Artigo de método

Estimativa de RNA contendo repetições teloméricas a partir de complexos híbridos DNA/RNA

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 de dezembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo permite o isolamento de híbridos DNA:RNA e seus RNAs associados (incluindo TERRA) em múltiplos tecidos. Embora nossa abordagem capture um subconjunto de interações híbridas, seria necessário mapeamento genômico adicional para caracterização genômica completa em todo o genoma.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O RNA contendo repetições teloméricas (TERRA) é um longo RNA não codificante transcrito de todos os telômeros em eucariotas superiores, e apenas um subconjunto dessas moléculas forma híbridos estáveis de DNA/RNA nos telômeros. Apresentamos um protocolo molecular detalhado para identificar e purificar essas estimativas híbridas. Esse método simplificado permite a extração direta de interações híbridas DNA/RNA formadas naturalmente in vivo e pode ser aplicado para detectar todas essas regiões. Ao minimizar etapas procedimentais, essa técnica é altamente eficiente em isolar o RNA ligado ao DNA, estimando a confiabilidade e reprodutibilidade do sequenciamento a jusante. O reagente de isotiocianato de guanidina é usado para lise e homogeneização total das células, preservando a integridade dos ácidos nucleicos (DNA e RNA), especialmente híbridos DNA/RNA. A adição de clorofórmio inicia a separação de fases por centrifugação (três camadas distintas): uma fase inferior de fenol-clorofórmio, uma interfase e uma fase aquosa superior. O RNA, liberado tanto do núcleo quanto do citoplasma, é retido na fase aquosa, enquanto o DNA de alto peso molecular, incluindo as regiões híbridas DNA/RNA, fica confinado à interfase. Com álcool isopropílico, seguido pela centrifugação, a fase aquosa (RNA livre), a interfase e o DNA, especialmente híbridos DNA/RNA, são recuperados. Para remover os vestígios restantes de proteínas, a amostra é incubada com a Proteinase K. Tratamento com DNase, extração de fenol/clorofórmio, álcool isopropílico e centrifugação são usados para liberar RNA hibridizado ao DNA.

Introdução

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A transcrição do genoma resulta na formação de moléculas híbridas temporárias, conhecidas como R-loops, que consistem em estruturas de três fias. Essas estruturas incluem as fitas não codificantes e codificantes do DNA, com a fita não codificante sendo substituída pela formação de híbridos com o RNA complementar1. Durante a transcrição do genoma, um grande número de RNAs não codificantes é produzido em taxas variadas a partir de ambas as cadeias de DNA. A maioria desses RNAs atua como intermediários de curta duração, mas alguns desempenham papéis críticos nas redes regulatórias que regem a biologia do genoma, especialmente aquelas originadas de regiões não codificantes, como telômeros ecentrômeros 1. A distribuição dos híbridos DNA/RNA no genoma também pode refletir a atividade transcricional das células em qualquer momento.

À medida que cresce o interesse nas funções regulatórias de RNAs não codificantes, há um interesse crescente em acompanhar sua transcrição e distribuição pelo genoma, especialmente na forma de híbridos temporários DNA/RNA. Para resolver isso, desenvolvemos um ensaio independente para a detecção de híbridos estáveis de DNA/RNA, aplicável a qualquer célula ou tecido biológico. Esse método permite o isolamento de RNAs complementares que co-purificam com o DNA, seguido por análise via precipitação ou sequenciamento por PCR.

Pesquisas de modelos de cultura celular estabeleceram que, durante a replicação e transcrição do DNA, o estresse de replicação, danos ao DNA, colisões de forquação de replicação e pausas da RNA polimerase II podem ocorrer devido a eventos topológicos, estruturais e de hibridização. Esses processos, especialmente o desenrolamento da dupla hélice do DNA, introduzem estresse torsional, que pode levar à formação de estruturas anormais, como laços R, durante a transcrição1.

A maioria dos dados do R-loop foi gerada usando células cancerígenas de levedura ou cultivadas, baseando-se no anticorpo monoclonal específico de híbrido DNA-RNA S9.6. Estudos estruturais mostraram que o fragmento de ligação ao antígeno (Fab) de S9.6 se liga especificamente a um híbrido RNA-DNAde 13 pb. A detecção de R-loops baseada em anticorpos identificou principalmente híbridos que se formam em regiões ricas em guanina durante a transcrição, onde a hibridização aprimorada RNA-DNA provavelmente ocorrerá. Estudos in vitro usando o anticorpo S9.6 sugerem que RNAs contendo quatro ou mais guaninas consecutivas próximas à extremidade 5′ são mais facilmente detectados, correlacionando-se com o aumento da formação de laçosR 1. Diversas enzimas, como helicases, topoisomerases, RNase H1 e RNase H2, ajudam a manter o equilíbrio do loop R durante a transcrição. A perturbação da homeostase do R-loop está ligada ao aumento da instabilidade genômica, contribuindo para doenças como câncer e distúrbiosneurodegenerativos 2.

