Artigo de método

Aplicação de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK e HEX loria para design de proteínas De Novo e In Silico

DOI:

10.3791/68003

⸱

8 de julho de 2025

 , 
1Facultad de Ciencias Naturales, Doctorado en Ciencias Biológicas, Campus Aeropuerto. Laboratorio de Biología Cuantitativa y Sistemas Complejos, Universidad Autónoma de Querétaro

Neste artigo

Resumo

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O design de proteínas envolve a construção de sequências de aminoácidos e a incorporação de motivos específicos para criar variantes funcionais. Essa abordagem é fundamental para o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos (AMPs) para combater patógenos resistentes a antibióticos. Este artigo apresenta um procedimento para construção de proteínas usando várias ferramentas de bioinformática.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As fronteiras do design de proteínas estão na construção de sequências de aminoácidos e na incorporação de motivos específicos, como locais de ligação, em receptores, canais iônicos ou outras proteínas. Essa abordagem permite a produção de variantes proteicas com funções e propósitos específicos. Uma aplicação exemplar desses recursos de bioinformática é o aprimoramento de peptídeos antimicrobianos (AMPs) ou o design de AMPs sintéticos. Esse desenvolvimento é significativo devido ao recente aumento de doenças emergentes, muitas vezes causadas por patógenos difíceis de erradicar e que exibem resistência a antibióticos. As consequências dessa tendência incluem a extinção global de espécies animais e mortes humanas. A síntese rápida de AMPs novos e eficazes é, portanto, essencial. Esses servidores e programas podem facilitar o rápido desenvolvimento de vacinas, AMPs ou tratamentos eficazes contra esses patógenos. O objetivo deste trabalho foi apresentar e propor um procedimento para a construção de proteínas a partir de sequências e elucidar o processo de utilização de diferentes ferramentas para construir essas moléculas passo a passo.

Introdução

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A incidência de doenças animais está aumentando e esse fenômeno é influenciado pelas mudanças climáticas. O aumento da temperatura global tem levado à proliferação de microrganismos e ao surgimento de patógenos oportunistas, contribuindo para o desenvolvimento de doenças virulentas e resistentes a medicamentos1. As mudanças climáticas afetam o solo, a água, a pele e o microbioma intestinal, resultando em estresse persistente na fisiologia animal e na adaptação ambiental. Demonstrou-se que esse fenômeno compromete as respostas imunes, tornando os animais mais suscetíveis a patógenos emergentes, que podem ter consequências letais e potencialmente levar à extinção de certas espécies 2,3,4,5. Um exemplo saliente é a síndrome do nariz branco (WNS), uma doença causada pelo fungo Pseudogymnoascus destructans, afetando morcegos em hibernação. Essa doença e outras não foram identificadas até que um evento substancial de mortalidade ocorreu no continente americano em 20066. Para mitigar os danos causados por tais patógenos, os pesquisadores se voltaram para a administração de antimicóticos, como itraconazol e cetoconazol, e probióticos, incluindo a inoculação com a microbiota benéfica Pseudomonas fluorescens7. Outro exemplo de doença causada por um fungo é o Ophidiomyces ophiodiicola, fungo que causa dermatite e doenças multissistêmicas em serpentes em cativeiro e selvagens 4,8.

Esses estudos ressaltam a necessidade de maior conscientização e compreensão das doenças fúngicas em animais selvagens para implementar soluções práticas rapidamente. Infecções fúngicas têm sido relatadas em anfíbios, e um patógeno prevalente que afeta esses animais é o fungo aquático Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que causa quitridiomicose. Esta doença causa lesões cutâneas graves e perturba a função normal da pele em animais suscetíveis, podendo levar à mortalidade9. Este patógeno tem se disseminado extensivamente desde o século 20, contribuindo para a extinção de 90 espécies de anfíbios. A prevalência dessas infecções representa um desafio substancial na prevenção e na identificação de tratamentos eficazes, pois exigem a consideração de vários fatores ecológicos, fisiológicos, microbioma e outros10.

