O plasma rico em plaquetas (PRP) é usado no tratamento de distúrbios musculoesqueléticos equinos. Diferentes técnicas produzem PRP com concentrações variadas de plaquetas e leucócitos. Este artigo descreve um método para obter PRP a partir de sangue de cavalo.
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Artigo de método
Um método simples de tubo de centrifugação dupla para obter plasma rico em plaquetas do sangue equino
Neste artigo
Resumo
Resumo
O plasma rico em plaquetas (PRP) é amplamente utilizado como tratamento de rotina para condições musculoesqueléticas crônicas em equinos, como osteoartrite, tendinopatias e desmopatias. Essa eficácia decorre da alta concentração de fatores de crescimento e citocinas anti-inflamatórias que são liberadas após a ativação desse agente ortobiológico, seja ativado endogenamente ou exogenamente. Apesar de sua crescente popularidade, há uma notável ausência de vídeos instrutivos que demonstrem as técnicas de obtenção de PRP em cavalos.
Este estudo examina um método de tubo de centrifugação duplo para obtenção de PRP em equinos. O sangue total de seis equinos foi coletado em tubos de citrato de sódio e centrifugado duas vezes a 120 × g por 5 min e 240 × g por 5 min. A concentração média de plaquetas para PRP foi de 360,95 ± 56,31 plaquetas (PLT) × 103/μL, enquanto a concentração média de leucócitos foi de 3,05 ± 1,53 células × 103/μL. A contagem de plaquetas no PRP foi 2,41 vezes maior do que no sangue total, enquanto a concentração de leucócitos no PRP foi 0,44 vezes menor. A eficiência de coleta para PLT em PRP foi de 17%, enquanto a eficiência de coleta de leucócitos em PRP foi de 3,1%. As concentrações médias do fator de crescimento transformador beta 1 e do fator de crescimento derivado de plaquetas BB no PRP foram 2601,82 (intervalo de confiança (IC) de 95%: 2358,88-2844,76) pg/mL e 1208,05 (IC 95%: 1051,09-1365,02) pg/mL, respectivamente. Esses resultados indicam que o PRP pode ser obtido de forma eficiente e reprodutível por meio de um método simples e econômico, adequado para uso por praticantes de equinos.
Introdução
O plasma rico em plaquetas (PRP) é um produto ortobiológico comumente usado para tratar condições musculoesqueléticas crônicas equinas, como tendinopatias, desmopatias, osteoartrite e laminite 1,2,3. Também é eficaz no tratamento de feridas nos membros e doenças da superfície ocular 4,5. A justificativa para seu uso baseia-se nas altas concentrações de fatores de crescimento (FGs) liberados principalmente pelas plaquetas6. Os leucócitos também contribuem liberando citocinas reguladoras e anti-inflamatórias7. GFs como o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) e o fator de crescimento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) exercem potentes efeitos anabólicos, proliferativos, angiogênicos e anti-inflamatórios8. Após a ativação exógena ou endógena, o PRP polimeriza em um gel rico em plaquetas, facilitando o tráfego, a ancoragem e a diferenciação celular 6,9. Dessa forma, o PRP serve como um andaime vivo complexo e não apenas como um recipiente para GFs e citocinas10.
Vários sistemas classificam os produtos PRP usados em humanos e equinos 6,11,12. Um dos sistemas mais simples e comuns categoriza esses hemocomponentes com base na concentração de leucócitos11,12. De acordo com essa classificação, os produtos de PRP com concentrações leucocitárias baixas a insignificantes e concentrações plaquetárias baixas a moderadas - em relação aos níveis no sangue total do cavalo - são chamados de PRP PURO (P-PRP)6,11,12. Em contraste, os produtos de PRP com concentrações de leucócitos detectáveis a altas e concentrações moderadas a altas de plaquetas são chamados de plasma rico em leucócitos e plaquetas (L-PRP)6,11,12.
Os produtos P-PRP são normalmente obtidos por centrifugação tubo a tubo, na qual o sangue total é coletado de cavalos em tubos contendo anticoagulantes, como citrato e citrato de sódio, fosfato e dextrose13. O sangue é centrifugado duas vezes para separar as plaquetas de outros componentes14. Em contraste, os produtos L-PRP são preparados principalmente usando kits semi-automatizados projetados para sangue humano, alguns dos quais foram validados para uso em cavalos 6,15. Esses kits semiautomatizados geralmente requerem centrífugas especializadas e têm um custo mais alto16, bem como possíveis preocupações com o manuseio asséptico, o que pode dificultar seu uso prático em ambientes clínicos17. Além disso, esses kits podem resultar na concentração indesejável de leucócitos ou hemácias em excesso, o que pode ser prejudicial em determinadas situações clínicas18. Por exemplo, contagens elevadas de leucócitos podem provocar inflamação excessiva, e uma superabundância de glóbulos vermelhos pode interferir no processo de cicatrização ou levar a complicações como irritação ou rejeição tecidual15; no entanto, um método comumente usado para produzir L-PRP equino envolve um processo gravitacional que não requer equipamento especializado19.