Telômeros, antes considerados transcricionalmente silenciosos, foram encontrados transcrevendo RNAs longos e não codificantes conhecidos como RNA Contendo Repetições Teloméricas (TERRA)3. Esses transcritos se originam de regiões subteloméricas e contêm repetições teloméricas, desempenhando papéis essenciais na manutenção da homeostase dostelômeros 4. Neste manuscrito, referimo-nos ao 'RNA TERRA-híbrido' como as moléculas de RNA liberadas de complexos híbridos DNA/RNA via tratamento com DNase I, presumivelmente incluindo sequências TERRA baseadas nas propriedades de extração e na especificidade do primer.

A transcrição do TERRA ocorre na direção do centrómero para o telômero e é variável em duração, variando de 100 bp a 9 kb, com a maior parte do TERRA sendo recuperada na fase aquosa como molécula de RNA livre. Uma pequena fração permanece ligada ao DNA e está associada a processos biológicos chave, como câncer e envelhecimento 4,5. Os níveis de TERRA variam dependendo dos loci subteloméricos e são regulados pelo estado heterocromático dostelômeros 6. Estudos de cultura celular também indicam que transcritos TERRA de várias regiões subteloméricas apresentam heterogeneidade em comprimento. Em alguns estudos de cultura celular derivados de tumores, pesquisadores descobriram que a região subtelomérica 20q é a principal fonte de transcritos TERRA, e essa região é frequentemente metilada em suas ilhas CpG 7,8,9. Em camundongos, a região subtelomérica do cromossomo 18 é um dos principais locais de produção doTERRA 10,11. Além disso, os PAR-TERRAs, que são transcritos TERRA originados de regiões pseudoautossômicas subteloméricas em células embrionárias, demonstraram ter até 200 vezes mais TERRA em comparação com os cromossomos 18,11,12.

A transcrição do TERRA é controlada pela metilação do DNA e modificações de histonas, como a trimetilação H3K9 e H4K20, que suprimem o TERRA, enquanto a acetilação das histonas se correlaciona positivamente com a transcrição doTERRA 6,13,14. O TERRA também se liga a regiões extrateloméricas, incluindo sítios intergênicos e introns, indicando um papel mais amplo na regulação dogenoma 2.

Além disso, a diminuição do TERRA leva à desregulação de inúmeros genes, especialmente aqueles próximos aos seus locais de ligação, sugerindo seu papel na regulação epigenética da cromatina e da expressãogênica 2. A acumulação de TERRA em telômeros encurtados promove a extensão baseada em recombinação homóloga (HR), contribuindo para a homeostase do comprimentodos telômeros 15,16.

Para abordar o papel do TERRA e de outros híbridos DNA/RNA, empregamos um ensaio especificamente projetado para isolar moléculas de RNA hibridizadas de forma estável ao DNA. Brevemente, núcleos foram isolados e tratados com RNase livre de DNase para remover RNa desprotegido. Híbridos DNA/RNA foram então extraídos usando digestão seletiva de DNase, que libera RNA originalmente hibridizado com DNA. Essa fração, chamada de "RNA associado ao híbrido DNA/RNA", foi posteriormente analisada por RNA-seq e comparada ao RNA solúvel total obtido pela extração padrão de fenol-clorofórmio17. Essa abordagem nos permitiu identificar tanto sítios teloméricos quanto não teloméricos da formação de híbridos RNA-DNA, além de comparar os perfis transcriptômicos de pools de RNA ligados ao DNA versus reservas solúveis. Antes considerado apenas um subproduto da transcrição dos telômeros, o TERRA é agora reconhecido por seu papel duplo na manutenção dos telômeros, influenciando a atividade da telomerase e a recombinação homóloga, que são cruciais para a homeostase do comprimento dos telômeros. Além disso, avanços nos ensaios de detecção permitiram uma compreensão mais detalhada das interações dinâmicas entre RNA e DNA ao longo do genoma. Esse conhecimento abre caminho para uma exploração mais aprofundada das implicações dos híbridos DNA/RNA, como o TERRA, nos processos celulares e suas potenciais ligações com doenças como câncer e distúrbios neurodegenerativos. A pesquisa em andamento nessa área, sem dúvida, aprofundará nossa compreensão da regulação genômica e sua relevância para saúde e doença.

