Regulação quimiogenética em células-tronco precursoras derivadas de células-tronco reprogramadas no tratamento de doenças neurodegenerativas

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo de engenharia de células-tronco quimicamente reprogramadas para obter modulação neuronal precisa, diferenciando essas células em células precursoras dopaminérgicas, transplantando-as em modelos de camundongos da doença de Parkinson e avaliando resultados comportamentais e eletrofisiológicos para confirmar a integração bem-sucedida e a eficácia funcional das células transplantadas.

Abstract

A integração de receptores projetados exclusivamente ativados por drogas projetadas (DREADD) com terapias baseadas em células-tronco apresenta uma estratégia avançada para modulação neuronal precisa. Aqui, utilizamos células-tronco humanas reprogramadas projetadas por CRISPR que expressam receptores DREADD excitatórios (hM3Dq) ou inibitórios (hM4Di) para avaliar a integração funcional e modulação de precursores dopaminérgicos transplantados em um modelo murino da doença de Parkinson (DP). As principais etapas incluíram a geração de linhagens de células-tronco que expressam DREADD sem fusão, diferenciando-as em precursores dopaminérgicos do mesencéfalo e transplantando essas células para o estriado de camundongos com lesão de 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Foram realizadas avaliações comportamentais e registros eletrofisiológicos para analisar os efeitos das células transplantadas. Testes comportamentais, como o teste do cilindro, demonstraram modulação significativa da função motora após a administração de clozapina-N-óxido (CNO). Especificamente, a ativação de hM4Di reduziu o movimento contralateral dos membros anteriores, enquanto a ativação de hM3Dq foi associada a um comportamento motor aprimorado. Os registros eletrofisiológicos revelaram respostas sinápticas distintas. A ativação de hM4Di aumentou os intervalos entre eventos e diminuiu as amplitudes de pico das correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas (sEPSCs), enquanto a ativação de hM3Dq diminuiu os intervalos entre eventos e aumentou as amplitudes de pico, refletindo a sinalização excitatória aprimorada. Em resumo, a integração de avaliações comportamentais e eletrofisiológicas valida a incorporação funcional precisa de células-tronco quimicamente reprogramadas projetadas nos circuitos neurais do hospedeiro.

Introduction

Os receptores projetados ativados exclusivamente por drogas sintéticas (DREADD) são receptores acoplados à proteína G projetados que podem ser ativados seletivamente por ligantes sintéticos inertes¹. A abordagem quimiogenética tornou-se uma ferramenta essencial na neurociência, permitindo que os pesquisadores investiguem a conectividade do circuito neural com alta precisão e aprimorando nossa compreensão das funções celulares in vivo e in vitro por meio da ativação seletiva ou inibição de regiões cerebrais específicas ou tipos de células ^2,3.

A terapia baseada em células-tronco apresenta uma estratégia promissora para o tratamento de doenças neurodegenerativas. A eficácia das células do enxerto depende da integração adequada, sobrevivência e contribuição funcional para os tecidos hospedeiros. A atividade celular descontrolada pode levar a consequências negativas, incluindo tumorigênese⁴; necessitando de controle preciso dessas células após o transplante. Alavancar a tecnologia DREADD em células-tronco humanas reprogramadas e neurônios derivados fornece um meio de controlar com precisão a atividade neuronal por meio da administração do medicamento CNO ^2,5. No contexto da doença de Parkinson (DP), que é caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos, manipular a atividade de neurônios dopaminérgicos derivados de células-tronco é crucial para investigar suas entradas sinápticas e padrões de projeção em modelos de roedores 6,7,8,9,10. A incorporação de receptores excitatórios de hM3Dq e hM4Di inibitórios nesses modelos permite a modulação precisa da atividade neuronal^11,12.

A combinação de avaliações comportamentais de animais e registros eletrofisiológicos permite uma avaliação abrangente dos efeitos da modulação quimiogenética em células transplantadas in vivo¹³. Avaliações comportamentais, incluindo rotação induzida por apomorfina, teste do cilindro e teste do rotarod, avaliam a coordenação motora e fornecem informações sobre as mudanças na função motora associadas aos modelos experimentais de DP¹⁴. Técnicas eletrofisiológicas, como registros de patch-clamp, permitem o monitoramento em tempo real das respostas sinápticas e potenciais de ação, fornecendo uma visão abrangente de como as células transplantadas se integram às redes neurais existentes¹⁵. Ao combinar avaliações comportamentais com avaliações eletrofisiológicas, podemos investigar como a modulação quimiogenética afeta a integração e a funcionalidade dessas células nos circuitos neurais do hospedeiro¹⁶. Os resultados preliminares sugerem que a administração de CNO modula efetivamente a atividade neuronal em células transplantadas, resultando em melhores resultados funcionais em modelos animais.