À luz dessas limitações, alternativas mais simples e econômicas para a preparação do PRP são altamente desejáveis. Vários estudos in vitro, modelos experimentais de doenças musculoesqueléticas e observações em equinos mostraram que os produtos P-PRP e L-PRP têm efeitos benéficos nas células e tecidos tratados 1,2,20. Esses produtos promovem a cicatrização, reduzem a inflamação e aumentam a regeneração dos tecidos6. No entanto, a decisão de usar P-PRP ou L-PRP para tratar um equino pode ser influenciada por fatores técnicos e econômicos.
De acordo com os autores, não há estudos publicados descrevendo e demonstrando totalmente um procedimento passo a passo amplamente validado para obter um produto PRP a partir de sangue equino. Este artigo descreve os procedimentos necessários para coletar sangue total de cavalos com segurança e produzir um produto PRP adequado para uso experimental e clínico. Também inclui a validação deste ortobiológico por quantificação de plaquetas e leucócitos e determinação da concentração de TGF-β1 e PDGF-BB, que são parte integrante de seus efeitos terapêuticos. Ao padronizar o processo e demonstrar a eficácia do produto, este estudo busca fornecer um método confiável e acessível para os praticantes de equinos prepararem o PRP com confiança e precisão.
Embora o método de centrifugação dupla para a produção de PRP equino tenha sido descrito pela primeira vez por Argüelles et al.14 em 2006, esta é a primeira vez que o protocolo foi totalmente apresentado em um vídeo. Este vídeo destina-se a servir como um recurso prático para praticantes de equinos que enfrentam limitações técnicas e restrições orçamentárias que os impedem de usar kits PRP mais sofisticados e caros para cavalos com distúrbios musculoesqueléticos.
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Protocolo
Este estudo foi conduzido de acordo com os protocolos internos para a preparação e uso de PRP em equinos no Hospital Veterinário Universitário da Universidad de Caldas, Manizales, Colômbia. Este estudo não necessitou de aprovação do Comitê Interno de Cuidados com Animais, pois os dados foram obtidos de cavalos mancos tratados clinicamente em nossa instituição. Dados de seis cavalos crioulos colombianos, três éguas e três castrados, com idade média de 7,4 (± 2,6) anos, foram usados para desenvolver este protocolo. Os proprietários dos cavalos foram informados sobre a natureza do estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os cavalos incluídos no estudo eram clinicamente saudáveis, exceto pelo problema musculoesquelético em tratamento. Foram incluídos apenas animais com contagem basal de plaquetas superior a 100 × 103/mL de sangue total. É importante ressaltar que cavalos com menores concentrações plaquetárias podem ser considerados trombocitopênicos14. Além disso, esses animais exibiram hemogramas, parâmetros bioquímicos clínicos hepáticos e renais normais e valores de análise de urina dentro da faixa normal para a espécie equina.
1. Restrição de cavalos e desinfecção da pele
- Para a segurança do cavalo e do veterinário, prenda o cavalo (Eqqus caballus) com segurança em uma rampa de exame clínico ou com um freio (Figura 1A), dependendo do comportamento do animal. Em seguida, corte uma área de cabelo de 5 cm x 5 cm com um barbeador elétrico no terço médio de um lado do pescoço, sobre a veia jugular.
NOTA: Alguns proprietários preferem que o cavalo não seja tosquiado. Um estudo indica que o corte de cabelo no local da punção venosa não é necessário para evitar a contaminação bacteriana do P-PRP21. Portanto, este procedimento fica a critério do veterinário. - Realize uma preparação preliminar da pele não estéril sobre a área cortada da veia jugular por pelo menos 10 cm usando gaze e luvas não estéreis por aproximadamente 3 min. Aplique vários pedaços de gaze embebidos em espuma antisséptica em um padrão circular (Figura 1B).
- Prepare o local da punção venosa assepticamente usando luvas estéreis e gaze embebida em desinfetante. Esfregue a pele na região do pescoço em movimentos circulares por aproximadamente 5 min. Limpe a área com gaze estéril embebida em álcool etílico a 95%.
2. Coleta de sangue asséptico
- Coloque 16 tubos de citrato de sódio de 4,5 mL, previamente limpos com gaze embebida em álcool etílico a 95%, em uma prateleira de plástico limpa. Impregnar as tampas de borracha dos tubos de vácuo com álcool etílico a 95%, especialmente no recesso para o acoplamento da agulha.
