terapêuticas no tratamento do câncer. Vários compostos, incluindo BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) e GSK461364, foram desenvolvidos e avançados em ensaios clínicos, frequentemente como inibidores ATP-competitivos ^8,9,10. Outros tipos de inibidores têm como alvo a DBP, incluindo Timoquinona (TQ)^11,12,^{Poloxina 13,14} e Alopól-A¹⁵. Embora supostamente promissor, atualmente não existem inibidores específicos para PBD aprovados nem ensaios clínicos em estágio avançado devido a desafios, incluindo propriedades subótimas do ADMET-S e efeitos fora do^{alvo 6}. Por exemplo, vários inibidores de PLK1-PBD são alquiladores proteicos inespecíficos¹⁶, limitando sua aplicabilidade clínica. Portanto, melhorar a seletividade e os perfis ADMET-S dos potenciais inibidores de PLK1-PBD continua sendo um objetivo crucial na descoberta de medicamentos.

O objetivo deste estudo é explorar potenciais inibidores PLK1-PBD com propriedades ADMET-S utilizando triagem virtual, filtragem por similaridade estrutural, docking, cálculos de energia de ligação e avaliação ADMET-S. PLK2 e PLK3 foram submetidos aos mesmos protocolos para avaliar a seletividade potencial. Embora existam inúmeros pipelines computacionais para a descoberta de inibidores de quinase, poucos integram triagem seletiva concorrente entre PBDs PLK1–3 com análises abrangentes de ADMET-S e estabilidade quântica, especialmente usando bibliotecas de produtos naturais. O fluxo de trabalho se baseia em paradigmas estabelecidos de triagem virtual, mas é adaptado para acessibilidade educacional e geração de hipóteses em estágio inicial. O protocolo requer apenas um laptop padrão (8 GB de RAM), software acadêmico gratuito e nenhuma experiência prévia em programação, tornando-o adequado para ambientes de ensino médio, graduação e pós-graduação, incluindo experiências de pesquisa de graduação (CUREs) baseadas em cursos.

O pipeline computacional para este trabalho começa com a preparação de proteínas, onde as estruturas de PLK1-PBD, PLK2-PBD e PLK3-PBD são recuperadas do Banco de Dados de Proteínas (PDB) ou modeladas e processadas para resolver discrepâncias estruturais. Em seguida, foi realizada uma triagem em banco de dados de produtos naturais, filtrando compostos com base no potencial como anticâncer de mama e na conformidade com a Regra dos Cinco de Lipinski. Os passos subsequentes são agrupamentos em 50 estruturas representativas baseadas em impressão digital molecular e similaridade. Esses representantes passaram por cálculos de acoplamento e ligação proteína-ligante, gerando dados de interação para os três PLKs. Posteriormente, as propriedades do ADMET-S são avaliadas usando três servidores web diferentes para prever farmacocinética, semelhança com medicamentos, toxicidade e estabilidade metabólica. Cálculos de MQ foram usados para avaliar a estabilidade molecular por meio da análise de Orbital Molecular Ocupado Mais Alto (HOMO) e Orbital Molecular Não Ocupado Mais Baixo (LUMO) da lacuna HOMO–LUMO. Por fim, os dados do ADMET-S foram analisados para filtrar e classificar compostos com base em critérios físico-químicos, absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade e estabilidade como inibidores potenciais e seletivos do PLK1-PBD.

Protocol

Os Identificadores de Recursos de Pesquisa (RRIDs) e os números de versão de todas as ferramentas de software utilizadas são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação de proteína alvo

1. Crie um diretório funcional para este projeto onde arquivos estruturais e resultados computacionais possam ser armazenados.
2. Visite o Banco de Dados de Proteínas para recuperar o identificador da proteína alvo PLK1-PBD (4HCO¹¹) e faça um acompanhamento com a Química da HARvard Molecular Mechanics - Interface Gráfica do Usuário (^{CHARMM-GUI 17,18}) para resolver quaisquer discrepâncias estruturais.
   1. Visite o CHARMM-GUI e registre uma conta acadêmica. Ao registrar uma conta acadêmica, clique no gerador de entrada, depois no Leitor PDB, insira o ID PDB 4HCO e clique no próximo passo.
   2. Na próxima página, certifique-se de que apenas PROA – cadeia proteica A esteja selecionada e clique na próxima etapa para as próximas duas páginas.
   3. Baixe step1_pdbreader.pdb para um diretório, renomeie o arquivo para 4hco ou preferido, e use um editor de texto ou código para renomear ocorrências de histidina (HSD) para (HIS).
3. Repita o procedimento para o PLK2-PBD (identificador PDB: 4XB0¹⁹) usando a interface gráfica CHARMM.
   NOTA: Para estruturas sem identificadores PDB, como o PLK3-PBD, utilize estruturas modeladas por homologia ou Alphafold²⁰. Garanta a precisão da sequência a partir do^{Uniprot 21}.

2. Triagem de bancos de dados de produtos naturais

1. Visite o banco de dados SuperNatural 3.0 Library de produtos naturais e selecione a subpágina²² de doenças.
   1. Selecione câncer de mama com qualquer ou nenhum limite de confiança, pois todos os resultados precisarão ser filtrados programaticamente, e clique em Encontrar. Clique em Download the complete result file para salvar os resultados em um diretório preferido como .csv. Depois, use código para filtrar aqueles com limites de confiança de 0,900–1,000 (n = 1.193 de 73.406).
      NOTA: Alternativamente, o identificador da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) para câncer de mama pode ser inserido na subpágina²³ de vias do Caminho.
   2. Vá para a subpágina de FAQ , no final, encontre todo o conjunto de dados disponível para download como um arquivo .csv. Baixe isso e use um script para comparar as strings do Sistema Simplificado de Entrada Molecular de Entrada de Linha (SMILES) do conjunto de dados com identificadores SuperNatural das 1.193 moléculas e prepare uma lista das cadeias SMILES (smiles.csv).

3. Amostragem em cluster

1. Baixe uma distribuição Anaconda (https://www.anaconda.com/download) contendo quase todos os pacotes open-source, ou baixe individualmente um ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) como RStudio (RStudio Desktop - Posit) ou Jupyter (Jupyter Notebook). Instale o^{RDKit 24}, um pacote de quimioinformática e aprendizado de máquina de código aberto usando o Conda.
   NOTA: Instruções para instalar o Conda e criar um ambiente Conda podem ser encontradas na documentação do conda 25.9.2.dev31. Para instalação e configuração do módulo RDKit no ambiente, veja Instalação — A documentação do RDKit 2025.03.6.
2. Coloque o script "Lipinski.py" no Arquivo Suplementar 1 na mesma pasta que "smiles.csv" e execute-o. O script abre o ambiente Conda, carrega módulos, lê o arquivo de strings SMILES, aplica um filtro baseado na Regra de 5 de Lipinski para estimativa de biodisponibilidade e absorção (n = 999 de 1.193) e salva uma lista de strings SMILES como "all.csv".
   NOTA: Confirme que "all.csv" foi gerado e contém ~999 compostos (subconjunto filtrado). Abra o arquivo para verificar se cada entrada contém uma string SMILES válida. Python roda no RStudio após executar o seguinte no console: library(reticulate); Reticulate::use_condaenv(nomedecondaenv)
3. Coloque o script "Clustering.py" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "all.csv" e execute-o no IDE preferido. Os scripts carregam módulos de clustering, leem o arquivo de strings SMILES e agrupam compostos em 50 clusters baseados em fingerprinting molecular e similaridade com Tenomo.
   NOTA: 50 estruturas representativas (rep_struct.csv, no Arquivo Suplementar 1) são salvas no diretório como uma lista de strings SMMILES. A similaridade de Tanimoto (também conhecida como índice de Jaccard em quimioinformática)²⁵ é uma métrica usada para quantificar a similaridade estrutural entre duas moléculas com base em suas impressões digitais moleculares, com o coeficiente de Tanimoto variando de 0 (sem semelhança) a 1 (impressões digitais idênticas). Certifique-se de que "rep_struct.csv" tenha exatamente 50 entradas únicas do SMILES representando cada cluster.