O método usado para identificar moléculas TERRA e híbridos DNA/RNA neste estudo é o mesmo protocolo otimizado de extração de guanidinium-tiocianato-fenol-clorofórmio detalhado aqui. Esse protocolo foi desenvolvido para permitir o isolamento simultâneo de híbridos RNA-DNA/RNA, RNA total e DNA genômico dentro de um fluxo de trabalho unificado. Ao modificar estrategicamente o método clássico de separação trifásica, esse protocolo facilita a retenção seletiva de híbridos DNA/RNA na interfase do fenol, minimizando assim sua perda — uma limitação inerente às técnicas convencionais de extração.

Tradicionalmente, a detecção e isolamento de híbridos DNA/RNA dependiam da imunoprecipitação com o anticorpo monoclonal S9.6, que reconhece especificamente estruturas híbridas DNA/RNA 18,19. Essa abordagem baseada em S9.6, embora amplamente utilizada, pode ser limitada pela acessibilidade de anticorpos, custo e potencial reatividade cruzada. Em contraste, nosso protocolo oferece uma alternativa econômica e independente de anticorpos, facilmente aplicável tanto a amostras celulares quanto a amostras derivadas de tecidos.

Para aprimorar ainda mais a pureza e a integridade estrutural da fração isolada de DNA/RNA híbrido, incorporamos desproteinização mediada por K por proteinase, seguida do tratamento com DNase I. O passo da DNase I digere seletivamente a fita de DNA dos híbridos DNA/RNA, liberando assim o RNA hibridizado para posterior isolamento e análise molecularposterior 20. Essa abordagem garante que as espécies de RNA recuperadas sejam especificamente aquelas que foram hibridizadas de forma estável com DNA in vivo. Devido à sua configuração modular e escalabilidade, nosso protocolo é amplamente adaptável a diversos contextos biológicos, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta robusta para interrogar a biologia híbrida DNA/RNA em uma ampla variedade de sistemas experimentais.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Erciyes (licença número 19-07-2019, decisão nº 19/127). Camundongos Balb/c foram usados neste estudo: cinco fêmeas saudáveis, 6 semanas de idade (25 g) e cinco machos, 8 semanas de idade (30 g). Os ratos eram cuidados e tratados de acordo com os Princípios de Cuidado com Animais de Laboratório (regras europeias). O estudo apresentado aqui utilizou amostras de sangue de 13 sujeitos saudáveis do controle, derivadas de um projeto de pesquisa anterior que recebeu aprovação ética do Comitê de Ética Humana da Universidade Erciyes (Decisão nº 17/002). Um resumo gráfico deste protocolo é fornecido na Figura 1. Use materiais livres de RNase e técnicas assépticas em todas as etapas para minimizar a degradação do RNA.

1. Manejo de ratos

  1. Para determinar a dosagem anestésica adequada necessária para a eutanásia, pesar cada camundongo e administrar cetamina em doses de 60 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg por injeção intraperitoneal.
  2. Após administrar anestesia, confirme a anestesia total pela ausência do reflexo de retirada do pedaço (beliscão do dedo) e pela falta de resposta à estimulação tátil. Após a confirmação da anestesia, realizar a eutanásia por luxação cervical.

2. Amostras humanas

  1. Selecione os participantes como controles saudáveis após a triagem para excluir qualquer histórico de doenças crônicas (como diabetes, doenças cardiovasculares, hipertensão ou câncer), infecções agudas, distúrbios autoimunes ou inflamatórios, condições neurológicas ou psiquiátricas e uso recente de medicamentosprescritos 17.
  2. Colete amostras de biópsia de pele da área atrás do joelho (fossa poplítea) de cada voluntário usando uma ferramenta de punção de 2 mm. Administre anestesia local por via subcutânea antes do procedimento e realize todas as biópsias em condições estéreis.

