Um protocolo de citometria de eletroporação para microscopia de fluorescência de células vivas usando cultura de células U2 OS

Resumo

A eletroporação é o uso de campos elétricos pulsados (PEFs) para criar poros transitórios em culturas de células para introduzir carga molecular. Esta técnica tornou-se recentemente amplamente utilizada em ambientes clínicos e de pesquisa. Aqui, descrevemos técnicas de eletroporação usando o recentemente desenvolvido "Sistema de Citometria de Eletroporação" para realizar microscopia de fluorescência de células vivas.

Resumo

Os campos elétricos pulsados (PEFs) têm uma ampla gama de aplicações em pesquisa médica e aplicações clínicas. Uma área-chave de pesquisa se concentra na eletroporação (reversível ou irreversível). A eletroporação reversível tem sido usada há várias décadas para transferir moléculas através de membranas celulares, como o DNA do plasmídeo, normalmente chamada de eletrotransferência de genes (GET). Por outro lado, a eletroporação irreversível tornou-se uma técnica popular no tratamento do câncer, fornecendo uma alternativa não tóxica ao romper permanentemente as células usando PEFs. Isso pode ser combinado com vários tipos de medicamentos ou reagentes para aumentar o efeito que se tornou conhecido como eletroquimioterapia (ECT). No entanto, apesar do amplo sucesso em aplicações práticas, é necessário mais tecnologia e pesquisa de apoio para melhorar as técnicas atuais. Para resolver isso, um sistema de citometria de eletroporação foi desenvolvido para apoiar a experimentação de PEF de células vivas com a capacidade de realizar microscopia de fluorescência de longo prazo. Isso foi combinado com uma linha celular FUCCI (CA) 5 U2-OS de expressão estável para avaliar mudanças no ciclo celular em resposta à exposição ao PEF. Ao fazer isso, foi alcançada microscopia de lapso de tempo de até 30 h, fornecendo mudanças em tempo real na atividade celular com base no repórter FUCCI (CA) 5. Como resultado, as mudanças específicas da fase foram quantificáveis para análise a jusante.

Introdução

Os campos elétricos pulsados (PEFs) cresceram e se tornaram uma ferramenta comum para uma variedade de aplicações em biologia e aplicações clínicas¹. Estes podem ser amplamente categorizados por eletroporação (EP) e eletroestimulação (ES). A eletroporação tem dois subcampos conhecidos como eletroporação reversível e irreversível. A eletroporação reversível (ER) tem sido usada há décadas como uma ferramenta eficaz para transferir cargas moleculares, como DNA de plasmídeo, para células de vários tipos, como mamíferos, bactérias e leveduras². Mais recentemente, a eletroporação irreversível (IRE) tem crescido em destaque como uma alternativa não tóxica aos atuais tratamentos contra o câncer³. Um subcampo emergente é denominado Ablação por Campo Pulsado (AFP), que se concentra na remoção não térmica de tecido, em particular para o tratamento de certas disfunções cardíacas⁴. Em combinação com medicamentos e outros reagentes, isso levou ao desenvolvimento da eletroquimioterapia (ECT). No entanto, a compreensão atual dos tratamentos com PFE está sendo superada por aplicações clínicas⁵. Aqui apresentamos um sistema de citometria de eletroporação para investigação de eletroquimioterapias. O ciclo celular representa um indicador-chave da viabilidade celular, e as mudanças podem identificar efeitos específicos da fase. Ao desenvolver essas ferramentas, os protocolos podem ser adaptados mais rapidamente, proporcionando tratamentos mais eficazes para uma ampla gama de cânceres.

Nosso sistema de eletrocitometria personalizado (Figura 1) compreende uma câmara com eletrodos de placa paralela de alumínio e um fundo de lamínula, bem como um gerador de pulso de decaimento exponencial simples. A câmara é construída a partir de uma câmara impressa em 3D e um fundo de vidro de cobertura # 1.5 é afixado por adesivo sensível à pressão de grau médico. Os eletrodos são formados a partir de filme adesivo de alumínio colocado sobre suportes embutidos na câmara, fornecendo dois eletrodos paralelos separados por 0,4 cm. Esta é uma configuração comum para eletrodos comerciais e fornece um design robusto que pode adaptar rapidamente os protocolos atuais. A câmara pode caber em invólucros ambientais projetados para lâminas de 25 mm x 55 mm, que também é um formato de lâmina comum suportado por fornecedores de microscópios comerciais. O gerador de pulsos fornece pulsos de decaimento exponencial de até 330 V, permitindo que uma ampla gama de experimentos seja alcançada, incluindo eletroporação reversível e irreversível.