4. Acoplamento proteína-ligante e cálculo de afinidade de ligação

1. Visite o servidor web de Dock Cego guiado por detecção de cavidades baseado em Vina em AutoDock (CB-Dock2)²⁶.
   1. Vá na aba de acoplamento e faça upload da proteína 4HCO.
   2. Para enviar o ligante, clique em desenhar ligando e cole um ligando da lista de strings SMILES (rep_struct.csv, Arquivo Suplementar 1). Insira um endereço de e-mail no próximo campo para facilitar a coleta de dados comprimidos, depois clique em Acoplamento Automático às Cegas. Repita para os 49 representantes restantes de pequenos aglomerados de moléculas, rotulando-os como lig1, lig2, ..., lig50.
2. Vá ao resultado enviado por e-mail e baixe as pastas zip em um subdiretório chamado 4HCO, intitulando-as de forma ordinária (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Descompacte as pastas e remova todos os arquivos, exceto os arquivos complexos proteína-ligante que terminam com ".complex.pdb".
      NOTA: Verifique se cada diretório de ligando (4hco_lig1 a 4hco_lig50) contém o arquivo correspondente ".complex.pdb".
   2. Abra um arquivo de exemplo .complex.pdb com um editor de texto para anotar cuidadosamente o ID da cadeia proteica: P e o ligante ID: A:UNL e recompacte as pastas usando um utilitário de compressão de arquivos.
   3. Visite o servidor web PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY) para avaliar a seletividade e a afinidade de ligação^{proteína-ligante 27}.
      1. Clique na aba PRODIGY-lig (proteína-molécula pequena) para carregar uma pasta zipada com múltiplos complexos proteína-ligante ao mesmo tempo (como 4hco_lig1). Insira a cadeia proteica e os IDs do ligante, complete a verificação do captcha e clique em Enviar Prodigy-Ligand.
      2. Uma vez que os dados tenham sido processados, clique no arquivo de arquivamento de todas as saídas (.zip) para baixar os resultados. Repita a etapa anterior e a coleta de resultados para todos os subdiretórios até 4hco_lig50.
   4. Repita todos os passos para as proteínas 4XB0 e PLK3 com atenção cuidadosa à nomenclatura dos arquivos (como 4xb0_lig1 ou plk2_lig1).
      NOTA: Confirme que os CSVs de saída para todos os complexos proteína-ligante foram baixados e contêm tanto colunas de dados de ΔG quanto de resíduo de interface.

5. Avaliação ADMET-S

1. Visite a plataforma²⁸ do ADMETlab3 3.0.
   1. Clique em COMEÇAR em "ADMET Screening" e insira uma lista de SORRISOS.
      1. Abra rep_struct.csv em um diretório para colar toda a lista de strings SMILES no campo de texto e envie.
      2. Avalie a farmacocinética e as propriedades de semelhança com medicamentos usando o sistema de pontuação codificado por cores da plataforma e baixe os resultados da avaliação como um arquivo .csv para análise adicional.
      3. Navegue até a ferramenta^{SwissADME 29}.
2. Cole a lista de cadeias SMILES para todas as 50 moléculas no campo de entrada.
   1. Clique em Executar para calcular as propriedades de biodisponibilidade e permeabilidade, incluindo penetração em BBB.
   2. Baixe a saída como um arquivo .csv para integração com outros resultados do ADMET.
3. Baixe e instale o ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation by a decision tree approach) compatível com o sistema operacional do usuário.
   1. Abra o software pelo terminal usando o comando: sh Toxtree.sh
   2. Insira as cadeias SMILES individualmente no ToxTree para classificar a toxicidade com base nas regras de Cramer.
   3. Exporte os resultados como um arquivo .csv para integração com outros dados ADMET.
      NOTA: Verifique se os CSVs de saída ADMETLab3 e SwissADME correspondem ao número de ligantes (n = 50) e que os resultados do Toxtree classifiquem cada composto sob as regras de Cramer (I–III).
4. Após instalar o ORCA³¹, crie uma pasta chamada stability no diretório de trabalho e subpastas para cada molécula (por exemplo, plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Use Avogadro (Avogadro) para construir cada molécula a partir de sua sequência SMILES: Vá até a aba Extensões e clique em Otimizar Geometria para otimizar a molécula. Gerar arquivos de entrada ORCA via Extensões > ORCA > Gerar Entrada ORCA e aplicar as seguintes configurações:
      ! B3LYP OPT freq def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %PAL
      NCRAPS 1
      fim
   2. Modifique o arquivo de trabalho .sh baixado para cada ligando para incluir nomes únicos de trabalho e um endereço de e-mail. Depois, transfira o diretório "estabilidade" para um sistema de computação de alto desempenho (HPC) usando os seguintes comandos:
      ssh xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      mkdir ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Execute os trabalhos através do Simple Linux Utility for Resource Management (gerenciador de carga de trabalho SLURM para clusters HPC) com um script de loop:
      para i em {1..50}; faça
      cd ~/4hco/estabilidade/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      Feito
   4. Após receber e-mails de conclusão de tarefas, navegue até as pastas ligando e abra os arquivos de saída para revisar os dados e anotar os valores HOMO e LUMO:
      CD ~/4hco/estabilidade/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Análise dos dados ADMET-S

1. Combine os dados de propriedades fisicoquímicas derivados dos gráficos de biodisponibilidade e permeabilidade do radar SwissADME em um arquivo .csv.
   1. Salve o arquivo .csv do SwissADME e nomeie-o como "Physiochemical.csv".
   2. Coloque o script "Physiochemical.py" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "Physiochemical.csv" e execute.
   3. Aplique os seguintes critérios: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 a 0,5, Fsp3: >0,41 e nHet: 1–15.
2. Derive os dados de absorção e distribuição do SwissADME.
   1. Faça um snapshot e salve^{o gráfico} 32 do Ovo COZIDO no SwissADME.
   2. Aplique os seguintes critérios: moléculas devem estar na região do "ovo" e atuar como inibidores da p-glicoproteína, pois os pontos vermelhos são preferidos.
3. Derive os dados de metabolismo do ADMETlab3.0 para substratos e inibidores de citocromo (CYP).
   1. Salve .csv arquivo do ADMETlab3.0 e nomeie como "Metabolism.csv".
   2. Edite o arquivo .csv e mantenha apenas as colunas do CYP-inh e do CYP-sub.
   3. Coloque o script "Metabolism.R" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "Metabolism.csv" e execute-o.
   4. Aplique os seguintes critérios: o inibidor do CYP p450 e o não-substrato como categoria 0 são preferidos.
4. Derive os dados de excreção do ADMETlab3.0 para a eliminação do plasma e meia-vida.
   1. Salve .csv arquivo do ADMETlab3.0 e nomeie como "Excretion.csv".
   2. Edite o arquivo .csv e mantenha apenas as colunas de cl-plasma e t0.5.
   3. Coloque o script "Excretion.py" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "Excretion.csv" e execute-o.
   4. Aplique os seguintes critérios: liberação do plasma: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. nDados de toxicidade do Toxtree para a classe de toxicidade e ADMETlab3.0 para o número de toxicóforos.
      1. Salve .csv do ADMETlab3.0 e nomeie "Toxicity.csv".
      2. Edite o arquivo .csv, mantendo apenas a coluna Toxicóforo, e adicione uma nova coluna registrando a classe de toxicidade de cada ligante no Toxtree.
      3. Coloque o script "Toxicity.py" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "Toxicity.csv" e execute-o.
      4. Aplique o seguinte critério: número de toxicóforos a 0–2.
   6. Derive os dados de estabilidade a partir dos arquivos de saída do ORCA. As ("ENERGIAS ORBITAIS", especificamente os valores de energia HUMO e LUMO).
      1. Crie um gráfico Excel registrando as energias HUMO e LUMO de cada ligando como colunas separadas.
      2. Adicione uma nova coluna calculando a Banda Proibida (HUMO–LUMO = Banda Proibida).
      3. Salve o gráfico do Excel como "Stability.csv."
      4. Coloque o script "Stability.py" (Arquivo Suplementar 1) na mesma pasta que "Stability.csv" e execute.
      5. Aplique os seguintes critérios: diferença de banda entre 3,6–5 eV.