É um fenômeno bem documentado que os microrganismos patogênicos possuem a capacidade de desenvolver rapidamente mecanismos de resistência por meio da codificação genética, um processo que pode ser exemplificado pela produção de bombas de efluxo externas para medicamentos e antibióticos11. Além disso, observou-se que esses microrganismos modificam a composição lipídica da membrana com o objetivo de neutralizar os efeitos de moléculas específicas12. O campo das sequências de proteínas tem atraído interesse significativo, particularmente no contexto de sua integração em abordagens de tratamento e na construção de modelos de estrutura de proteínas. Esses modelos são projetados para otimizar o tempo e os recursos do laboratório antes do início da síntese de proteínas13. A prevenção de infecções nesses casos é uma tarefa complexa que envolve múltiplos fatores ecológicos, fisiológicos e do microbioma14. Essa abordagem facilita o gerenciamento mais eficaz do tempo e dos recursos no laboratório e enfatiza a complexidade da tarefa.

No interesse de aumentar o potencial de aplicações práticas de compostos existentes, bem como criar novos compostos com potencial mais significativo para tais aplicações, é imperativo empregar conhecimentos de várias disciplinas, incluindo química, biologia molecular, física e programação. Para isso, várias ferramentas estão disponíveis, incluindo I-TASSER (Iterative Threading ASSembly Refinement)15,16 e trRosetta 17,18 (Protein structure prediction by TRansform-restrained Rosetta). previsão estrutural de proteínas e UCSF Chimera (um sistema de visualização para pesquisa e análise exploratória da Universidade da Califórnia, San Francisco) 19 e HEX loria (um programa interativo de acoplamento de proteínas e superposição molecular) 20 para docking molecular e edição de arquivos PDB.

O I-TASSER é um servidor online automatizado que prevê estrutura e função. Este programa pode ser acessado por meio de um navegador da Web ou como um download. Na página de envio, os usuários podem inserir a sequência no formato FASTA ou baixar um arquivo no formato .txt. O processo do servidor envolve a identificação de modelos estruturais com um grau de homologia, conforme descrito em Local Meta-Threading Server LOMETS 20,21,22,23,24,25. Após o processamento de um milhão de resultados potenciais pelo servidor, um processo de filtragem é iniciado e os fragmentos são selecionados com base no Root Mediaan Square Deviation (RMSD), TM (uma métrica usada para avaliar a semelhança estrutural entre dois modelos) e C-score (uma métrica usada para avaliar a confiança dos modelos estruturais de proteínas gerados por ferramentas). Os usuários podem personalizar os resultados com base em parâmetros predeterminados fornecidos no programa ou inserir seus próprios valores, dependendo de sua sequência específica ou expectativas estruturais 20,21,22,23,24,25.

O trRosetta é um programa altamente eficaz para a previsão da estrutura de proteínas. Nesse servidor, os usuários podem enviar sequências em formato de arquivo, TXT, FASTA, sequência de entrada ou MSA (Multiple Alignment Sequences). Este programa permite que os usuários selecionem entre modelos ou executem trRosetta-single para dobramento de sequência. Esses servidores utilizam uma rede de aprendizado profundo para gerar previsões estruturais. O processo de previsão de sequência envolve uma etapa inicial de previsão de mapa de contato e distância, seguida pela seleção dos cinco principais modelos para o modelo final e uma etapa para minimizar a energia para dobramento e refinamento17.

O servidor High Ambiguity Protein-Protein Docking (HADDOCK) é uma ferramenta computacional que facilita o encaixe flexível de dois ou mais arquivos PDB, abrangendo estruturas de proteínas, peptídeos, ligantes e receptores. Este servidor emprega uma abordagem que incorpora AIRs (Restrições de Interação Ambígua), que codificam informações de proteínas previstas ou identificadas durante o processo de encaixe. Os AIRs abrangem restrições de aminoácidos, categorizando-os como aminoácidos passivos ou ativos. A incorporação de aminoácidos ativos é de particular importância, pois são indicativos de potenciais locais de ligação ou interação entre receptores de proteínas. O design do programa incorpora a exposição a solventes no modelo26.

