Artigo de método

Modelo animal de infecções associadas a implantes em camundongos

1.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68041

⸱

27 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Centre for Leading Medicine and Advanced Technologies of IHM, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo de camundongo que emprega implante dorsal subcutâneo para investigar infecções associadas ao implante, permitindo uma investigação abrangente dos mecanismos fisiopatológicos e apoiando o desenvolvimento de critérios diagnósticos com estratégias terapêuticas direcionadas.

Resumo

As infecções associadas a implantes representam um desafio clínico significativo, pois surgem quando microrganismos patogênicos se infiltram no local de implantes médicos, como substituições de articulações, cateteres ou marca-passos. Essas infecções podem levar a complicações graves, incluindo falha do implante, hospitalização prolongada e necessidade de intervenções cirúrgicas adicionais. Para investigar essas questões críticas, os modelos murinos fornecem uma plataforma inestimável para estudar infecções associadas a implantes e avaliar estratégias terapêuticas contra biofilmes bacterianos, produzindo insights que podem melhorar os resultados clínicos para pacientes afetados por implantes infectados. Os materiais comumente empregados nesses estudos incluem titânio, polietileno e aço inoxidável, que imitam de perto os usados na prática clínica. O projeto experimental geralmente envolve um procedimento cirúrgico para implantar o dispositivo, que geralmente é realizado por via subcutânea para simular infecções articulares ou relacionadas à pele. Após a implantação, uma cepa bacteriana formadora de biofilme, como Staphylococcus aureus ou Escherichia coli, é inoculada no local para iniciar a infecção, estabelecendo assim um modelo que reflete a fisiopatologia das infecções humanas. Os pesquisadores avaliaram rigorosamente a eficácia de vários regimes de antibióticos contra infecções de biofilme estabelecidas, empregando métodos de administração sistêmicos e localizados. As investigações se concentraram em novos agentes antimicrobianos, compostos disruptores de biofilme e abordagens terapêuticas inovadoras destinadas a aumentar a resposta imune do hospedeiro. A avaliação da eficácia abrange a quantificação das cargas bacterianas no implante e no tecido circundante, juntamente com a avaliação das reduções na espessura e densidade do biofilme após o tratamento. A sintomatologia clínica, incluindo alterações no inchaço e na dor, serve como um indicador adicional de sucesso terapêutico. Além disso, as taxas de sobrevida global e morbidade entre os indivíduos murinos fornecem informações críticas sobre a segurança e eficácia dos tratamentos avaliados. É imperativo que todos os estudos sigam diretrizes éticas rigorosas e garantam as aprovações institucionais necessárias, garantindo que os resultados possam ser replicados de forma confiável em diferentes laboratórios. Esse rigor metodológico é essencial para validar os resultados e avançar nossa compreensão de tratamentos eficazes para infecções associadas a implantes.

Introdução

Modelos animais de infecções associadas a implantes são ferramentas essenciais que unem a pesquisa básica e as aplicações clínicas 1,2. Esses achados fornecem suporte prático para pesquisas científicas e facilitam o desenvolvimento e refinamento de novas abordagens terapêuticas e diagnósticas, melhorando os resultados e a qualidade de vida dos pacientes 3,4,5,6. Esses modelos oferecem uma plataforma para observação a longo prazo, que auxilia na compreensão das alterações fisiopatológicas associadas às infecções associadas ao implante 7,8. Por exemplo, observando os efeitos da infecção nos tecidos e ossos circundantes, os pesquisadores podem elucidar como as infecções levam a danos nos tecidos, osteólise e outras complicações, orientando assim melhorias nas estratégias de tratamento clínico.