3. Extração híbrida DNA/RNA de todos os tipos celulares

  1. Coleta e lise de tecidos
    1. Para cada extração, use 500 μL de sangue cardíaco, complexo hipotálmico-hipófise inteiro, glândula adrenal inteira ou coleta de amostra de esperma de um único camundongo.
    2. Transfira todas as amostras coletadas para tubos estéreis de 1,5 mL. Adicione 500 μL de fenol a cada tubo. Faça amostras de sangue de vórtice para misturar cuidadosamente.
      1. Para amostras de tecido, homogeneize completamente usando uma seringa de 2 mm até que não restem fragmentos visíveis.
    3. Coloque os tubos sobre um bloco de resfriamento para manter a integridade da amostra.
      NOTA: Sempre siga as diretrizes de segurança laboratorial ao manusear reagentes perigosos como fenol, clorofórmio e acetato de amônio.
  2. Separação de fases
    1. Adicione 180 μL de clorofórmio a cada tubo e faça um vórtice breve para misturar. Incube os tubos no gelo por 15 minutos para permitir a separação de fase.
    2. Inspecione as amostras – certifique-se de que a fase aquosa esteja clara. Se a fase estiver turva, faça vórtice novamente e volte ao gelo por mais 5 minutos.
    3. Centrifuge amostras a 12.000 × g, 4 °C por 15 minutos.
  3. Precipitação de RNA
    1. Transfira cuidadosamente a fase aquosa clara para um novo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL colocado sobre um bloco de resfriamento.
    2. Adicione um volume igual (1:1) de isopropanol à fase aquosa, misture brevemente em vórtice e incube no gelo por 15 minutos.
    3. Centrifugar a 12.000 × g, 4 °C por 15 minutos.
      NOTA: O pellet de RNA deve ser visível na parte inferior do tubo.
  4. Lavagem do pellet de RNA
    1. Inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante sem mexer na bola.
    2. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% ao pellet. Bata suavemente no tubo por 5 segundos para lavar.
    3. Centrifugar a 7.500 × g, 4 °C por 5 minutos.
    4. Inverta o tubo para descartar o sobrenadante. Repita a lavagem com etanol 2 vezes (totalizando três lavagens).
  5. Purificação de RNA
    1. Após a lavagem final com etanol, inverta o tubo e deixe qualquer etanol residual secar ao ar ou remova cuidadosamente com uma pipeta.
    2. Adicione 100 μL de água sem RNase ao pellet de RNA e pipetee suavemente para cima e para baixo ou faça um movimento no tubo para ressuspender completamente o RNA.
      NOTA: Sempre mantenha amostras de RNA no gelo ou em um rack/bloco de resfriamento gelado para evitar degradação.
  6. Quantificação e armazenamento de RNA
    1. Coloque o tubo contendo RNA ressuspenso sobre gelo.
    2. Meça a concentração e pureza do RNA usando um espectrofotômetro. Registre a absorção em 260 nm (A260) para determinar a concentração de RNA. Avalie a pureza calculando as razões A260/A280 e A260/A230.
    3. Use apenas amostras de RNA com razões A260/A280 entre 1,9 e 2,1 para aplicações posteriores.
      NOTA: Neste estudo, as concentrações típicas de RNA variaram de 100 a 180 ng/μL.
    4. Armazene amostras de RNA a −80 °C até novo uso.
  7. Remoção de proteínas e isolamento do DNA
    1. Após o isolamento de RNA, mantenha-se a interfase da etapa de extração do fenol.
      NOTA: Esta etapa é necessária porque a interfase contém DNA, que pode ser processado posteriormente para isolamento de DNA após adição e centrifugação de fenol.
    2. Prossiga com a extração de DNA seguindo os passos 3.2.1-3.4.1, começando com a interfase como material inicial. Transfira cuidadosamente toda a interfase (contendo DNA) da extração de fenol para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL mantido em uma grade de resfriamento.