HEX Loria é um servidor interativo online que facilita a análise de complexos de proteínas e docking molecular. Este servidor pode ler arquivos de coordenadas no formato Protein Data Bank (PDB) e gerar rapidamente cálculos de encaixe usando alvos gráficos NVIDIA ou CUDA. O programa pode produzir até 1.000 previsões de encaixe e utiliza a Correlação de Fourier para as orientações gerais de duas moléculas27. A interface HEX Loria foi projetada para ser fácil de usar, permitindo que os pesquisadores carreguem perfeitamente suas estruturas de proteínas e configurem parâmetros para simulações de encaixe. A capacidade do servidor de utilizar unidades de processamento gráfico NVIDIA ou CUDA demonstrou resultar em uma aceleração substancial do tempo de computação, permitindo assim que os pesquisadores obtenham resultados com maior conveniência. Além disso, o HEX Loria oferece uma variedade de opções de visualização para resultados de encaixe, capacitando os usuários a realizar análises detalhadas das interações proteína-proteína previstas.

A utilização do UCSF Chimera é imperativa para garantir a precisão dos resultados da pesquisa. Este software necessita de instalação para a execução do presente protocolo, e as funcionalidades subsequentes serão empregadas: medição de distâncias interatômicas e várias outras tarefas analíticas. O software possui recursos como rotulagem, coloração, renderização de superfície e exportação de figuras nos formatos JPG ou PNG. A incorporação de rótulos e cores facilita a identificação de aminoácidos com alta probabilidade de contato entre o receptor e a proteína antimicrobiana projetada. Além disso, permite a medição precisa da distância entre esses aminoácidos.

Este protocolo visa identificar opções alternativas de tratamento para o problema de saúde emergente que aflige os anfíbios. A quitridiomicose, uma infecção fúngica da pele, tem sido observada em vários estágios do desenvolvimento dos anfíbios. A principal fonte de infecção entre esses animais são os corpos d'água onde normalmente residem e se envolvem em várias atividades. O desenvolvimento de um agente antifúngico eficaz requer a identificação de pelo menos três alvos moleculares: interação com a parede celular por meio de cargas, ligação à membrana plasmática e, finalmente, ligação e interação com uma proteína receptora no nível da membrana, que desempenha um papel vital no fungo Bd.

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Protocolo

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1. Identificar sequências de alvos moleculares em Bd

NOTA: A seleção de aminoácidos na sequência é baseada em recomendações da literatura. Os principais aminoácidos incluem K, W, G, A, V, I e L. Para saber quais programas usar, consulte a Tabela de Materiais.

  1. Recupere sequências-alvo do banco de dados do NCBI.
    1. Acesse o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
    2. Selecione Todos os bancos de dados e escolha Nucleotídeo como a categoria de pesquisa.
    3. Digite Batrachochytrium dendrobatidis na barra de pesquisa e filtre os resultados por cepa e espécie.
    4. Baixe e salve a sequência em um editor de texto ou formato FASTA para análise posterior.

2. Analise a sequência por BLAST ou SMART BLAST

  1. Execute uma pesquisa BLAST.
    1. Abra um navegador da Web e vá para BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
    2. Selecione Protein BLAST para comparar a sequência de consulta com os bancos de dados de proteínas https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
  2. Verifique a especificidade do alvo.
    1. Certifique-se de que o alvo molecular selecionado não esteja presente em outras espécies. Se o alvo aparecer em várias espécies, repita a seleção de sequência até que a especificidade seja confirmada (veja a Figura 1).
      NOTA: Esta etapa garante que nenhum alvo molecular secundário indesejável interfira no AMP ou na função da proteína antifúngica
  3. Verifique se há homologia nas sequências de proteínas.
    1. Verifique se a sequência de aminoácidos projetada não corresponde a proteínas homólogas em outras espécies.
      NOTA: Esta etapa confirma que a função antifúngica é específica para os alvos pretendidos

3. Projetar a sequência de proteínas antimicrobianas

NOTA: O conteúdo e a sequência de aminoácidos devem ser adaptados à função proteica desejada, especificamente à atividade antifúngica. A sequência projetada deve codificar uma proteína com efeitos antimicóticos contra Bd. Verifique isso no Antifp prever servidor28.