Neste protocolo, células-tronco humanas reprogramadas foram projetadas para expressar receptores hM3Dq ou hM4Di usando a tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR). Depois de diferenciar células-tronco reprogramadas modificadas em células precursoras dopaminérgicas do mesencéfalo, essas células foram transplantadas em modelos de camundongos com DP para avaliar sua integração e regulação funcional nos circuitos neurais do hospedeiro usando avaliações comportamentais e registros eletrofisiológicos.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Associação de Pequim para Ciência de Animais de Laboratório e pelos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) foram obtidas de um doador saudável com consentimento informado por escrito, conforme descrito em um estudo anterior¹⁷.

1. Construção de linhagens celulares baseadas em células-tronco DREADD sem fusão

1. Construa o plasmídeo doador DREADD.
   NOTA: Os locais de digestão devem ser projetados de acordo com a sequência vetorial. Os fragmentos devem ser sintetizados e amplificados com sobreposições de 20-30 pb correspondentes aos braços do fragmento para aumentar a eficiência da montagem.
   1. Projete e sintetize o fragmento T2A-ZsGreen (Fragmento I).
   2. Amplificar o fragmento hM3Dq/hM4Di-T2A do plasmídeo original utilizando PCR (Fragmento II). Configure a reação de PCR (volume total de 50 μL) para conter 1x tampão de PCR, 200 μM de cada mistura dNTP, 0,5 μM de primers direto e reverso, 10-50 ng de molde de DNA de plasmídeo e 1,25 U de DNA polimerase de alta fidelidade. Realize a termociclagem nas seguintes condições: desnaturação inicial a 98 °C por 2,75 min para desnaturar totalmente o modelo; 32 ciclos de amplificação consistindo em 98 °C por 15 s (desnaturação), 60 °C por 30 s (recozimento do primer) e 72 °C por 60 s (extensão); extensão final a 72 °C durante 7 min.
   3. Digerir o plasmídeo vectorial com a enzima adequada para obter o vector linearizado. Purificar todos os fragmentos por electroforese em gel de agarose e quantificá-los com um espectrofotómetro.
      NOTA: Aqui, o plasmídeo original foi digerido com MluI e SalI.
2. Misture suavemente 50-100 ng do vetor linearizado, Fragmento I e Fragmento II em uma proporção molar de 1:3:3, juntamente com 2x Mistura de Clonagem. Incubar a mistura a 55 °C durante 1 h para facilitar a recombinação homóloga através da montagem de Gibson.
3. Insira o RNA guia direcionado ao sítio AAVS1 no sítio BbsI do vetor pX458.
   NOTA: Execute a verificação de sequência em todos os plasmídeos construídos usando o sequenciamento Sanger.
4. Manter as células-tronco reprogramadas no meio, visando uma densidade celular de 2-5 × 10⁶ células/mL.
   NOTA: As células-tronco reprogramadas usadas aqui foram induzidas a partir de PBMCs humanas, conforme descrito em um estudo anterior¹⁷. Monitorar a saúde celular é essencial, pois o status da célula afeta significativamente a eficiência da eletroporação. Consulte a Tabela de Materiais para uma comparação da mídia.
5. Misture 2-5 × 10⁶ células, 2 μg de cada plasmídeo doador (hM4Di-T2A-ZsGreen ou hM3Dq-T2A-ZsGreen) e 2 μg de plasmídeo de gRNA em 100 μL de tampão de eletroporação e transfira para uma cubeta para eletroporação.
   NOTA: Certifique-se de que a mistura esteja bem misturada e livre de bolhas antes de prosseguir para a eletroporação. Otimize os parâmetros de eletroporação com base no tipo de célula para maximizar a eficiência da transfecção, pois diferentes dispositivos podem exigir ajustes específicos.