Results

O protocolo de arquivo de estrutura de proteína alvo garante que o arquivo de proteína alvo seja otimizado para análise e acoplamento baseado em estrutura. O arquivo estrutural resultante, no formato PDB, está livre de resíduos e hidrogênios ausentes, tipos de átomos ausentes e componentes desnecessários como moléculas de água e ligantes cocristalizados. As figuras 1A,B mostram diferenças visuais (visualizadas pelo Visualizador^{Mol* 33}) em estruturas antes e depois do preparo. Se houver algum problema residual de formatação (como nomes de átomos não reconhecidos ou resíduos incompletos), o CB-Dock2 normalmente emitirá um erro ao ser enviado. Nesse momento, pequenas correções manuais, como renomear o HSD para HIS ou remover resíduos não padrão, podem ser aplicadas antes de tentar novamente a etapa de acoplamento.

A Figura 2 mostra os resultados do agrupamento por meio da análise de componentes principais (PCA) baseada na impressão digital molecular e na similaridade com Tanomo. Na figura, cada aglomerado é agrupado por um oval de tons cinza contendo pontos de cor semelhante, que representam as moléculas desses aglomerados.  Os componentes PCA 1 e 2 nos eixos fornecem uma representação linear bidimensional da redução a partir de elementos de alta dimensão em matrizes de Tanomo. Neste estudo, a similaridade com Tanimoto é usada durante a etapa de amostragem em cluster para reduzir a redundância e aumentar a diversidade química entre os 999 produtos naturais compatíveis com Lipinski. Ao calcular semelhanças par a par de Tanimoto usando impressões digitais moleculares, o conjunto de dados é dividido em 50 clusters de compostos estruturalmente relacionados. Uma única molécula representativa é então selecionada de cada cluster, garantindo que o conjunto final de 50 ligantes capture um amplo espaço químico, minimizando a redundância computacional em docking downstream e análises ADMET-S. Essa estratégia aumenta a eficiência e a representatividade da triagem virtual, especialmente ao trabalhar com grandes bibliotecas de produtos naturais, como a SuperNatural 3.0. (veja a Figura 2).

Poses ótimas para cada complexo proteína-ligante são simuladas, acompanhadas por afinidades previstas na forma de pontuações de Vina entre as cinco poses CurPocket da proteína PLK1 em CB-Dock2, considerando as forças de van der Waals e as ligações de hidrogênio.  Uma simulação de exemplo do ligando 1 na Figura 3 mostra a melhor ligação à segunda pose CurPocket (C2), com a menor pontuação de Vina de –7,5 kcal/mol, em comparação com as outras quatro poses superiores. O acoplamento molecular com CB-Dock2 é feito por meio de uma função de pontuação baseada em parâmetros empíricos e um algoritmo global de otimização estocástica. O CB-Dock2 foi rigorosamente validado e demonstrou desempenho superior em comparação com outras ferramentas de acoplamento cego de última geração, tornando-o uma excelente escolha para estudos de^{acoplamento 26,34}. O servidor alcança uma taxa de sucesso de aproximadamente 85% para a previsão de posição de ligação (RMSD <2 Å), superando ferramentas populares, incluindo a primeira versão do CB-Dock, SwissDock, COACH-D e MTiAutoDock³⁴. Essa alta precisão é atribuída à integração inovadora do CB-Dock2 de dois esquemas complementares de acoplamento: abordagens baseadas em estrutura e baseadas em templates.

A Figura 4 ilustra um mapa de calor das afinidades médias previstas para cada combinação proteína-ligante usando afinidades previstas pelo servidor web PRODIGY.  Afinidades mais altas, indicadas por energias molares mais baixas (kcal/mol) e tonalidades de mapa de calor mais verdes, são afinidades favoráveis à ligação. Em contraste, afinidades mais baixas, indicadas por energias molares mais altas e tons de mapa de calor mais vermelhos, são menos favoráveis. Do ponto de vista da seletividade, é ideal ter compostos com afinidades favoráveis pela proteína-alvo (PLK1) em relação aos homólogos (PLK2–3). Por exemplo, o ligante 27 é um ligante seletivo PLK1-PBD em relação ao ligante 45, que apresenta afinidades semelhantes entre as três proteínas. Embora os resultados 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 e 49 mostrem maior afinidade por PLK1-PBD do que PLK2/3, eles são quimicamente diversos no espaço de impressões digitais 2D (média ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, nenhum par ≥ 0,50), sugerindo que qualquer especificidade mais ampla provavelmente é impulsionada pela geometria conservada do bolso PBD e padrões compartilhados de farmacoforo/interação 3D, em vez da identidade do andaime. As recomendações incluem comparação interação-impressão digital e mapeamento de farmacofóricos para identificar os determinantes estruturais do reconhecimento PLK1-PBD.

Os resultados da avaliação de propriedades fisicoquímicas são mostrados em um gráfico de radar (Figura 5). As propriedades avaliadas incluem interações atômicas, solubilidade e biodisponibilidade. Alguns compostos se destacam por suas propriedades fisicoquímicas mais desejáveis com faixas aceitáveis: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 a 0,5, Fsp3 > 0,41 e nHet = 1–15. Este gráfico de radar oferece uma visualização abrangente e multidimensional das propriedades fisicoquímicas dos 50 ligantes representativos identificados no fluxo de trabalho de triagem computacional. Ele foi projetado para avaliar o quanto cada composto adere aos critérios pré-definidos de "semelhante a medicamento", plotando suas propriedades em relação aos limites inferiores e superiores estabelecidos. O gráfico apresenta dez descritores moleculares-chave dispostos ao redor do eixo polar, incluindo pKa ácido e pKa básico. A área sombreada entre o polígono verde (Limite Inferior) e o polígono azul (Limite Superior) marcava a faixa ideal ou aceitável para cada propriedade, com base nos limiares fornecidos no protocolo. Os limites superior e inferior do ácido pKa (2–12 e pKa base (3–10)) foram atribuídos com base em revisões^{bibliográficas 35, 36, 37}, já que não existe um único limite superior e inferior para pKa na descoberta de medicamentos. Cada linha colorida representa um dos 50 ligantes. A forma formada ao conectar os pontos de dados de um único ligando mostra seu perfil nas dez propriedades selecionadas simultaneamente. A grande maioria dos 50 ligantes está dentro ou muito próxima da região aceitável definida pelos polígonos verde e azul. Isso indica que os passos iniciais de filtragem, particularmente a aplicação da Regra dos Cinco de Lipinski e o agrupamento baseado na similaridade de Tenomo, foram altamente eficazes ao enriquecer o conjunto de dados com moléculas que possuem propriedades favoráveis semelhantes às de medicamentos. Recomenda-se a representação de toda a faixa de valores documentados para todos os parâmetros.