Para estudar os efeitos dos PEFs no ciclo celular, usamos uma linhagem celular transgênica de osteossarcoma humano (U2 OS) expressando o Indicador de Ciclo Celular de Ubiquitinação Fluorescente (CA)5 (FUCCI(CA)5), uma construção repórter de ciclo celular vivo fluorescente. O sistema introduz duas formas fluorescentes e truncadas de Geminin e Cdt1, que são produzidas e recicladas em taxas específicas durante o ciclo celular. Além disso, a apoptose pode ser monitorada diretamente durante o experimento usando uma linha FUCCI (CA) 5 de células U2-OS que expressam de forma estável. Durante o ciclo celular, o repórter opera previsivelmente com cada fase porque estas são produzidas e degradadas nas mesmas taxas que as versões funcionais naturalmente expressas na célula. Quando ocorre apoptose, esse ciclo é interrompido com o ciclo celular desligando rapidamente. Normalmente, isso se manifestará visualmente como o envelhecimento da fluorescência dentro do ciclo celular, seguido por mudanças morfológicas dramáticas no núcleo, que são claramente visíveis devido à localização dos repórteres no núcleo⁶. Isso permite a identificação visual de cada fase em células individuais ao longo do tempo (Figura 2). A eletroporação reversível causa alterações nas condições intracelulares e um pulso de decaimento exponencial de 180 V foi selecionado para investigação. Este pulso foi selecionado para limitar a morte celular tanto quanto possível, garantindo a eletroporação na maioria da população. Isso foi determinado com base em pesquisas anteriores que investigaram os parâmetros ideais de pulso de eletroporação para seis linhagens celulares de mamíferos. A densidade de energia de um pulso de 180 V foi ligeiramente inferior aos parâmetros ótimos de transfecção, proporcionando melhor viabilidade celular com alta poração⁷. O efeito do pulso foi estudado em células não sincronizadas e células sincronizadas em fase S usando um duplo bloqueio de timidina com e sem aplicação de PEF (Figura 3). Os resultados indicaram uma diminuição no comprimento médio para S e G2 em relação ao controle. Isso indicou que a fase S foi sensível à exposição ao PFE, resultando em um ciclo celular mais rápido. Isso demonstrou que o sistema de citometria por eletroporação foi capaz de combinar a entrega de PEFs com imagens de células vivas de longo prazo para estudar o ciclo celular. Embora tenhamos usado essa plataforma para observar a progressão celular ao longo do ciclo celular em resposta aos PEFs, esta é uma ferramenta útil para estudar uma variedade de aplicações e condições para PEFs e cultura de células.

Protocolo

1. Preparação da cultura celular

1. Prepare a linha estável usando eletroporação reversível com os seguintes parâmetros: 100 μL de células U2 OS ressuspensas (6 × 10⁶ células / mL) com 5 μg de DNA de plasmídeo em uma cubeta de 0,4 cm e um pulso de onda quadrada de 180 V por 10 ms.
2. Imprima o design personalizado da câmara usando qualquer impressora 3D apropriada e plástico biocompatível, como ácido polilático (PLA) (consulte o Arquivo Suplementar 1). Desinfetar a câmara completa com etanol (70%) e armazenar em um recipiente estéril antes do uso.
3. Cultive células U2-OS FUCCI(CA)5 em uma placa de 10 cm com 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)-High Glucose contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de PenStrep e incube a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Quando a cultura atingir 80% de confluência, aspire o meio, lave a cultura celular com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e dissocie as células usando 1 mL de tripsina a 0,25% por 1,5 min.
5. Neutralize a tripsina ressuspendendo a cultura de células em 5 mL de DMEM-High Glucose (contendo 10% de FBS e 1% de PenStrep).
6. A partir da cultura de células ressuspensas, obter uma amostra de 100 μL e colocá-la na câmara do sistema de citometria de eletroporação na lamínula de vidro inferior. Certifique-se de que a câmara esteja 30% confluente após a introdução da amostra. Se a amostra parecer ser excessivamente confluente antes da incubação, aspire a amostra e diminua o volume da amostra.
7. Lentamente, adicione 4 mL de DMEM-High Glucose (contendo 10% de FBS e 1% de PenStrep) na extremidade da câmara, evitando que o líquido saia da amostra.
8. Coloque uma lâmina de microscópio padrão no topo da câmara e incube a câmara a 37 °C e 5% de CO₂ por 24 h, garantindo que a cultura tenha aderido totalmente ao fundo da câmara. Opcionalmente, use Hoechst 33342 (1 μg/mL) para corar os núcleos das células para facilitar a quantificação das células a jusante, bem como a apoptose. Realize a coloração 30 minutos antes da microscopia de lapso de tempo.