6. Defina o Nucleofector para o programa B16 e inicie a eletroporação para facilitar a transfecção eficiente dos iNSCs alvo.
7. Adicione 1 mL de 50 μg/mL de poli-D-lisina (PDL) a cada poço de uma placa de 6 poços e incube em temperatura ambiente por pelo menos 2 h. Remova todo o PDL dos poços e adicione 1,5 mL de uma laminina de 5 μg / mL a cada poço e incube a 37 ° C por 2-4 h. Use a placa revestida imediatamente ou armazene a 2-8 °C por 1 semana.
8. Transfira as células eletroporadas para placas de seis poços que foram revestidas com PDL e laminina. Distribua aproximadamente 500.000 células por poço em um volume de 2 mL de meio de cultura por poço.
9. Após 72 h de eletroporação, use um citômetro de fluxo para classificar as células fluorescentes positivas.
   1. Ressuspenda as células dissociadas na DPBS e filtre através de um filtro de células de 70 μm.
   2. Configure o classificador com canal FITC para detecção ZsGreen. Incluir iNSCs não tratados como controles negativos para definir a fluorescência da linha de base.
   3. Calibre o instrumento usando bicos de 100 μm a uma pressão de bainha de 20 psi. Implemente um modo de classificação de pureza de quatro vias com confirmação de célula única.
10. Placa única de células ZsGreen⁺ em placas de 96 poços pré-revestidas com PDL e laminina e adicione 200 μL de meio de cultura por poço para apoiar o crescimento inicial. Manter em meio de cultura por 7-14 dias
    NOTA: Monitore os poços diariamente em busca de sinais de crescimento e fluorescência indicando integração bem-sucedida e rotule o poço positivo.
11. Isole clones únicos exibindo fluorescência usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com um conjunto de filtros GFP. Clones de tela com ampliação de 10x. Marque os poços contendo colônias monoclonais com sinal ZsGreen uniforme e sustentado. Capture imagens de campo claro e fluorescência para documentar a morfologia e a intensidade da fluorescência.
    NOTA: Antes da imagem, substitua o meio novo para reduzir a fluorescência de fundo. Excluir colônias com morfologia irregular ou autofluorescência.
12. Expanda as células positivas em placas revestidas de 48 poços. Em seguida, dividido em duas partes, uma para cultura e outra para genotipagem.
13. Extraia DNA genômico de clones candidatos. Prepare as reações de PCR com dois pares de primers: um par para confirmar a inserção do gene de interesse, o outro primer para distinguir clones homozigotos e heterozigotos. Realizar termociclagem nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C durante 5 min; 38 ciclos de 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 45 s; extensão final a 72 °C durante 7 min. Resolva os produtos de PCR em um gel de agarose a 2%.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para os primers. Confirmar a inserção do gene de interesse por uma única banda de 650 pb (primer 1). Identifique clones heterozigotos pela presença de uma única banda de 630 pb e clones homozigotos pela ausência dessa banda (primer 2).
14. Expanda as células positivas em placas revestidas de seis poços.
15. Digerir as células e lavá-las em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por centrifugação a 250 × g durante 3 min. Congele as células em meio de criopreservação com 10% de DMSO a uma densidade de 2,5 × 10⁶ células por frasco.