A Figura 6A–C mostra componentes dos dados ADME do ADMETlab3.0 e do SwissADME. Começando pela absorção e distribuição, o modelo³⁸ do Ovo COZIDO na Figura 6A do SwissADME representa a absorção e distribuição dos medicamentos via lipofilicidade e permeabilidade, conforme indicado pelas elipses amarelas e brancas no gráfico. Inclui substratos e inibidores de P-gp, representados por pontos azul e vermelho, respectivamente, onde inibir a P-gp é crucial para maiores taxas de absorção. Na Figura 6B, o mapa de calor metabólico visualiza a inibição e o substrato de aproximadamente 7 variedades das enzimas CYP citocromo p450. O resultado desejado para os ligantes é servir como não inibidores do CYP e não substratos (verde), com resultados preferenciais que confirmem um perfil de segurança seguro do medicamento, sem ou com poucas interações medicamento-medicamento. A Figura 6C representa os dados de excreção da depuração e da meia-vida do medicamento. A excreção pode ser distinguida pela claridade ótima do plasma (<5 mL/min/kg). A meia-vida de todos os anticânceres depende do mecanismo de ação, toxicidade e alvo do medicamento. A meia-vida ideal equilibra a manutenção das concentrações de medicamentos dentro de uma janela terapêutica, minimizando a toxicidade e permitindo agendas de dosagem^{convenientes 39,40}.

A combinação de dois tipos de avaliações de toxicidade é representada. Na Figura 7A, o número de toxicóforos identificados pelo ADMETlab3.0 é mostrado para cada ligante.  Não há um limiar ou informação definida sobre os intervalos aceitáveis dos toxicóforos.  Na Figura 7B, a aplicação do Toxtree fornece informações relacionadas à classe de toxicidade (I-III), bem como às violações e adesão à Regra de Cramer. O resultado da amostra para o ligante 1 mostra os resultados de toxicidade e seu código SMILES na barra superior, com a estrutura na janela no canto inferior esquerdo. A identificação de toxicidade de classe na janela superior direita indica alta toxicidade (Classe III) com base nas Regras de Cramer para ligante 1, em vez de outras possibilidades como Classe II (toxicidade média) ou Classe I (baixa toxicidade).  A janela inferior direita mostra o raciocínio escrito da identificação de classes com base na árvore de decisão da Regra de Cramer.

Os cálculos ORCA QM de frequência vibracional para estruturas otimizadas calculam valores de energia orbital para a determinação da lacuna de banda. A Figura 8 mostra a banda proibida (eV) de cada ligante derivada da diferença entre o HOMO e o LUMO. A faixa de limiar é representada na região sombreada entre 3,6 eV e 5,0 eV, onde cada ponto na região sombreada satisfaz os níveis de energia associados a uma estabilidade e reatividade mais desejáveis. Uma visão geral de todo o fluxo computacional é resumida na Figura 9, que ilustra as etapas sequenciais desde a preparação de proteínas alvo e a triagem do banco de dados de produtos naturais até a avaliação ADMET-S, projetada para identificar inibidores seletivos de PLK1-PBD, garantindo propriedades semelhantes a medicamentos e estabilidade química. Este roteiro visual destaca a modularidade, acessibilidade e adequação do protocolo para implementação educacional.

A Tabela 1 operacionaliza o protocolo ao transformá-lo de uma sequência linear de instruções em um pipeline robusto e consciente de erros, adequado para uso em sala de aula e pesquisa independente. Ele aborda explicitamente a reprodutibilidade, um desafio conhecido na descoberta computacional de fármacos, ao incorporar critérios de validação em pontos-chave de transição. Por exemplo, confirmar que resíduos de histidina são uniformemente rotulados como "HIS" após o processamento do CHARMM-GUI previne falhas silenciosas no docking downstream, enquanto validar a integridade do SMILES antes do clustering evita erros em cascata na previsão do ADMET. A tabela também destaca o design pedagógico, com cada dica de solução de problemas acionável com conhecimento computacional mínimo (por exemplo, "abrir .complex.pdb em um editor de texto para verificar IDs da cadeia"), alinhando-se com o objetivo do manuscrito de acessibilidade para surdos, graduação/pós-graduação e alunos do ensino médio. Além disso, ao sinalizar etapas em que os resultados afetam desproporcionalmente os resultados, como a avaliação de seletividade via pontuação comparativa PRODIGY, a tabela ajuda os usuários a priorizar atenção e recursos.

Uma força chave desse fluxo de trabalho integrado é sua capacidade de expor discrepâncias entre previsões computacionais complementares, revelando casos limitações que ressaltam as limitações de qualquer método individual. Por exemplo, o ligando 5 para PLK1-PBD apresentou uma forte pontuação Vina CB-Dock2 (−7,9 kcal/mol) e afinidade PRODIGY favorável (ΔG = −9 kcal/mol, Figura 4), mas falhou em vários filtros ADMET. Ele não seguia o modelo de absorção e distribuição de Ovo COZIDO, apresentava um valor de eliminação plasmática menos desejável (9,3 mL/min/kg, Figura 6), sugerindo eliminação rápida, e foi classificado como Classe III de Cramer (alta toxicidade) pela Toxtree contendo cinco toxicóforos (Figura 7A). Por outro lado, o ligando 33 apresentou uma afinidade moderada prevista pelo PRODIGY para PLK1 (−5,4 kcal/mol), mas atendeu a todos os critérios do ADMET, mostrando baixa toxicidade (Classe I), LogP ótimo (0,7) e distribuição favorável de absorção e eliminação do plasma. Apesar de sua afinidade mais fraca, o ligando 33 é um candidato mais semelhante a um medicamento. Esse contraste ilustra um princípio fundamental na descoberta de medicamentos em estágio inicial: alta afinidade de ligação por si só é insuficiente sem farmacocinética e segurança favoráveis. Ao mesmo tempo, compostos como o ligante 5, embora com baixo desempenho do ADMET, ainda podem fornecer ideias valiosas para andaimes para futuras otimizações, visando melhorar a segurança ou a estabilidade metabólica sem comprometer a potência.