  1. Revisão da literatura e desenho de sequências
    1. Realizar uma revisão abrangente da literatura recente para identificar as principais características do Bd e potenciais mecanismos antimicrobianos.
      NOTA: Estudos anteriores descrevem peptídeos antimicrobianos (AMPs) contra Bd, sintetizados por vários animais e microrganismos. A fórmula29de Shai fornece uma estrutura para projetar peptídeos antifúngicos sintéticos. Este método deve ser usado para otimizar as sequências de proteínas para atividade antifúngica máxima.

4. Preveja a estrutura 3D usando o I-TASSER

NOTA: Este protocolo se aplica ao alvo molecular e à sequência antimicrobiana projetada.

  1. Para acessar e enviar sequências, visite o servidor I-TASSER para https://zhanggroup.org/I-TASSER/ de previsão de estrutura e função de proteínas.
  2. Cadastre-se usando um e-mail institucional para receber um nome de usuário e senha para acesso à ferramenta.
  3. Envie o alvo molecular ou a sequência projetada no formato FASTA, .txt arquivo ou copie e cole diretamente no campo de entrada.
  4. Atribua um nome exclusivo à sequência.
  5. Clique em Enviar e deixe o programa analisar a sequência, fornecendo um tempo de processamento estimado.
    NOTA: Pause o protocolo até que os resultados sejam recebidos. O tempo de processamento normalmente varia de 24 a 72 h para proteínas pequenas (≤50 aminoácidos) e pode levar mais tempo para proteínas maiores (até 3.000 aminoácidos).
    Orientação sobre a seleção de ferramentas: Use I-TASSER para pequenas proteínas, como peptídeos antimicrobianos projetados. Para proteínas grandes, use trRosetta, que é otimizado para modelagem estrutural complexa.

5. Preveja a estrutura 3D usando o trRosetta

  1. Visite o servidor web trRosetta: https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/.
  2. Insira a sequência do receptor alvo no formato FASTA, .txt ou MSA ou cole-a diretamente no servidor.
  3. Atribua um nome à proteína prevista estruturalmente.
  4. Clique em Enviar, garantindo que a opção de excluir modelos esteja selecionada. Escolha homólogos únicos trRosettaX para iniciar o processo de previsão.
    NOTA: Pause o protocolo até que os resultados sejam recebidos.
  5. Aguarde um e-mail de confirmação após o envio bem-sucedido.
  6. Analise os resultados da previsão.
    1. Verifique se a pontuação TM é uma medida da qualidade do modelo.
    2. Examine mapas de contato, mapas de distância por aminoácido e mapas de rotação para carbonos alfa e beta nos ângulos ω (ômega), θ (teta) e φ (phi).
  7. Baixe os resultados em formato ZIP para análise posterior.