Estudos bem-sucedidos em modelos animais fornecem dados fundamentais para ensaios clínicos e ajudam a otimizar estratégias terapêuticas 9,10. Por meio desses experimentos, os pesquisadores podem determinar a dosagem mais eficaz, a duração do tratamento e a via de administração, o que pode informar a pesquisa clínica11,12. Além disso, os modelos animais permitem a avaliação das limitações do tratamento, permitindo os ajustes necessários antes da transição para testes em humanos. Modelos animais de infecções associadas a implantes, também conhecidas como infecções associadas a dispositivos, são inestimáveis no estudo dos mecanismos, métodos de detecção e abordagens de tratamento para essas infecções13,14. As infecções de implantes geralmente ocorrem em áreas como ortopedia e odontologia, onde dispositivos como substituições de articulações ou fixações de fraturas são comumente usados 15,16,17,18. Devido à presença de implantes, as infecções são difíceis de erradicar e muitas vezes levam a inflamação crônica e danos aos tecidos, potencialmente dificultando a recuperação do paciente e exigindo a remoção do implante para tratamento adicional.

O objetivo do estabelecimento de modelos animais é simular a ocorrência e progressão de infecções associadas a implantes sob condições controladas, permitindo a exploração aprofundada de processos fisiopatológicos, o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos e a avaliação de possíveis estratégias terapêuticas 19,20,21,22,23. Um modelo animal ideal deve imitar de perto as características patológicas e as respostas imunes observadas em infecções humanas, com reprodutibilidade consistente em experimentos 24,25,26. Os animais comumente usados incluem ratos, camundongos e coelhos, cada modelo sendo adaptado a objetivos de pesquisa específicos, como a escolha do tipo de implante, cepas bacterianas e métodos de infecção. Com esses modelos, os pesquisadores podem monitorar a disseminação da infecção, as respostas imunes e os comportamentos de colonização de patógenos, incluindo a formação de biofilme no implante 11,23,27. Além disso, esses modelos são fundamentais para testar a eficácia de terapias antimicrobianas, como antibióticos, revestimentos antimicrobianos e terapia fotodinâmica, no controle da infecção 4,12,28. A aplicação de novos métodos de diagnóstico e tecnologias de imagem em modelos animais também aumenta o potencial para o diagnóstico precoce e o tratamento eficaz de infecções associadas a implantes em ambientes clínicos.

O objetivo de longo prazo é estabelecer um modelo animal que replique com precisão os microambientes físicos e fisiológicos de infecções associadas a implantes em humanos. Embora esse esforço envolva alta complexidade, custos substanciais e desafios contínuos, o desenvolvimento de um modelo animal altamente realista para infecções associadas a implantes fornece uma plataforma crítica de teste em estágio inicial para agentes e estratégias terapêuticas. Neste estudo, foram construídos um modelo de infecção associada a implantes de camundongos e um modelo de infecção subcutânea de camundongos. Ao comparar indicadores relevantes, foi explorado o grau de correspondência entre o modelo animal e as infecções periprotéticas clínicas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Saúde e Medicina, Hefei Comprehensive National Science Center (número de aprovação: IHM-AP-2024-080). Todos os camundongos utilizados eram camundongos machos C57BL/6J de grau livre de patógenos específicos (SPF), com 6 semanas de idade, com pesos corporais de 20-30 g. Os animais foram alojados em cinco camundongos por gaiola e tiveram livre acesso a comida e água. O ambiente foi mantido a 22-26 °C com umidade relativa de 50-60% sob um ciclo claro/escuro de 12 h (Luz: 7:00 am-7:00 pm; Escuro: 19h00-7h00). Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação bacteriana para infecção por biofilme de implante subcutâneo