Embora os filtros iniciais desse fluxo de trabalho sejam destinados à triagem e priorização, não à exclusão permanente, a simplificação adicional dos 50 candidatos designa alguns como "tops" aplicando limites desejáveis disponíveis nas ferramentas ADMET e na literatura. Dos 50 ligantes avaliados em 114 descritores relacionados ao ADMET e eletrônicos, 13 atenderam a pelo menos 95 dos critérios desejáveis de propriedade. Entre eles, seis compostos (10, 13, 14, 32, 43 e 47) demonstraram tanto perfis ADMET-S favoráveis quanto maiores afinidades de ligação para PLK1-PBD do que PLK2/3, sendo por isso designados como os principais inibidores candidatos (Figura 10). As análises comparativas estrutural-funcional e quantitativa de similaridade revelaram que os impactos identificados compartilham características farmacofóricas chave com inibidores conhecidos de PLK1-PBD, sugerindo possível convergência no comportamento de ligação. Todos os hits continham andaimes aromáticos ou heteroaromáticos que espelham os sistemas anéis hidrofóbicos de TQ, Poloxin e Allopole-A, permitindo interações π–π e hidrofóbicas dentro do bolso PBD. A sobreposição funcional foi evidente por meio de motivos conservados de ligações de hidrogênio (grupos carboxila, amida e carbonila) análogos àqueles que mediam contatos polares-chave nos inibidores de referência. Ligadores alifáticos e cíclicos flexíveis presentes em vários impactos paralelam a adaptabilidade conformacional dos análogos da Poloxina, facilitando a orientação para resíduos essenciais de ligação. Quantitativamente, as pontuações de similaridade com Tanimoto (0,36–0,54) confirmaram semelhança estrutural moderada entre os hits e os inibidores conhecidos, com os Hits 10, 13 e 14 sendo mais semelhantes à Poloxin, Hit 32 ao TQ, e Hits 43 e 47 ao Allopole-A. Coletivamente, esses resultados destacam uma clara sobreposição estrutural e funcional, indicando que os hits provavelmente imitam a topologia de ligação e os padrões de interação dos inibidores validados de PLK1-PBD, mantendo novidade suficiente para otimização futura (Figura 10).

Para avaliar a robustez do fluxo computacional, inibidores conhecidos de PLK1-PBD (Poloxinpan¹⁴ e Allopole-A¹⁵) foram analisados como controles positivos, com Metformina e Imeglimina (dois agentes antidiabéticos estruturalmente não relacionados sem atividade relatada de PLK1-PBD) como controles negativos nas análises de afinidade ADMET-S, acoplamento e ligação. Os controles positivos apresentaram afinidades de ligação de –5,8 e –5,6 kcal/mol, respectivamente, enquanto os controles negativos apresentaram afinidades mais fracas de –5,1 kcal/mol (Metformina) e –4,8 kcal/mol (Imeglimin), consistentes com a ausência de atividade de ligação ao PBD. Curiosamente, a avaliação do ADMET-S revelou que os controles negativos atenderam descritores mais desejáveis (88 de 114 propriedades) do que os controles positivos (80 de 114), validando assim a capacidade do fluxo de trabalho de distinguir favorabilidade farmacocinética do potencial de ligação específico do alvo. Essas ligações reforçam a importância de manter uma perspectiva equilibrada: compostos não devem ser descartados prematuramente apenas com base em previsões ADMET subótimas se apresentarem forte afinidade com alvo, pois tais andaimes ainda podem oferecer pontos de partida valiosos para otimização. Por outro lado, moléculas com excelentes propriedades farmacocinéticas, mas ligação fraca, podem servir como modelos de baixo risco para o desenvolvimento de análogos. Validações bioquímicas e celulares adicionais são necessárias para confirmar essas observações computacionais e refinar os critérios de priorização.