    3. Digestão de proteínas: Adicione 0,5 mL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL Proteinase K) ao tubo. Incube durante a noite a 56 °C para digerir as proteínas.
    4. Precipitação salina do DNA
      1. No dia seguinte, adicione 100 μL de acetato de amônio 5 M a cada amostra e misture brevemente. Centrifuge a 1.788 × g por 20 minutos em temperatura ambiente.
      2. Transfira cuidadosamente a fase aquosa clara para um novo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione um volume igual de isopropanol de grau de biologia molecular (proporção 1:1) à fase aquosa, misture por inversão suave e centrifuge a 1.788 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante sem mexer na bola de DNA.
      3. Lave o pellet de DNA com 1 mL de etanol 70%, depois centrifuge a 1.788 × g por 10 minutos.
      4. Remova e descarte o lavado com etanol. Deixe o pellet de DNA secar o ar por um instante.
      5. Ressuspenda o pellet de DNA seco em 50 μL de água sem nuclease.
  8. Remova o ácido nucleico livre para limpar o DNA:
    1. Carregue o DNA dissolvido em uma coluna de spin de DNA. Centrifuge a 15.000 × g por 15 s e descarte o fluxo de fluxo.
    2. Lave a coluna duas vezes com etanol 70%, centrifugando cada vez por 1 minuto a 15.000 × g. Descarte o fluxo de fluxo após cada lavagem.
    3. Transfira a coluna de spin para um tubo de coleta limpo de 1,5 mL. Adicione 30 μL de água livre de nuclease à matriz da coluna, incube em temperatura ambiente por 5 minutos e depois centrifuge por 1 minuto a 15.000 × g para eluir o DNA.
    4. Coloque o DNA eluído no gelo. Divida a amostra em dois tubos: um para armazenamento de DNA a 4 °C, o segundo para extração subsequente de híbridos DNA/RNA.
  9. Extração de RNA ligado ao DNA (Híbridos DNA/RNA)
    1. Tratamento com DNase
      1. Prepare uma mistura de digestão de DNase combinando 5 μL (15 U) de DNase I e 75 μL de 10x tampão de digestão de DNase.
      2. Adicione 80 μL da mistura de DNase ao pellet de DNA seco. Incube a amostra em temperatura ambiente por 15 minutos.
    2. Extração de fenol e clorofórmio
      1. Adicione 300 μL de fenol à amostra e incube em temperatura ambiente por 5 minutos.
      2. Adicione 180 μL de clorofórmio à mistura e incube por mais 5 minutos em temperatura ambiente.
      3. Centrifuge à velocidade máxima (por exemplo, 15.000 × g) por 10 minutos a 4 °C para separar as fases. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior (contendo híbridos RNA:DNA) para um novo tubo.
  10. Isolamento híbrido DNA/RNA
    1. Complete o isolamento dos híbridos DNA/RNA dos passos 3.3 a 3.5.2.
    2. Adicione um volume igual (1:1) de isopropanol à fase aquosa, misture brevemente em vórtice e incube no gelo por 15 minutos.
    3. Centrifugar a 12.000 × g, 4 °C por 15 minutos. Procure o pellet de RNA no fundo do tubo. Inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante sem mexer na bola.
    4. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% ao pellet. Bata suavemente no tubo por 5 segundos para lavar. Centrifuge a 7.500 × g, 4 °C por 5 minutos. Inverta o tubo para descartar o sobrenadante. Repita a lavagem com etanol 2 vezes (totalizando três lavagens).
  11. Purificação de RNA:
    1. Após a lavagem final com etanol, inverta o tubo e deixe qualquer etanol residual secar ao ar ou remova cuidadosamente com uma pipeta.
    2. Adicione 30 μL de água livre de RNase ao pellet híbrido DNA/RNA e pipetee suavemente para cima e para baixo ou estale o tubo para ressuspender completamente o RNA.
    3. Armazene amostras híbridas de DNA/RNA a −80 °C até novo uso.