  1. Remova uma alça (10 μL) de cultura de Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 43300) do tubo de estoque a -80 °C. Risque a suspensão em uma placa de ágar sangue usando a técnica da placa de listra. Incubar a 37 °C durante 24 h em condições aeróbicas, sem agitar.
    NOTA: Os métodos de placa de estria de três ou quatro setores são permitidos, desde que os setores inicial e terminal permaneçam não confluentes. A estria intersetorial requer o uso de um novo ciclo de inoculação. Estrias paralelas e equidistantes devem ser executadas para facilitar a distribuição microbiana uniforme. A adesão estrita aos protocolos assépticos é obrigatória para evitar a contaminação cruzada.
  2. Examine a morfologia das colônias típicas de S. aureus e a presença de zonas hemolíticas claras.
    NOTA: A morfologia típica da colônia inclui pigmentação amarelo-dourada, formato redondo e superfície lisa. Uma zona livre de pelo menos 2 mm de diâmetro é considerada positiva para β-hemólise.
  3. Realize coloração de Gram e análise de espectrometria de massa microbiana para confirmar a identidade de S. aureus .
    NOTA: A identificação da cepa deve ser conduzida pelos investigadores usando critérios de seleção estabelecidos.
  4. Selecione uma colônia típica independente (conforme descrito na etapa 1.2). Inocular-o em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL contendo 5 mL de caldo de soja tríptico estéril (TSB). Incubar a 37 °C durante 12 h com agitação a 200 rpm.
  5. Diluir a suspensão bacteriana do passo 1.4 com TSB na proporção de 1:50. Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm.
  6. Monitore e registre a densidade óptica (OD) a 600 nm usando um espectrofotômetro para identificar a fase de crescimento logarítmico.
  7. Estabeleça uma correlação entre os valores de OD600 e as Unidades Formadoras de Colónias por mililitro (UFC/ml) utilizando o método da placa de propagação (consulte os passos 4.1.7-4.1.10).
    NOTA: Neste experimento, o OD600 ideal é 0,700-0,750, correspondendo a aproximadamente 4 ×10 5 UFC/mL. Determinar a relação entre OD600 e UFC/mL garante a precisão experimental.
  8. Dilua 3 mL de suspensão bacteriana (da etapa 1.7, 4 × 105 UFC / mL) com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril frio (PBS). Centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C e ressuspender o sedimento. Concentração bacteriana final: 2 × 105 UFC/mL.
    NOTA: A proporção de 1:1 equilibra a diluição efetiva das impurezas do meio de cultura com a manutenção da integridade celular e da estabilidade osmótica. Ele garante uma lavagem eficiente, minimizando os danos às células devido ao estresse osmótico e promove a formação uniforme de pellets celulares durante a centrifugação, o que é crítico para o processamento a jusante.
  9. Repita a etapa 1.8 em duplicata.
  10. Ressuspenda o pellet bacteriano em PBS para experimentação adicional.

2. Preparação de camundongos e implantes

  1. Divida aleatoriamente 20 camundongos C57BL / 6J do tipo selvagem em dois grupos (10 camundongos / grupo): o grupo de infecção associada a implantes e o grupo de abscesso subcutâneo29.
    NOTA: Cada grupo deve ser alojado em duas gaiolas ventiladas individualmente (IVCs), com cinco camundongos por gaiola.
  2. Aplique marcações de cauda em cada mouse para identificação.
  3. Esterilize placas circulares de titânio (TA1, 1 cm de diâmetro, 0,5 mm de espessura) em autoclavagem a 121 °C, 0,1 MPa por 30 min.