2. Preparação do microscópio

1. Primeiro, ligue um microscópio fluorescente invertido com controles ambientais e câmara, permitindo que as condições se estabilizem antes de realizar a eletroporação.
   NOTA: Qualquer microscópio de fluorescência invertida com um sistema ambiental que possa aceitar a lâmina de câmara de 25 mm x 55 mm x 16 mm. O projeto foi originalmente projetado para funcionar no microscópio invertido referenciado (ver Tabela de Materiais) e no sistema ambiental correspondente.
   O aquecimento do palco pode causar um desvio na imagem devido à expansão do metal.
2. Enquanto o sistema ambiental está atingindo a temperatura ideal, conecte um multímetro digital ao capacitor do gerador de pulso e ao interruptor de alta tensão usando cabos elétricos adequados. Para seguir este protocolo, use cabos de clipe "jacaré" para permitir a montagem e desmontagem rápidas com a câmara de eletroporação.
3. Em seguida, selecione a ampliação de 20x e, usando o software do microscópio, certifique-se de que os canais FITC (GFP) e A594 (TexRed/mCherry) (opcionalmente, canal DAPI para Hoechst 33342) sejam selecionados correspondendo às duas proteínas fluorescentes no sistema FUCCI(CA)5. Use configurações de baixa exposição (normalmente <0,05 s) para evitar danos à foto em lapsos de tempo de longo prazo.
4. Otimize o foco e a qualidade da imagem tirando imagens de teste antes de iniciar o lapso de tempo.
   NOTA: A fluorescência deve ser tão brilhante quanto necessário para a visualização de cores.
5. Programe o lapso de tempo para capturar de 3 a 6 pontos de vista a cada 10 minutos por 24 h para obter um alto volume de dados do ciclo celular por lapso de tempo, mitigando os danos da foto.
   NOTA: O período de tempo pode variar dependendo da escala de tempo da atividade celular.
6. Certifique-se de que o foco automático esteja ativado para o canal A594 para obter melhores resultados rastreando a cultura de células durante o lapso de tempo.
7. Deixe o software no modo de espera até que a eletroporação seja realizada. Assim que o pulso for fornecido, ative imediatamente o lapso de tempo para garantir a maior precisão de dados possível.

3. Eletroporação

1. Coloque a câmara de citometria de eletroporação no microscópio com uma câmara ambiental apropriada. Antes da eletroporação, deixe a câmara fechada com o sistema ambiental funcionando para garantir que o ciclo celular não seja afetado.
2. Conecte um multímetro digital ao gerador de pulso e conecte o gerador de pulso aos eletrodos da câmara usando cabos de clipe jacaré abrindo a câmara ambiental.
3. Carregue o capacitor no gerador de pulsos a 180 V e descarregue rapidamente o pulso na câmara até que o multímetro digital leia 0 Volts.
4. Remova as conexões elétricas da câmara e recoloque a tampa o mais rápido possível para garantir as condições adequadas de cultura.
5. Ative imediatamente o lapso de tempo assim que o sistema ambiental do microscópio estiver instalado.

4. Aquisição de dados com lapso de tempo

1. Após a conclusão do lapso de tempo, use o software do microscópio para salvar o lapso de tempo como um único vídeo com base nas imagens capturadas ao longo do lapso de tempo. Melhore a qualidade visual nesta fase para auxiliar na quantificação manual.
   NOTA: Qualquer taxa de quadros pode ser selecionada; no entanto, 6 quadros/s fornecem uma velocidade de reprodução moderada com 1 segundo de vídeo, resultando em 1 h de tempo real.
2. Depois que o vídeo de lapso de tempo estiver preparado, acompanhe as fases da célula ao longo do tempo, observando as mudanças nos sinais FITC e A594

Resultados

Usando o sistema FUCCI (Figura 2), os dados visuais do ciclo celular foram obtidos medindo o período de tempo durante o qual cada cor foi expressa pela célula como resultado da expressão da proteína e da unbiquitinação. Com base nos resultados dos experimentos não sincronizados e sincronizados (Figura 3), ficou evidente que a exposição ao PFE em fase S regulou positivamente o ciclo celular. Isso foi evidenciado pela diminuição da duração média da fase, indicando...

Discussão

Quando realizados corretamente, os dados da fase do ciclo celular podem ser quantificados para grandes volumes de células individuais por períodos de até 24 h. Este protocolo produziu dados de ciclo celular comparáveis a métodos alternativos, como FACs. Este é um método comumente usado pelo qual as células são marcadas com fluorescência à medida que progridem no ciclo celular. Após incubação por pelo menos 24 h, eles são classificados por intensidade fluorescente, correlacionando-se com ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Slide de Câmara (Impresso/Avaliado em 3D)	N/A	N/A
Placa de cultura (10 cm)	Sarstedt	83.3902
Delta Vision	Olympus	N/A	Modelos de microscópios alternativos também podem ser usados. Garantir que o palco e o sistema ambiental possam acomodar a corrediça da câmara de eletroporação (55 mm x
DMEM - Soro Fetal Bovino de Alta Glicose	Gibco	11965092
	ThermoFisher	A5256701
Impressora 3D i3 MK3S	Prusa	N/A	Podem ser usados modelos alternativos de impressoras que podem usar arquivos STL.
Caneta Strep	ThermoFisher	15070063
Fosfato Tampolado Salino	Gibco	10010031
tFUCCI (CA) 5	Addgene	153521
Tripsina	Sigma-Aldrich	9002-07-07
U2-OS Linha Celular	ATCC	HTB-96