Artigo de método

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

DOI:

10.3791/68029

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28 de fevereiro de 2025

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1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve as melhores práticas para transferência e alojamento de camundongos livres de germes em isoladores experimentais de gaiola única (isocages), mantendo condições estéreis. Métodos para transplante fecal em camundongos livres de germes e a coleta de bactérias viáveis desses camundongos "humanizados" intestinais para outras aplicações são discutidos.

Resumo

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Camundongos livres de germes são uma importante ferramenta de investigação para entender a contribuição dos microrganismos na saúde e doença do hospedeiro, permitindo avaliar o papel específico de indivíduos, grupos definidos ou complexos de microrganismos na resposta do hospedeiro. Tradicionalmente criados e criados em isoladores de filme flexível ou semirrígidos, a criação de camundongos livres de germes e a manipulação experimental são caras e exigem vários funcionários treinados e uma grande área ocupada em instalações de alojamento de animais. O sistema de gaiola IsoPositive permite a manipulação experimental de camundongos livres de germes em gaiolas isoladas individuais, hermeticamente fechadas e de pressão positiva (isocages), reduzindo custos e permitindo maior flexibilidade nas manipulações experimentais.

Aqui, um protocolo é descrito para transferir camundongos livres de germes de isoladores reprodutores para isogaiolas e subsequente transferência fecal de fezes de doadores humanos para camundongos para criar camundongos "humanizados" intestinais estáveis de longo prazo para estudos futuros. Os materiais e a preparação necessários para a utilização do sistema de isocário são descritos, incluindo o uso de esterilizante químico esterilizante de dióxido de cloro para limpar gaiolas, suprimentos, equipamentos e equipamentos de proteção individual. Os métodos para confirmar o status livre de germes de camundongos transferidos e como determinar a contaminação no sistema de gaiola são discutidos. O procedimento para a criação, incluindo cama, comida e abastecimento de água, é discutido mais adiante. O protocolo para preparação de chorume fecal humano e gavagem em camundongos livres de germes para criar camundongos "humanizados" intestinais, juntamente com a coleta de fezes para monitorar a composição da comunidade microbiana desses camundongos, são descritos. Um experimento ilustra que duas semanas após o transplante fecal humano permite a colonização estável da microbiota do doador nos hospedeiros murinos, permitindo o uso experimental subsequente. Além disso, a coleta de fezes de camundongos humanizadas em meios de preservação de viabilidade, permitindo o uso em outros experimentos funcionais, é descrita. No geral, esses métodos permitem o estabelecimento seguro e eficaz de comunidades de camundongos humanizados em gaiolas gnotobióticas experimentais para posterior manipulação.

Introdução

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Camundongos livres de germes são uma ferramenta essencial no repertório de pesquisadores de microbioma, permitindo dissecar a contribuição da microbiota na saúde do hospedeiro e nos estados de doença. Camundongos livres de germes nascem completamente estéreis e permanecem axênicos por toda a vida1. A colonização de camundongos livres de germes com cepas bacterianas específicas permite estudos causais entre esses táxons e funções metabólicas, imunológicas ou outras funções do hospedeiro 2,3,4,5. Particularmente vantaj....

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Flórida (UF) e realizados nas Instalações de Cuidados com Animais da UF (Protocolo IACUC #IACUC202300000005). Colônias de espécies selvagens livres de germes (GF WT; C57BL/6) foram criados e mantidos em isoladores pela Divisão Livre de Germes da UF Animal Care Services. Camundongos GF WT de gênero misto foram transferidos de isoladores de reprodução e colocados no sistema de bioexclusão ISOcage P para permitir a manipulação microbiana.

Amostras fecais humanas foram obtidas de u....

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Resultados

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Amostras fecais humanas, agrupadas por fenótipo ICI respondedor e não respondedor (descrito anteriormente no protocolo), foram gavagadas em camundongos GF-WT de gênero misto alojados em 3 isócrias por grupo (n = 1-2 camundongos / gaiola, n = 6 para respondedor e n = 5 para não respondedor). Os camundongos foram autorizados a se aclimatar por 1 semana após a transferência. Amostras fecais foram então coletadas desses camundongos (condições livres de germes). Os camundongos foram então gavagados com 1 × 107 UFC .......