3. Cirurgia animal

  1. Coloque os camundongos em uma câmara de indução de gás isoflurano (2%) com anestésicos gerais de gases animais por aproximadamente 5 minutos para induzir a anestesia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Monitore a respiração para garantir a profundidade anestésica adequada.
    NOTA: A respiração deve ser regular e mais lenta do que quando acordado e não deve mudar em resposta a estímulos nocivos, como procedimentos cirúrgicos ou beliscar os dedos dos pés.
  3. Manter a anestesia com o sistema de entrega do cone nasal usando inalação contínua de isoflurano a 2% e fluxo de oxigênio a 2 L/min (Figura 1A).
    NOTA: Realize todos os procedimentos sob anestesia para evitar o estresse induzido por dificuldades e garantir a conformidade com os regulamentos de bem-estar animal.
  4. Transfira os camundongos anestesiados para a zona de preparação do gabinete de biossegurança.
    NOTA: Divida o gabinete de biossegurança em três compartimentos: preparação, desinfecção e zona de operação. Coloque tapetes descartáveis estéreis dentro de cada compartimento. Execute todos os procedimentos dentro do gabinete para manter as condições assépticas.
  5. Raspe os pelos nas costas (área de 3 cm × 4 cm) e aplique o creme depilatório por aproximadamente 1 min.
  6. Desinfetar a pele com solução de iodo e etanol a 75% três vezes (Figura 1B).
  7. Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm na região dorsal usando lâminas cirúrgicas estéreis. Insira os implantes de titânio estéreis (preparados na etapa 2.3) na bolsa subcutânea (Figura 1D).
    NOTA: Eleve a pele distal da incisão usando uma pinça estéril para formar a bolsa subcutânea.
  8. Injete 100 μL de suspensão bacteriana de S. aureus (2 × 105 UFC/mL) diretamente na superfície de titânio usando uma seringa estéril de 1 mL (Figura 1E).
  9. Desinfetar a pele com etanol a 75% e aplicar suturas inabsorvíveis 3-0 para fechar a incisão (Figura 1F).
  10. Para o grupo de abscesso subcutâneo, crie, desinfete e suture a incisão diretamente, sem inserir nenhum implante.
  11. Injete 100 μL de suspensão de S. aureus (2 × 105 UFC/mL) através da incisão usando uma seringa estéril de 1 mL.
    NOTA: A injeção contínua de baixa taxa foi mantida durante toda a administração para mitigar o rápido acúmulo de líquido e evitar vazamento de suspensão bacteriana.
  12. Monitore a função respiratória até que a respiração espontânea seja retomada antes de transferir os animais para novas IVCs.
  13. Administre meloxicam (0,02 mL / 10 g / dia) por via subcutânea por três dias consecutivos para controlar a dor pós-cirúrgica.
  14. Certifique-se de que todos os ratos possam suportar todo o peso em seus membros, mover-se sem restrições e acessar comida e água livremente.
    NOTA: Alojar todos os camundongos tratados em novos IVCs para evitar contaminação cruzada com camundongos não tratados ou IVCs velhos.

4. Observações e avaliação pós-operatória

  1. Avaliação de infecções em tecido periférico
    1. Observe a condição da incisão dorsal em cada camundongo diariamente e registre as observações nos dias 1, 3, 5, 7, 10 e 14.
      NOTA: Monitor para deslocamento do implante; se detectado, recupere o implante imediatamente para análise subsequente de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
    2. Eutanásia dos camundongos por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical nos dias 3, 7 e 14. Colete os implantes e o tecido periférico para análise posterior (Figura 2).
    3. Raspe os pelos dorsais e desinfete a pele com iodóforo e etanol a 75% três vezes antes da coleta do tecido.
      NOTA: Raspar os pelos dorsais e desinfetar a superfície da ferida minimiza a contaminação por bactérias da superfície.
    4. Extirpar a pele, o tecido subcutâneo e o músculo dentro de uma margem de 0,5 cm ao redor do implante ou ferida usando uma tesoura cirúrgica estéril.
      NOTA: Colete amostras de tecido sem restrições de tamanho para maximizar o rendimento. Pese e homogeneize cada amostra com uma massa igual de PBS estéril para manter unidades g/mL consistentes. Divida cada amostra de tecido longitudinalmente e igualmente em segmentos proximais e distais para quantificação bacteriana (proximal) e avaliação histopatológica (distal).
    5. Coloque o tecido colhido em tubos estéreis. Adicione uma massa igual de PBS estéril e três esferas de moagem de aço estéril a cada tubo.
    6. Homogeneizar os tecidos em três ciclos (70 Hz, tempo de moagem de 60 s, tempo de pausa de 20 s) e, em seguida, vórtice por 5 min.
    7. Efectuar diluições em série do homogenato (a partir do passo 4.1.6) com PBS de 101 a 105.
    8. Coloque 15 μL de cada homogenato diluído em áreas designadas de placas de ágar sangue.
    9. Incubar as placas a 37 °C sem agitar durante 24 h.
      NOTA: Divida cada placa de ágar sangue em seis setores iguais e aplique diluições seriadas em suas respectivas áreas.
    10. Registre as colônias bacterianas usando uma câmera digital e conte-as manualmente.
  2. Observação de S. aureus nos implantes
    1. Nos dias 3, 7 e 14, colha os implantes usando tesouras e pinças estéreis.
    2. Mergulhe os implantes em glutaraldeído a 2,5% a 4 °C por 48 h para fixação.
    3. Enxágue os implantes com PBS estéril três vezes e, em seguida, desidrate-os usando soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) por 10 minutos cada.
    4. Liofilizar os implantes em um liofilizador a -85 °C com pressão de vácuo mantida abaixo de 20 Pa.
    5. Monte os implantes em um estágio de amostra usando fita condutora e cubra com uma camada de ouro de 10 nm.
    6. Observe as amostras sob MEV em alto vácuo e 1,5 kV. Ajuste a ampliação para pelo menos 2500×, conforme necessário.
  3. Análise anatomopatológica do tecido periférico
    1. Nos dias 3, 7 e 14, colete tecidos periféricos ou órgãos importantes usando uma tesoura estéril após desinfetar a pele.
    2. Mergulhe o tecido coletado em paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 48 h para fixação.
    3. Desidrate o tecido imergindo-o em soluções graduadas de etanol (50%, 70%, 80%, 90%, 100%) por 15 min cada.
    4. Incorporar o tecido desidratado em parafina e seccioná-lo em fatias de 4 μm utilizando um micrótomo.
    5. Manchar os cortes com hematoxilina e eosina (H&E) ou Giemsa usando protocolos padrão30.
    6. Observe os cortes corados usando o sistema de análise quantitativa de células teciduais.