6. Docking molecular e análise de interação (usando HADDOCK)

  1. Acesse o servidor de encaixe HADDOCK: https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/.
  2. Registre uma conta usando um e-mail institucional, confirme a conta e faça login.
  3. Retorne à home page, selecione Novo trabalho e inicie um envio.
  4. Na página de envio do HADDOCK, preencha as informações necessárias: nome do trabalho, número da molécula (neste caso, 2). Selecione tudo.
  5. Carregar Moléculas para encaixe. Carregue estruturas PDB para o receptor e o ligante. Selecione o acoplamento proteína-ligante para ambos.
  6. Repita as etapas para envio de ligante, selecione todas as cadeias e deixe as configurações restantes como padrão.
  7. Clique em Avançar para a etapa de envio subsequente.
    NOTA: Nas secções 1 e 2, acrescentar a lista de aminoácidos envolvidos nas interacções receptor-ligante e marcá-los como resíduos activos. Os resíduos passivos permanecem predefinidos. Os sítios ativos são os sítios de interação e devem ser escolhidos de acordo com as características da proteína projetada e os aminoácidos expostos à proteína receptora.
  8. Finalize e execute o processo de encaixe.
    1. Clique em Avançar para manter os parâmetros de encaixe padrão inalterados.
    2. Clique em Enviar para iniciar o processamento.
      NOTA: O tempo de processamento esperado varia de 24 a 72 h.
  9. Revise os resultados do encaixe.
    1. O servidor seleciona e classifica automaticamente os melhores resultados de encaixe. Analise as interações de aminoácidos usando software de visualização estrutural (por exemplo, PyMOL ou UCSF Chimera).
  10. Faça o download das estruturas encaixadas finais no formato PDB para um estudo mais aprofundado.
    NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2, Figura Suplementar S3, Figura Suplementar S4 e Figura Suplementar S5.

7. Meça distâncias (OPCIONAL) [consulte o Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S6, Figura Suplementar S7 e Figura Suplementar S8.]

  1. Analise os resultados do encaixe usando um PDB (programa de visualização de estrutura). Abra o arquivo PDB de encaixe molecular no UCSF Chimera e avalie a proximidade estrutural e os locais de ligação potenciais (distâncias medidas).
  2. Clique duas vezes no ícone Chimera para abrir o PDB. Selecione Arquivo, Abrir e escolha um arquivo na janela do diretório do documento .
  3. Identifique átomos. Vá para ações, átomos/ligações e selecione mostrar.
  4. Selecione os átomos mais próximos do ligante e do receptor. Selecione o átomo 1 com Ctrl+clique e o átomo 2 com Ctrl+Shift+Clique.
  5. Vá para ferramentas, análise de estrutura e selecione distâncias.
  6. Clique em Criar (verificar seleção de átomo). A janela exibe aminoácidos e localizações dos átomos 1 e 2.
    NOTA: A coluna de distância mostra os ângulos entre os átomos.
  7. Baixe a tabela e salve-a no computador local.
    NOTA: Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter informações adicionais.

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Resultados

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A sequência em desenvolvimento utiliza a seguinte fórmula: K(X)3KW(X)2K(X)2K, onde (X) pode ser G, A, V, I ou L28. Os resultados da pesquisa obtidos incluíram sequências de proteínas de mais de 300 aminoácidos, que foram selecionadas devido ao seu status de sequências completas de proteínas, em oposição a sequências parciais. Deve-se notar que sequências completas são essenciais para o estudo. As funções de cada receptor / canal de membrana também foram pesquisadas...

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Discussão

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A abordagem de bioinformática empregada na predição estrutural de proteínas tem limitações inerentes devido à sua dependência de programas computacionais. Esses programas tentam aproximar as estruturas reais das proteínas, mas são limitados por fatores como temperatura, solubilidade e presença de solvente, que podem não replicar totalmente as condições in vivo. Além disso, o método depende da identificação precisa das principais proteínas conservadas por meio de múltiplos alinhamentos e ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Jimena R. Villarreal é doutoranda do Programa de Doutorado em Ciências Biológicas da Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ) e recebeu uma bolsa do Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT) (1003112).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BLASTN/AN/AServidor online
ComputadorAMDN/ASO: XP, W7, W8, W10, ubuntu, linux
Servidor HADDOCKBONVINLABN/AServidor online
HEX 5.2BBSRC-INRIAN/ADownload-Servidor online
I-TASSERZHANG LABN/ADownload-Servidor online
MUSCLEN/AN/AServidor online
NCBIN/AN/AServidor online
PYMOLSCHRÖ DINGERN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX
MODELO SUÍÇOBIOZENTRUMN/AServidor online
trRosetta servidorYANG LABN/AServidor online
USCF CHIMERARBVIN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX

Referências

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