Figura 1: Comparações estruturais entre uma estrutura 4HCO não preparada e uma preparada pelo CHARMM-GUI. (A) Estrutura 4HCO carregada diretamente do PDB, destacando os resíduos ausentes. (B) Estrutura 4HCO após o protocolo de preparação CHARMM-GUI. O 4HCO (PLK1-PBD ligado a TQ) foi selecionado porque está entre os poucos cristais PLK1-PBD com ligação ao ligante orgânico, tornando-o diretamente aplicável a essa descoberta de inibidores de pequenas moléculas baseados em estrutura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Análise de componentes principais (PCA) de 999 produtos naturais compatíveis com Lipinski após agrupamento K-means baseado em impressão digital molecular e similaridade com Tenomo. Cada ponto representa um composto, colorido pelo seu cluster atribuído (1–50), com agrupamentos agrupados por elipses cinzas para enfatizar a similaridade química. O agrupamento apertado dentro dos clusters e a separação entre os clusters indicam que o agrupamento baseado em Tanimoto reduziu com sucesso a redundância estrutural, preservando a diversidade química em todo o conjunto de dados. Essa diversidade garante que os 50 ligantes representativos selecionados para acoplamento a jusante abrangam uma ampla região do espaço químico, aumentando a robustez e a generalização dos resultados da triagem virtual. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: O acoplamento cego CB-Dock2 identifica uma pose de ligação de alta afinidade do ligante 1 dentro do domínio da caixa de polo PLK1 (PBD). A conformação C2 de CurPocket exibida (escore Vina = −7,5 kcal/mol) representa a pose ótima entre cinco sítios de ligação previstos, caracterizada por contatos de van der Waals favoráveis e ligações de hidrogênio com resíduos principais de PBD (Trp414, His538 e Lys540). Esse resultado valida o uso do acoplamento cego baseado em estrutura para localizar bolsões de ligação biologicamente relevantes na ausência de um ligante cocristalizado, demonstrando como o fluxo de trabalho prioriza poses com a energia de ligação prevista mais forte para análise de seletividade a jusante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Mapa de calor do servidor web PRODIGY previu afinidades por combinações proteína-ligante. O mapa de calor aborda diretamente a sobreposição entre ligantes quando ligados a PLK1, PLK2 e PLK3. Enquanto alguns ligantes (incluindo o ligante 45) apresentam afinidades de ligação comparáveis entre as três isoformas PLK, sugerindo baixa seletividade, outros (notadamente os ligantes 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 e 49) apresentam forte preferência por PLK1 (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol vs. PLK2/PLK3), o que está alinhado com o objetivo da inibição seletiva por PBD. Quantitativamente, 20 dos 50 ligantes apresentam seletividade quase 2 vezes maior para PLK1 tanto em PLK2 quanto em PLK3, com base nos valores de ΔG previstos pelo PRODIGY. Essa ligação diferencial é atribuída a variações sutis nos bolsos de ligação PBD, que o protocolo de acoplamento cego captura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Representação das propriedades fisicoquímicas combinadas a partir do ADMETlab3.0 e SwissADME. Os parâmetros são: nHD = número de Doadores de Hidrogênio, nHA = número de Aceitadores de Hidrogênio, pKa básico, pKa ácido, nStereo = número de Estereocentros, LogP = n-octanol/coeficiente de distribuição de água, LogD = n-octanol/coeficiente de distribuição de água em pH=7,4, LogS = valor de solubilidade aquosa, Fsp3 = número de carbonos hibridizados sp3/contagem total de carbono, e nHet = número de Heteroátomos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Uma combinação dos resultados do ADME do ADMETlab3.0 e do SwissADME. (A) Gráfico de Ovo COZIDO do LogP Wildman-Crippin (WLOGP) vs. Área Superficial Polar Topológica (TPSA) do SwissADME representa a permeabilidade da Barreira Hematoencefálica (BBB) de Absorção e Distribuição na região amarela (gema), absorção pelo trato gastrointestinal (HIA) na elipse branca, substratos de P-glicoproteína e não-substratos em pontos azuis e vermelhos, respectivamente. Moléculas que ficam fora do "óvulo" são consideradas com baixa absorção e distribuição. (B) Mapa térmico do metabolismo com vários identificadores de Citocromo P450 (CYPs) envolvendo estabilidade do Metabolismo do Fígado Humano (HLM), onde o vermelho serve como inibidores/substratos e o verde como não-inibidores/não-substratos, deixando o verde como desejável. (C) A excreção envolve os parâmetros, a liberação do plasma e a meia-vida. A linha vermelha pontilhada indica uma depuração desejável do plasma (<5 mL/min/kg), enquanto 5-15 mL/min/kg e >15 mL/min/kg indicam folga moderada e alta, respectivamente.  Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: O perfil integrado de toxicidade revela responsabilidades críticas de segurança entre ligantes rastreados. (A) Distribuição das contagens de toxicóforos entre os 50 produtos naturais representativos, conforme previsto pelo ADMETlab3.0. (B) Resultados de toxicidade amostrada para ligante 1, indicando toxicidade Classe III destacada em vermelho, com uma explicação detalhada das Regras de Cramer relacionadas listadas na caixa de texto abaixo. Essa abordagem de dupla avaliação (toxicóforos + classe de Cramer) permite a triagem precoce de compostos de alto risco. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Energias da banda proibida HOMO–LUMO (em eV) para os 50 ligantes representativos derivados do produto natural, calculados usando ORCA no nível teórico B3LYP/def2-TZVP. A região sombreada (3,6 a 5,0 eV) denota a janela de estabilidade ideal: lacunas de banda abaixo de 3,6 eV sugerem alta reatividade química ou potencial de fotodegradação, enquanto valores acima de 5,0 eV podem indicar baixa polarizabilidade eletrônica e redução da adaptabilidade da ligação. Ligantes que se enquadram nessa faixa exibem um equilíbrio favorável entre estabilidade cinética e resposta molecular, apoiando sua priorização como potenciais candidatos a inibidores do PLK1-PBD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Fluxograma do fluxo de trabalho bilíngue de descoberta computacional de medicamentos. O pipeline começa com a preparação das estruturas PBD PLK1-PLK3, seguida por triagem focada em doenças no banco de dados SuperNatural 3.0 e filtragem via Regra dos Cinco de Lipinski (peso molecular ≤ 500 Da, doadores de ligações de hidrogênio ≤ 5, aceitadores ≤ 10, LogP ≤ 5). Compostos representativos são selecionados após agrupamento e então avaliados por meio de acoplamento proteína-ligante, predição de afinidade de ligação e perfil abrangente ADMET-S, incluindo absorção, distribuição, metabolismo, excreção, toxicidade e avaliação da estabilidade da MQ. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Sobreposição estrutural-funcional comparativa entre ligandos candidatos principais e inibidores conhecidos de PLK1-PBD. A figura destaca os seis principais compostos candidatos (10, 13, 14, 32, 43 e 47) identificados a partir das análises combinadas de triagem virtual, agrupamento, afinidade de ligação e perfil ADMET-S. Esses ligantes satisfizeram pelo menos 95 dos 114 descritores físico-químicos e farmacocinéticos desejáveis e apresentaram afinidades de ligação mais altas para PLK1-PBD em relação a PLK2/3. Para avaliar a possível convergência estrutural e funcional, cada ligante foi comparado com os inibidores conhecidos de PLK1-PBD TQ, Poloxin e Allopole-A, com base em motivos farmacofóricos centrais compartilhados e coeficientes de similaridade par a par de Tanimoto (impressões digitais ECFP4). Escores de similaridade moderados (0,36–0,54) e grupos funcionais comuns, como anéis aromáticos ou heteroaromáticos, pares doador/aceitador de ligações de hidrogênio e ligadores hidrofóbicos indicam sobreposição parcial nas características de ligação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Estágio do fluxo de trabalho	Checkpoint intermediário (como confirmar o sucesso)	Passo crítico (por que determina o sucesso/fracasso)	Problemas comuns e orientações para solução de problemas
1. Preparação de Proteína Alvo	• Arquivo PDB carrega sem erros na visualização Mol*. • Sem resíduos faltantes no bolso de ligação (inspeção visual). • Resíduos de histidina rotulados como "HIS" (não HSD/HSE)	Estrutura proteica imprecisa → falsos bolsões de ligação → poses de acoplamento enganosas. O CHARMM-GUI garante a protonação correta, a colocação do hidrogênio e a remoção de águas/ligandos.	Questão: O CB-Dock2 rejeita o arquivo PDB. Correção: Remover resíduos não padrão, garantir que apenas a cadeia proteica esteja presente e padronizar os nomes de átomos/resíduos usando um editor de texto.
2. Filtragem de Produtos Naturais (Regra dos 5 de Lipinski)	• "all.csv" contém apenas SMILES válidos (não em branco, quimicamente analisáveis). • Contagem de partidas esperadas (ex.: 999/1.193).	SMILES inválido trava RDKit, servidores de docking e ferramentas ADMET. A filtragem deve preservar a validade química.	Problema: O script falha durante o clustering. Correção: Adicionar validação SMILES usando Chem.MolFromSmiles (smiles, sanitiz=True) em Python; Registre e remova entradas inválidas antes de prosseguir.
3. Amostragem em Cluster	• 50 SORRISOS únicos em "rep_struct.txt". • Gráfico PCA (Fig. 2) mostra clara separação de clusters.	Agrupamento deficiente → representantes redundantes ou pouco diversos → triagem ineficiente.	Questão: Todas as moléculas se agrupam em um único grupo. Correção: Verificar o tipo de impressão digital (por exemplo, Morgan/ECFP4), o limite Tanimoto e a padronização do MILES. Considere aumentar a contagem de agrupamentos se a diversidade for baixa.
4. Acoplamento Proteína-Ligante (CB-Dock2)	• Cada ligante retorna ≥1 arquivo ".complex.pdb". • As pontuações Vina são negativas (por exemplo, ≤ −5 kcal/mol). • O ligando está posicionado no CurPocket (não na superfície).	Docking define posição de ligação e afinidade. Postura incorreta → previsões falsas do PRODIGY.	Problema: Trabalho falha ou ligando não está acoplado. Correção: Redesenhar ligante no CB-Dock2 usando SMILES; garantir que não haja caracteres especiais no nome do arquivo; Verifique o e-mail para saber o status da vaga. Se persistir, tente o SwissDock como backup.
5. Afinidade de Ligação (PRODIGY)	• PRODIGY retorna valores ΔG para todos os complexos. • Afinidades correlacionadas com as pontuações CB-Dock (Vina) (consistência de tendência).	A avaliação de seletividade depende da precisão do ΔG para PLK1 vs. PLK2/PLK3. IDs de cadeia/ligantes atribuídos incorretamente → previsões erradas.	Problema: erro "Corrente não encontrada". Correção: Abra .complex.pdb em um editor de texto; confirmar a identificação da cadeia proteica (por exemplo, "P") e o nome do resíduo do ligante (por exemplo, "UNL"); Entrada corretamente no PRODIGY.
6. Avaliação ADMET-S	• Todos os 50 SMILES retornam resultados no SwissADME, ADMETlab3.0 e ToxTree. • Não há linhas "N/A" ou "Erro" nos CSVs de saída.	Dados ADMET inconsistentes → classificação falha do candidato. Plataformas podem falhar em andaimes de produtos naturais exóticos.	Questão: ADMETlab3.0 rejeita SORRISOS. Correção: Canonize SMILES usando RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Para o ToxTree, insira uma molécula de cada vez e verifique a renderização estrutural.
7. Estabilidade Quântica (ORCA)	• Cada trabalho ORCA é concluído sem "SCF não convergido" ou "erro de geometria". • Valores HOMO/LUMO presentes no arquivo de saída (.out).	A banda proibida determina estabilidade/reatividade química. Trabalhos falhados = dados faltantes para filtro de chaves.	Problema: Trabalho da ORCA trava. Correção: Reotimizar a geometria em Avogadro; garantir que não haja átomos duplicados; aumentar o %maxcore ou mudar para a base def2-SVP para moléculas grandes.
8. Filtragem ADMET-S Integrada	• Lista final de ligantes atende a todos os critérios (por exemplo, LogP 0–3, gap de banda 3,6–5 eV, Classe de Cramer I/II). • ≥1 ligante mostra seletividade PLK1 (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol vs. PLK2/3).	Limiares excessivamente rígidos ou inconsistentes eliminam leads viáveis; Limiares muito flexíveis favorecem compostos tóxicos/instáveis.	Problema: Nenhum ligante passa por todos os filtros. Correção: Relaxe um critério de cada vez (por exemplo, permita LogP ≤ 4 ou 3 toxicóforos) e registre os trade-offs. Compare com medicamentos conhecidos para benchmarking.