4. Síntese de cDNA

NOTA: Garanta a integridade de RNA, cDNA e DNA utilizando materiais livres de RNase/DNase e mantendo amostras no gelo durante todo o procedimento.

  1. Para cada amostra, use 6 μL (20 ng de RNA; como isolado no Passo 3.6.5 para RNA livre ou no Passo 3.13.3 para RNA híbrido DNA/RNA). Transfira o volume necessário de RNA para tubos de PCR marcados.
  2. Prepare a mistura master de síntese de cDNA conforme as instruções do fabricante do kit. Para cada reação, certifique-se de que a mistura master contenha transcriptase reversa, dNTPs, primers, tampão e inibidores de RNase. Para cada reação, combine 14 μL de mistura master com 6 μL da amostra de RNA em um tubo PCR (volume total: 20 μL por reação). Incluir pelo menos um controle sem transcriptase reversa (-RT) preparando uma reação paralela sem adicionar a enzima transcriptase reversa, usando a mesma quantidade de RNA.
  3. Realize a síntese de cDNA em um ciclador térmico usando o programa de temperatura especificado na Tabela 1.
  4. Dilua o cDNA resultante 1:5 com água livre de nuclease e armazene a −80 °C até a análise qPCR.

5. Determinação dos níveis de expressão do TERRA via Q-PCR

  1. Prepare a mistura de reação qPCR usando um kit de qPCR à base de SYBR Green, seguindo as instruções do fabricante. Para cada reação, combine 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL de primer direto para TERRA (ver Tabela 2), 0 μL de primer reverso para TERRA (veja b) e μL de água livre de nuclease.
  2. Dispense 16 μL da mistura de reação em cada poço de uma placa qPCR de 96 poços.
  3. Adicione 4 μL de cDNA diluído (do Passo 4.6) a cada poço, para um volume final de reação de 20 μL.
    NOTA: Para cada amostra, inclua pelo menos dois réplicas técnicas e duas réplicas biológicas. Incluir controles sem modelo (NTCs) para verificar contaminação e controles sem transcriptase reversa para garantir especificidade para sinais derivados de RNA.
  4. Realize qPCR usando o programa de temperatura especificado na Tabela 3.
  5. Normalize a expressão de TERRA para β-Actina (gene de limpeza) usando o método 2-ΔΔCt .

6. Determinação do comprimento dos telômeros

  1. Prepare a mistura qPCR para medição do comprimento dos telômeros 21. Para cada reação, combine 1 μL de SYBR Green Master Mix, 0 μL de primer frontal de telômeros (ver Tabela 2]), 0 μL de primer reverso de telômeros (ver Tabela 2) e μL de água livre de nuclease.
  2. Dispense 16 μL da mistura de reação de telômeros em cada poço de uma placa qPCR de 96 poços.
  3. Adicione 4 μL de DNA genômico (do Passo 3.10.5) a cada poço, para um volume final de reação de 20 μL.
  4. Realize a qPCR de acordo com os parâmetros apropriados do programa especificados pelo fabricante (veja a Tabela 3).
  5. Paralelamente, configure reações para um gene de referência de cópia única (36B4) usando as mesmas concentrações e volume final.
  6. Curvas padrão foram geradas usando diluições seriadas de um oligonucleotídeo telomérico sintético (Tabela 2) para estimar abundância relativa e eficiência de amplificação. A quantificação absoluta não foi realizada. O comprimento relativo dos telômeros é calculado como a razão T/S (número de cópias repetidas dos telômeros para número de gene de cópia única) usando o métodoΔCt 21.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, quantificamos e comparamos os níveis de TERRA livre, híbrido de DNA e RNA TERRA e comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos de camundongos (sangue, esperma, pele, hipotálamo, hipófise, adrenal), bem como em amostras de sangue e pele humanas, para investigar dinâmicas específicas de tecidos e a relação com a biologia dos telômeros. O Free TERRA foi isolado da fase aquosa após extração de fenol-clorofórmio (etapas do prot...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma força central do protocolo apresentado aqui está na extração e discriminação gradual de TERRA livre e híbrido DNA/RNA TERRA de amostras complexas de tecido. Passos críticos incluem a separação cuidadosa das frações aquosa e interfásica durante a extração de fenol-clorofórmio, pois a contaminação cruzada pode confundir a distinção entre TERRA livre e híbrido. O tratamento subsequente da DNase I da fração de interfase também é fundamental: digestão insuficiente pode deixar o RNA ligado...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à Unidade de Pesquisa Científica da Universidade Erciyes pelo apoio a este trabalho com os números de bolsa TYL-2019-9224 e TSA-2022-11929.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de PCR de 0,2 mL  Greiner671201
Tubos Falcon de 15 mLIsolab078.02.001
Seringa de 2 mLHayatN/A
96 - Placa MultipoçoGreiner50-720-3203
Etanol AbsolutoMerck1070172511
Acetato de AmonniumSigma238074-500G
Kit de Síntese de cDNARoche07 912 439 001
ClorofórmioMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Garrafa de vidroIsolabLB. IS.061.01.901
Cilindro graduadoIsolab  015.01.901
Guanidina isotiocianato  SigmaG9277-100G
IsoproponenteMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)Greiner616201
Micropipetas (10 & micro; L)GilsonFD10001
Micropipetas (100 & micro; L)GilsonFD10004
Micropipetas (1000 & micro; L)GilsonFD10003
Micropipetas (2 e micro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Dispositivo de PCRSensoquestT3-0140
Vetor Básico PGL3Promega #212936
Pontas de pipeta (10 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L)Greiner772352
Placas plásticas de PetriGreiner627102
Proteinase KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Pipeta SerológicaGreiner760107
SpinGilsonPMC880
Mestre Verde SybrRoche4707516001
TermomisturadorEppendorf#5355
Base TrizmaSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VórticeHeidolph541-10000-00-1
Colunas Zymo-Spin IZymoC1003-50

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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