NOTA: Em geral, são necessários oito tubos de citrato de sódio de 4,5 mL para obter 2,5 mL de PRP. O número de tubos usados em um caso particular dependerá dos tecidos moles ou da articulação específica a ser tratada. - Insira estérilmente uma agulha borboleta no local jugular desinfetado (Figura 2A) e conecte tubos de citrato de sódio de 4,5 mL ao suporte (Figura 2B). Agite suavemente os tubos e coloque-os em uma prateleira de plástico.
NOTA: Um tubo de citrato de sódio de 4,5 mL é usado para hemogramas automatizados e para preparar o plasma após centrifugação forte. Este plasma é então usado como um controle negativo para comparações de enriquecimento de fatores de crescimento e citocinas com o PRP.
3. Aquisição de plasma rico em plaquetas
- Coloque os tubos de citrato de sódio de 4,5 mL contendo sangue total em um rotor basculante de quatro lugares em um ângulo de 90° em uma centrífuga de bancada. Centrifugue os tubos a 120 × g por 5 min em temperatura ambiente. Após a centrifugação, posicione os tubos de 4,5 mL contendo sangue citrato e dois tubos lisos adicionais de 10 mL em um rack e coloque o rack no lado da mão não dominante do operador dentro de uma capela de fluxo laminar classe II sobre uma cortina estéril e impermeável.
NOTA: Um estudo sugere que uma capela de fluxo laminar Classe II não é essencial para prevenir a contaminação bacteriana durante a aquisição de PRP21. Em vez disso, o PRP pode ser preparado em uma sala limpa, livre de correntes de ar e poeira. Nesse cenário, o suporte para tubos de sangue pode ser colocado em uma mesa coberta com uma cortina estéril e impermeável. - Primeira centrifugação: Usando uma máscara facial e luvas estéreis, coloque uma seringa luer estéril de 10 mL acoplada a uma agulha estéril (21 G 5/8") no lado da mão dominante no interior da capela de fluxo laminar.
NOTA: A partir deste momento, a mão enluvada dominante permanece sempre estéril, enquanto as tampas de borracha dos tubos de citrato de sódio devem ser removidas usando a mão não dominante enluvada. - Insira a agulha estéril em cada tubo de sangue citrato centrifugado 3 mm sobre o revestimento leucocitário (Figura 3A) e aspire suavemente 50% da fração plasmática, evitando turbulência de fluido e aspiração de sangue. Uma vez aspirados 10 mL de plasma de quatro tubos de 4,5 mL, distribua-o em tubos simples estéreis de 5-10 mL (Figura 3B).
NOTA: Remova as tampas de borracha desses tubos com a mão não dominante e coloque-as sobre um local estéril da cortina ou segure-as para evitar contaminação bacteriana. - Segunda centrifugação: fechar novamente os tubos com as rolhas de borracha e colocá-los em equilíbrio num rotor basculante de quatro posições num ângulo de 90° na centrífuga de bancada e centrifugar estes tubos a 240 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
NOTA: A escolha da força de centrifugação relativa (RCF ou g) é baseada em um estudo seminal14 que descreveu pela primeira vez esse método para obter PRP do sangue equino. Além disso, esse método foi avaliado quanto à reprodutibilidade por outros autores22. - Coloque os tubos em um rack e posicione-os no lado não dominante dentro da capela de fluxo laminar classe II, em cima do campo cirúrgico, estéril e impermeável previamente colocado.
- Use a mão não dominante para remover as tampas de borracha e a mão dominante estéril para aspirar lentamente os primeiros 75% do plasma usando uma agulha espinhal de 18 G, 90 mm conectada a uma seringa luer estéril de 10 mL (Figura 3C). Descarte esta seringa ou reserve-a para outros usos experimentais ou clínicos, pois contém plasma pobre em plaquetas (PPP). Em seguida, conecte a agulha espinhal estéril usada anteriormente a uma seringa luer estéril de 5 ou 10 mL para aspirar o plasma restante (25%) do tubo simples estéril de 5-10 mL. Essa fração é conhecida como P-PRP (Figura 3D).
NOTA: Sob certas condições clínicas e experimentais, uma alíquota de 0,5-1 mL de PRP é usada para hemogramas automatizados seguidos de análise do fator de crescimento (TGF-β1 e PDGF-BB) por ensaio imunoenzimático. A medição desses mediadores pode ser realizada 3 h após a ativação do P-PRP com sais de cálcio ou trombina23 ou após a indução de dano celular por mudança de temperatura ou adição de detergentes não iônicos24. - Enrole a seringa luer estéril contendo PRP em um pequeno campo estéril impermeável com uma agulha ou tampa estéril anexada para evitar a contaminação bacteriana do produto ortobiológico (Figura 4A).