2. Células precursoras derivadas de células-tronco DREADD transplantadas em camundongos modelo de DP

1. Administre uma injeção intraperitoneal de desipramina na concentração de 5 mg / mL (10 mg / kg) a camundongos imunodeficientes 30 minutos antes da cirurgia. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 2%.
2. Realizar injeções estereotáxicas unilaterais de 3 μL de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, 5 μg/μL). Atingir o corpo estriado direito usando as seguintes coordenadas: ântero-posterior = 0,5 mm, lateral = 2,1 mm e vertical = -3,2 mm.
   NOTA: 6-OHDA deve ser dissolvido em solução salina contendo 0,2% de ácido ascórbico. Garanta um direcionamento preciso para minimizar a variabilidade na gravidade da lesão.
   CUIDADO: 6-OHDA é citotóxico e produz espécies reativas de oxigênio que induzem estresse celular. Manuseie com cuidado.
3. Administre uma injeção intraperitoneal de apomorfina (1 mg/kg, 0,5 mg/mL dissolvido em solução salina) para validar as lesões 4 semanas após a cirurgia. Selecione camundongos lesionados que exibem mais de 100 rotações contralaterais em um período de observação de 30 minutos para experimentos subsequentes.
   NOTA: A apomorfina é um agonista do receptor de dopamina, que ativa diretamente os receptores pós-sinápticos supersensíveis no estriado desnervado, desequilibrando a atividade do circuito nigroestriatal bilateral. A rotação induzida por apomorfina serve para avaliar a gravidade das lesões dopaminérgicas unilaterais pela 6-OHDA.
4. Sementes e células de cultura em placas revestidas de seis poços (150.000 células por poço). Incubar em meio de diferenciação de Fase 1 por 10 dias, atualizando o meio a cada 2 dias. No dia 11, mude para o meio de diferenciação da Fase 2 e continue a incubação até o dia 13, mudando o meio a cada dia.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma comparação do meio de diferenciação.
5. Colha as células nos dias 10 e 13 de diferenciação e misture-as na proporção de 1:7. Suspenda a mistura em tampão de transplante a uma concentração de 100.000 células/μL.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para uma comparação do tampão de transplante.
6. Administrar uma injeção estereotáxica de um volume total de 4 μL da suspensão celular preparada em um camundongo PD.
7. Realize o teste do cilindro em vários momentos após o transplante de células. Coloque um copo de vidro (diâmetro: 20 cm, altura: 30 cm) sobre uma superfície plana e não reflexiva. Posicione uma câmera de visão superior acima do cilindro para capturar o diâmetro total.
   NOTA: Envolva o cilindro com cortinas pretas para eliminar estímulos visuais externos.
8. Coloque cada mouse no centro do cilindro e inicie a gravação de vídeo simultânea (3 min/sessão). Após a sessão, retorne o mouse à sua gaiola inicial.
   NOTA: Aclimate os ratos à sala de testes por 30 minutos em condições de luz. Limpe o cilindro com etanol 70% entre as tentativas para eliminar sinais olfativos.
9. Avalie a capacidade de movimento dos membros superiores dos camundongos por 3 min. Calcule o número de contatos de parede feitos pelo membro anterior prejudicado em relação ao número total de contatos feitos por ambos os membros anteriores.
10. Administre solução salina ou CNO na dose de 1,2 mg / kg por injeção intraperitoneal. Realize o teste do cilindro para avaliar a modulação comportamental no modelo de camundongo PD após a administração de CNO
    NOTA: Aguarde um período de recuperação de aproximadamente 40 minutos antes de prosseguir com a avaliação.

3. Perfil eletrofisiológico in vivo de células quimiogeneticamente moduladas

1. Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal de 250 mg / kg de pentobarbital. Extraia o cérebro e coloque-o imediatamente no líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose gelada (s-ACSF) para manter a integridade celular. Usando um vibratome, corte o cérebro em seções de 300-400 μm de espessura.
   NOTA: Trabalhe rapidamente para manter o cérebro em baixas temperaturas para preservar a função celular. Consulte a Tabela de Materiais para o s-ACSF usado na preparação de uma nova seção cerebral.
2. Transferir as amostras para uma câmara cheia de FCAA equilibrada com 95% de O₂ e 5% de CO₂ a 34 °C, garantindo que esta temperatura é mantida durante todo o ensaio.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para ACSF.
3. Carregar pipetas de vidro com solução intracelular gelada, com resistência do eletrodo variando de 7 a 10 MΩ.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para solução intracelular. As pipetas de vidro são feitas de capilares de vidro por um extrator de micropipetas¹⁸. Verifique se há vazamentos nas pipetas de vidro antes de iniciar os experimentos, garantindo que as pontas sejam afiadas o suficiente para penetrar na membrana celular. Prepare pipetas rapidamente para minimizar as flutuações de temperatura na solução intracelular.
4. Montar as fatias numa câmara de registo submersa superfundida (2 ml/min) com ACSF oxigenado a 34 °C. Posicione pipetas usando micromanipuladores motorizados sob microscopia de contraste de interferência diferencial infravermelha. Estabeleça a configuração de toda a célula aplicando sucção suave (resistência > 1 GΩ) aos neurônios remendados nas regiões do enxerto. Clamp células a -70 mV usando um amplificador patch-clamp; adquirir sEPSCs basais por 8 min a uma taxa de amostragem de 10 kHz (filtrada a 2 kHz) e monitorar continuamente a resistência de acesso (alvo: <20 MΩ; descartar se >25 MΩ ou flutuante >10%).
   NOTA: Use a pressão apropriada ao aplicar a sucção para evitar deslocamento ou ruptura indesejável da célula e ajuste cuidadosamente a posição da pipeta para obter uma boa vedação. Se a qualidade da vedação for ruim, descarte a pipeta e tente novamente.
5. Adicione 50 μM de CNO à câmara de registro imediatamente após concluir a medição de linha de base e continue registrando os dados por mais 16 minutos enquanto observa as mudanças na frequência ou amplitude sEPSC.
6. Execute um procedimento de lavagem substituindo a solução CNO por ACSF novo para remover efetivamente o CNO da câmara de gravação. Continue registrando dados para o restante do experimento para avaliar qualquer recuperação na atividade sináptica.