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Discussão

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O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e altamente detalhado para a humanização de camundongos livres de germes alojados em isocages experimentais. A capacidade de transplantar exclusivamente comunidades fecais de seres humanos para hospedeiros murinos é inestimável para a pesquisa do microbioma. Sem a contaminação da microbiota comensal específica do camundongo, pode-se estudar o impacto das bactérias residentes em humanos em uma variedade de estados de saúde e doença .......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores são gratos à Divisão de Serviços Livres de Germes da UF Animal Care Services pela assistência com a criação gnotobiótica, à Dra. Brooke Bloomberg e à Dra. Laura Eurell pela assistência veterinária e IACUC, e Josee Gauthier pela assistência com o sequenciamento do gene 16S rRNA. Esta pesquisa foi apoiada, em parte, pelos Fundos do Centro de Câncer de Saúde da UF (CJ) e pelo Fundo Gatorade do Departamento de Medicina da UF (CJ). R.Z.G. foi apoiado por fundos do UF Health Cancer Center. RCN foi apoiado pelo National Institutes of Health TL1 Training Grant da Universidade da Flórida (TL1TR001428, UL1TR001427), o prêmio do Natio....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de ponta deslizante BD de 1 mL estéril, uso únicoFisher Scientific309659
2.0 mL Tampa de Rosca Tubo, Não Serrilhado, Saia, Natural, E-Beam Tubo estéril com tampa anexadaFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48" Sacos de Polietileno com Gusset de 3 MilUlineS-13455
Tanque de 5 galões de ativador esterilizante de dióxido de cloro Exspor A Ecolab6301680
tanque de 5 galões de base esterilizante de dióxido de cloro Exspor Copos deEcolab 6301194
600 mLFisher ScientificS01914
ALPHA-dri PapéisShepherd
anaeróbicaCoy Lab ProductsTipo B
Gabinete de biossegurança classe 2pela Nuaire
XT Extreme TemperatureÓculos de Segurança Tecniplast1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Fastenal922205455
DuPont  Tyvek  Manga - 18"UlineS-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Tampa de Borracha Natural FisherScientific01-258-107Tampa de borracha para garrafas de 1 L autclave
Garrafas de pulverizador HDPE Dynalon Quick Mist FisherScientific03-438-12B
Cilindros graduados de polipropileno FisherbranFisher Scientific03-007-44
Fisherbran  Pinça de Dissecação de Ponta CegaFisher Scientific08-887
Bolsas de Esterilização de Selagem Instantânea FisherbrandFisher Scientific01-812-51
Pinça de Aplicação Geral de Ponta Larga Forte da Fisherbrand Fisher Scientific16-100-107
Marca Fisher  Fita Autoclave Sem ChumboFisher Scientific15-901-110
Agulha de gavagem, aço inoxidável reutilizável. Reto. Agulha de 22 gauge, diâmetro da ponta 1,25 mm, comprimento 38 mm ou 1,5 polegadas(doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrumento Durac TimerFisher Scientific13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)Tecniplast   ISO30P30 gaiolas (6 l x 5 a), luvas
nitrilo resistentes a produtos químicos de um lado Tamanho S (7), M (8) ou L (9) 18" de comprimento, 22 mil, LuvasGrainger4T426
, médias, não estéreis, sem póMedSupply PartnersKG-1101M
Gás de baioneta oliva / magenta Cartuchos de Vapor / Filtro de Partículas 2Ct   3M/Fastenal50051138541878
Policarbonato RadDisk Mini para Ratos 8-75 x 4Braintree ScientificIRD-P M
Polipropileno Bouffant Caps - 24", AzulUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mLFisher Scientific22-029-646
S, M e L Máscara Respiradora de Cabeça de Silicone Azul de Modo Duplo   Luvas
, CT International, Espessura = 6,5 mm, Comprimento = 30,5 cm (12), Tamanho da luva = 8,5, Cor da luva = BrancoFisher Scientific18-999-102F
Capa de sapato resistente ao deslizamentoUline  S-25639
Bata Cirúrgica, Toalha, Estéril, Grande, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18% proteína extrudada dieta para roedores (esterilizável) Pesado Nalgene da Inotiv2018SX
Thermo Scientific com Tampa (volume de 20 L)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Indicadores Biológicos Autônomos de Duas EspéciesSteris HealthcareS3061
WypAll L40 1⁄ Limpadores de 4 dobrasUlineS-8490
polipropileno especiais Câmara Filtro HEPA autoclavável IsoCage certificado de de exame de nitrilo Ansell de látex sem pó estéreis da série 50051131370826 Sgpf da 3M/FastenalTanque LLDPE Retangular

Referências

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  1. Park, J. C., Im, S. -H. Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics. Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).
  2. Li, F., et al.

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Etiquetas

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