NOTA: A estrutura anatômica do cavalo a ser tratado deve ser preparada para injeção asséptica, conforme descrito na seção 1 deste protocolo. O cavalo deve ser adequadamente contido e sedado para minimizar o desconforto e garantir a segurança do cavalo e do veterinário. O produto PRP deve ser manuseado com luvas e agulhas estéreis e pode ou não ser ativado com base na preferência do profissional (Figura 4B).
4. Análise estatística
- Colete dados sobre contagens de plaquetas e leucócitos no sangue total e PRP. Avalie a normalidade dos dados usando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Se os dados forem normalmente distribuídos (P > 0,05), compare e analise os dados da célula usando o teste t. Se os dados de concentração de plaquetas e leucócitos não estiverem normalmente distribuídos (P < 0,05), compare e analise os dados usando um teste de Wilcoxon.
- Determinar a concentração da eficiência plaquetária e leucocitária no P-PRP de acordo com as seguintes fórmulas25:
Eficiência de coleta de plaquetas =
× 100
Eficiência de coleta de leucócitos =
× 100 - Coletar dados das concentrações de TGF-β1 e PDGF-BB em sobrenadantes de PRP plasmáticos (controle negativo) (após 3 h de ativação com gluconato de cálcio) e lisados de PRP obtidos pela adição de uma solução de detergente não iônico.
- Use um modelo misto linear generalizado para comparar as concentrações de fator de crescimento entre plasma, sobrenadantes de PRP e lisado de PRP. Em caso de diferenças estatísticas significativas, aplicar um teste post-hoc de Tukey.
- Considerou-se p < 0,05 valores estatisticamente significativos para todos os testes.
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Resultados
A contagem média de plaquetas (plaquetas × 103/μL) foi significativamente maior no PRP do que no sangue total (p < 0,001). Em contraste, a concentração média de leucócitos (leucócitos × 103/μL) no PRP foi significativamente menor do que no sangue total (p < 0,001) (Tabela 1). Especificamente, a contagem de plaquetas no PRP foi 2,41 vezes maior do que no sangue total, enquanto a concentração de leucócitos no PRP foi 0,44 vezes menor. A eficiência de coleta de PLT no PRP foi de ...
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Discussão
O uso do PRP na medicina humana e veterinária para o tratamento de distúrbios musculoesqueléticos crônicos está aumentando 1,8,26,27. No entanto, uma das principais críticas às aplicações do PRP em ambientes experimentais e clínicos é a falta de dados básicos sobre as técnicas e protocolos utilizados para o preparo desses hemocomponentes28
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à Vice-reitoria de Investigações e Pós-Graduados da Universidad de Caldas, Manizales, Colômbia, pelo apoio financeiro para publicar este artigo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de coleta de sangue venoso simples de 10 mL | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA | Referência 366430 | Este é apenas um exemplo, tubos de outras marcas podem ser usados. |
| Tubos de citrato de sódio de 4,5 mL (105 M/3,2%) | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA | 107451 | Este é apenas um exemplo, tubos de outras marcas podem ser usados. |
| Centrífuga de bancada | Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Alemanha | Outras centrífugas de bancada podem ser usadas. | |
| Agulha borboleta (21 G &vezes; 0,75 pol.) com 12 pol. tubo e suporte pré-anexado | Conjunto de Coleta de Sangue Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA | Referência 367296 | Este é apenas um exemplo, agulhas borboleta de outras marcas podem ser usadas. |
| Solução de espuma de clorexidina a 2,3-4% | A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país. | ||
| Capela-circuito de fluxo laminar Classe II | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA | Outras capas de fluxo laminar classe II podem ser usadas | |
| Leitor ELISA | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA | ||
| Álcool etílico a 95% | A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país. | ||
| Humano PDGF-BB DuoSet ELISA | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EUA | DY220 | |
| DouSet ELISA de TGF-beta 1 humano | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, EUA | DY240 | |
| Solução de espuma de iodopovidona a 4-10% | A marca ou os nomes comerciais desses produtos podem variar de país para país. | ||
| Software SPSS 25.0 | IBM Corp, SPSS, NY, EUA | ||
| Seringas luer estéreis de vários volumes | Seringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, EUA | Este é apenas um exemplo, seringas de outras marcas podem ser usadas. | |
| Agulha espinhal estéril (18 G &vezes; 90 mm) | Agulha de Espinélio BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, EUA | Este é apenas um exemplo, agulhas espinhais de outras marcas podem ser usadas. |
Referências
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Reimpressões e permissões