Tabela 1: Pontos críticos de controle de qualidade, pontos de decisão de alto impacto e estratégias de solução de problemas ao longo do fluxo computacional bilíngue de oito estágios para identificar inibidores seletivos de PLK1-PBD. Cada linha corresponde a uma fase principal do protocolo, desde a preparação da proteína até a filtragem integrada ADMET-S e especifica (i) como verificar a conclusão bem-sucedida (checkpoint intermediário), (ii) por que a etapa é fundamental para o sucesso ou fracasso geral (justificativa da etapa crítica), e (iii) soluções práticas para falhas técnicas comuns (orientação de solução de problemas). Essa tabela serve tanto como roteiro de validação quanto como auxílio didático para estudantes e pesquisadores que implementam o protocolo em ambientes acadêmicos ou com recursos limitados.

Arquivo Suplementar 1: scripts em Python. Contém o script Python para aplicação de regras Lipinski; o script Python usado para análise de clustering; o script Python para cálculos de propriedades fisicoquímicas; o script R para análise metabólica; o script Python para análise de excreção; o script em Python para previsão de toxicidade; o script Python para avaliação de estabilidade; e as cadeias SMILES dos 50 compostos analisados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este estudo foca em um fluxo de trabalho computacional exploratório para identificar e avaliar potenciais inibidores PLK1-PBD por meio de triagem virtual, docking e análise ADMET-S. O pipeline prioriza efetivamente os compostos com base nas tendências de ligação previstas e nas propriedades farmacocinéticas. Neste protocolo, um conjunto de possíveis inibidores de PLK1 é identificado, e suas propriedades ADMET e afinidades de ligação para as proteínas PLK1–3 são avaliadas. O protocolo utiliza uma abordagem focada na doença para identificar 50 moléculas de um banco de dados de aproximadamente 73.400 (Figura 9). Em seguida, essas 50 moléculas foram submetidas à avaliação ADMET-S, durante a qual foram calculadas suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, semelhança com o medicamento e estabilidade. Além disso, sua afinidade de ligação às proteínas PLK1–3 foi calculada para avaliar sua potência inibitória contra PLK1 e seletividade. Com base nos resultados, várias moléculas apresentaram propriedades mais desejáveis. Estudos subsequentes de descoberta de fármacos podem optar por eliminar algumas moléculas e focar em algumas dessa exploração, ou podem evitar a eliminação precoce e usar esses resultados mais tarde no processo de projeto do fármaco para otimizar as propriedades do ADMET.

A justificativa biológica para focar em PLK1, PLK2 e PLK3, excluindo PLK4 e PLK5, baseia-se tanto em considerações estruturais quanto funcionais. PLK4 e PLK5 estão excluídos deste trabalho devido às suas diferenças estruturais e funcionais distintas em relação ao PLK1 e sua relevância limitada para a terapia do câncer. PLK1, caracterizado por seu domínio quinase e domínio polo-box (PBD), desempenha um papel fundamental na regulação de eventos mitóticos, tornando-se um alvo-chave para o tratamento^{do câncer 41}. Em contraste, PLK4 e PLK5 são estruturalmente divergentes: PLK4 contém uma caixa de polo enigmática (CPB) em vez de um PBD canônico e funciona principalmente na duplicação de centriolos. Ao mesmo tempo, PLK5 não possui um domínio quinase funcional e é expressa quase exclusivamente no^{cérebro 3}. Dada sua sobreposição estrutural mínima com a PLK1-PBD e a relevância limitada para a desregulação mitótica no câncer, sua inclusão não informaria de forma significativa a seletividade para inibidores da PLK1-PBD. Assim, a estratégia de triagem oferece uma estrutura biologicamente relevante e computacionalmente manejável para avaliar a seletividade. Importante destacar que os seis principais ligantes candidatos (10, 13, 14, 32, 43 e 47) apresentaram energias de ligação e perfis ADMET-S ainda mais favoráveis do que os inibidores conhecidos TQ e Allopole-A, destacando-os como potenciais moduladores PLK1-PBD.

Para apoiar uma implementação robusta, especialmente por estudantes ou pesquisadores novos em ferramentas computacionais de descoberta de medicamentos, um resumo dos principais checkpoints (também na seção de Protocolo), passos críticos e orientações para resolução de problemas do fluxo de trabalho é fornecido na Tabela 1. A Mesa apoia a adaptabilidade; por exemplo, se um usuário não tiver acesso ao HPC, ele pode observar que a análise de estabilidade do ORCA é adiável, e se um servidor web estiver fora do ar, alternativas como o SwissDock são sugeridas. Essa flexibilidade garante que o fluxo de trabalho permaneça viável em diversos contextos institucionais, mantendo o rigor científico e reforçando a novidade do estudo como uma contribuição inclusiva, bilíngue e voltada para a educação para a descoberta de medicamentos em estágio inicial. Embora todo o fluxo de trabalho seja projetado como um pipeline integrado, várias etapas cruciais determinam fundamentalmente seu sucesso ou fracasso ( veja a Tabela 1). Além disso, o vídeo que acompanha traz legendas sincronizadas em inglês e um sinalizador em Língua de Sinais Americana (ASL), projetado para proporcionar acesso equitativo sem distrações. As instruções do sinalizador são alinhadas temporalmente com ações na tela, por exemplo, assinar "próximo" e depois pausar enquanto o cursor clica no botão "Próximo". Durante a etapa de preparação do 4HCO, o sinalizador usa rotulagem com os dedos ("A" e "B") para guiar a seleção da cadeia, espelhada precisamente na gravação da tela. No segmento de exibição SuperNatural 3.0, a janela do sinalizador se redimensiona e se move para o canto superior direito enquanto direciona a atenção para o ícone do "caminho", pausando enquanto o cursor segue. Essas escolhas de design garantem que espectadores surdos e com deficiência auditiva recebam a mesma orientação integrada e em tempo real que os usuários ouvintes, replicando efetivamente uma experiência presencial de laboratório liderada por um instrutor.

Além dos benefícios, existem inúmeras maneiras de melhorar o fluxo de trabalho. Primeiro, o filtragem inicial pode ser modificada; Em vez de métodos focados em doenças e amostragem em clusters, pode-se começar com simulações de acoplamento de todas as moléculas no banco de dados de produtos naturais para identificar quais compostos são mais adequados para a ligação de proteínas ligante-alvo. Além disso, estimativas mais detalhadas são necessárias para uma previsão precisa da afinidade de ligação.  Os cálculos "sem eletrostática" do PRODIGY sobre afinidade proteína-ligante envolvem ajustar as contagens dos tipos categorizados de contatos atômicos envolvidos na interação (Carbono-Carbono, Nitrogênio-Nitrogênio, Oxigênio-Oxigênio e outros átomos) em um modelo treinado de regressão linear múltipla com validação cruzada 4 vezes, e esse método correlacionou-se significativamente com afinidades experimentais em várias ocasiões^42,43.  Abordagens alternativas, como FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, modelos de aprendizado^{profundo 46} e MD com amostragem avançada, podem ser empregadas, e graus variados de concordância nas previsões são esperados dependendo da precisão de cada^{método 47}.