Results

A Figura 1 mostra as principais etapas desta abordagem metodológica para células-tronco humanas reprogramadas projetadas expressando receptores DREADD excitatórios (hM3Dq) ou inibitórios (hM4Di) para avaliar a integração funcional e modulação de precursores dopaminérgicos derivados em um modelo de camundongo da doença de Parkinson (DP). A Figura 2 descreve a estratégia de knock-in de genes mediada por CRISPR / Cas9 para a introdução de construções de não fusão d...

Discussion

Este protocolo utilizou a tecnologia CRISPR para projetar células-tronco humanas reprogramadas para expressar receptores excitatórios hM3Dq e hM4Di inibitórios. A modulação da atividade neuronal pelo CNO foi avaliada por meio de transplante de células em modelos de camundongos da doença de Parkinson, acompanhado de avaliações comportamentais e registros eletrofisiológicos.

O primeiro passo crítico na geração de construções DREADD expressas de forma estável e n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	usado para análise de genotipagem
2× Mistura de clonagem sem costura	Biomed Gene Tech.	CL117-01	usado para construção de plasmídeo
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	usado para estabelecer camundongos PD modelo
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	usado como controle
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	plasmídeo original para construção de hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	plasmídeo original para construção de hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plasmídeo doador construído com base em #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plasmídeo doador construído com base em # 80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Usado para digerir células
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorfina	Sigma-Aldrich	A4393
Líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF)	N / A	N / A	125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 25 mM de glicose e  26 mM NaHCO3
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Suplemento	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapina-N-óxido	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramina	Sigma-Aldrich	D3900
D-glicose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)	Gibco	14175095
Fator inibidor da leucemia humana (hrLIF)	Milipore	LIF1010
Fluido intracelular gelado	N/A	N/A	130 mM K-gluconato, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% de neurobiotina
KnockOut Reposição	Gibco	10828028
Laminina	Roche	11243217001
Extrator de micropipetas	Suplemento Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Thermo	Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Amino não essencial ácidos (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 pacote de software	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology software de aquisição e análise de dados
Fase 1 meio de diferenciação	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% Suplemento B-27, 1% Suplemento N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µ M SAG1 e 100 ng/mL FGF8
Meio de diferenciação da Fase 2	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% Suplemento B-27, 1% Suplemento N-2, 1% NEAA e 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-β III, 10 µ M DAPT, 0,2 mM de ácido ascórbico e 0,5 mM de cAMP.
Bromidrato de poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers para genotipagem	N/A	N/A	Inserção Avançar: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Inserção Reversa: CCTGTGGGAGGAAGAAGAGGT; Homozigosidade para frente:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozigosidade reversa: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose (s-ACSF)			234 mM de sacarose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM de Dglicose, 0,5 mM de CaCl2 e 10 mM de MgSO4
Cultura de células-tronco mídia	N/A	N/A	  48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) e 48% Neurobasal, com adição de 1% de B27, 1% de N2, 1% de NEAA, 1% de GlutaMax, 10 ng/mL de hrLIF, 2 µ M SB431542 e 3 µ M CHIR99021
TGF-β III	Peprotech	100-36E
Tampão de transplante	N/	A N/A	HBSS tampão com 5 g/L de D-glicose, 100 ng/mL de BDNF, 100 ng/mL de GDNF e 0,2 mM de ácido ascórbico
Vibratome	Leica	VT1000 S
Moleculares	Patch de Célula Inteira	MultiClamp700B