Outro aspecto é que as diversas ferramentas de software usadas na avaliação ADMET-S geram diversas métricas, e compreender cada métrica usada para avaliar a candidatura a medicamentos é fundamental. Uma forma de garantir a precisão pode ser submeter vários medicamentos no mercado ao protocolo para determinar como eles atendem aos limiares.  Nesse contexto, a toxicidade requer mais pesquisas, pois moléculas não são descartadas apenas com base em perfis de toxicidade de árvores de decisão nuançadas como as Regras de Cramer, pois muitos medicamentos disponíveis para uso possuem classificações semelhantes.  O número de toxicóforos também não é totalmente informativo sobre toxicidade, mesmo em conjunto com perfis de toxicidade.  Nesse contexto, uma extensão desse fluxo de trabalho seria realizar revisões comparativas de amostras de pequenas moléculas com medicamentos disponíveis para orientar interpretações.  Por exemplo, pesquisadores consultaram literatura anterior documentando a aplicação e observações de cálculos de DFT em medicamentos atuais para câncer de mama, como Tamoxifeno⁴⁸, Letrozol⁴⁹ e^{Cisplatina 50}, ao interpretar a estabilidade determinada por cálculos de MQ dos valores de banda proibida do HOMO–LUMO. Anteriormente, fluxos de trabalho semelhantes foram adotados para identificar potenciais inibidores para vários alvos de doenças/distúrbios⁵¹. Recentemente, Stafford et ^al.6 revisaram estratégias de desenho de inibidores PLK1-PBD e oportunidades terapêuticas no câncer. A maioria dos estudos mais recentes identificou inibidores de dupla direcionamento contra PLK1-PBD e PLK4-PB3 usando modelagem de farmacofóforo guiada por estrutura, triagem virtual, acoplamento molecular, simulação de dinâmica molecular (MD) e avaliação^{biológica 52}. Zhou et al. também identificaram inibidores PLK1-PBD da biblioteca de produtos naturais marinhos usando o farmacofóforo QSAR 3D, ADMET, saltos de andaimes, acoplamento molecular e MD⁵³.

No geral, a novidade deste estudo é quádrupla. Primeiro, é um protocolo computacional bilíngue, oferecido tanto em Língua de Sinais Americana quanto em Inglês, promovendo assim a acessibilidade e inclusão em STEM, especialmente para estudantes e pesquisadores surdos e com deficiência auditiva. Essa entrega bilíngue é rara na descoberta computacional de medicamentos e está alinhada com a missão da Universidade Gallaudet de promover uma educação científica equitativa. Segundo, embora PLK1 continue sendo um alvo anticâncer convincente, estudos computacionais rigorosos avaliando a seletividade entre PLK1, PLK2 e PLK3 usando critérios estruturais, energéticos e ADMET-S integrados são escassos. A maioria dos esforços anteriores foca exclusivamente na inibição do domínio da quinase ou carece de perfil seletivo comparativo. Este trabalho preenche essa lacuna fornecendo um protocolo inicial e exploratório de triagem concorrente contra três PLK-PBDs, com filtros que priorizam compostos com base em alta afinidade PLK1 e ligação mínima fora do alvo. Terceiro, o fluxo de trabalho foi projetado pensando em eficiência e usabilidade, especialmente para ambientes educacionais e com recursos limitados. Todo o pipeline, desde a filtragem de banco de dados até a avaliação do ADMET-S, pode ser concluído em até duas semanas em hardware acadêmico padrão (um laptop com 8 GB de RAM), utilizando software gratuito baseado na web (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). Os cálculos de afinidade de acoplamento e ligação não são etapas que demandam muito tempo (~30 segundos por ligante). A etapa que consome mais tempo é a análise de estabilidade de MQ com ORCA, que pode ser adiada para estágios posteriores ou executada em recursos computacionais de alto desempenho, como demonstrado. Os scripts são modulares e exigem apenas edições básicas em linha de comando ou no Jupyter Notebook, permitindo integração perfeita nos currículos existentes. O tempo de execução é modesto, com filtragem de banco de dados e conformidade com Lipinski levando minutos; O agrupamento de ~1.000 moléculas é concluído em menos de 30 minutos em uma área de trabalho típica. Todas as ferramentas de software estão disponíveis gratuitamente para uso acadêmico, multiplataforma (Windows, macOS, Linux) e não requerem licenças comerciais, reduzindo drasticamente as barreiras de entrada. Quarto, os ligantes identificados demonstram afinidades promissoras de ligação consistentes com interações na faixa dos nanomolares, aliadas a semelhança favorável com medicamentos, estabilidade metabólica e baixos perfis de toxicidade. Vários candidatos emergem como ligantes fortes e seletivos de PLK1-PBD com propriedades desejáveis do ADMET-S, justificando validação adicional por meio de simulações de dinâmica molecular ou ensaios in vitro .

Portanto, além de sua utilidade metodológica, este estudo exemplifica como ferramentas computacionais acessíveis, de código aberto e eficientes podem ser aproveitadas como ponto de partida para enfrentar um desafio biomédico de alto valor, ao mesmo tempo em que promove um treinamento científico inclusivo. À medida que os inibidores do PLK1-PBD continuam ganhando força na oncologia, esse fluxo de trabalho fornece um plano reproduzível e educacional para a descoberta de medicamentos em estágio inicial. Sua versatilidade o torna adequado para o ensino médio, graduação e pós-graduação, e oferece uma excelente base para CUREs que oferecem aos estudantes oportunidades autênticas e práticas de pesquisa. Diferentemente dos pipelines que dependem exclusivamente do acoplamento de domínio quinase ou triagem de proteína única, a abordagem avalia simultaneamente a seletividade do PBD em PLK1–3, uma necessidade dada sua homologia estrutural de >38% e papéis biológicos divergentes. Além disso, ao combinar clustering, ADMET-S e estabilidade de QM em um framework de acesso aberto, o risco de redundância e atrito foram reduzidos em relação à triagem virtual por força bruta.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	Simulations Plus. Inc	V3.0	Propriedades ADMET
Alphafold	Pesquise DeepMind & Isomorphic Labs (subsidiárias da Alphabet)	V3.0.1	Modelagem de proteínas 3D
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Sistema de gerenciamento de pacotes open source
CB-Dock2	Laboratório Yang Cao	V2.0	Acoplamento cego proteína-ligante
CHARMM-GUI	Universidade Lehigh	V3.8	Manipulação e simulação biomolecular
DARWIN no ACCESS	Universidade de Delaware	N/A	Computação de alto desempenho
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Pacote de química quântica
Banco de Dados de Proteínas	Banco Mundial de Dados de Proteínas	RRID:SCR_006555	Banco de dados de proteínas
RDKit	Código aberto	RRID:SCR_014274	Programação em quimioinformática
SuperNatural 3.0	Instituto de Fisiologia e Ciência-TI (Berlim)	V3.0	Biblioteca de moléculas naturais
SwissADME	Instituto Suíço de Bioinformática	RRID:SCR_017865	Propriedades do ADME
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Classificação de toxicidade