Resultados

Um modelo de infecção associada a implante subcutâneo de camundongo foi estabelecido por meio da metodologia descrita neste estudo (Figura 1). Todos os camundongos estavam em boas condições dentro de 3 horas após a operação cirúrgica, enquanto sua dieta, sono e atividade voltaram ao normal no mesmo dia.

No pós-operatório, continuamos a observar as áreas da ferida no dorso dos dois grupos e descobrimos que a variação de abscessos subcutâneos no grupo de infecção associada ao implante foi maior do que no grupo de abscesso subcutâneo até o final do experimento (Figura 3). Em comparação com o grupo de abscesso subcutâneo, o grupo de infecção associada ao implante desenvolveu ruptura no dia 3, que ocorreu 4 dias antes. No dia 10, ambos os grupos de camundongos mostraram sinais de recuperação da ferida, com o grupo de abscesso subcutâneo mostrando recuperação mais pronunciada no dia 14. Em contraste, a ferida ainda não cicatrizou no grupo de infecção associada ao implante, no qual alguns camundongos perderam folhas de titânio em 14 dias, indicando um grau mais grave de infecção.

Para distinguir mais visualmente a diferença na extensão da infecção entre os dois grupos, coletamos tecido do local da infecção em cada camundongo. As diluições do homogeneizado tecidual do local da infecção de ambos os grupos foram analisadas quanto à carga bacteriana em placas de ágar sangue (Figura 4A). Surpreendentemente, a quantidade de tecido infectado no grupo de infecção associada ao implante não teve tendência a diminuir nos dias 7 e 14, enquanto a quantidade de bactérias teciduais infectadas no grupo de abscesso subcutâneo diminuiu sucessivamente nos dias 3, 7 e 14 (Figura 4B). As observações de MEV de folhas de titânio removidas de camundongos no grupo de infecção associada ao implante confirmaram ainda mais os achados acima, ou seja, que houve um aumento gradual nas contagens bacterianas nas folhas de titânio nos camundongos durante um período de 14 dias (Figura 5). A coloração de Giemsa também revelou que as contagens bacterianas de tecidos infectados no grupo de abscesso subcutâneo foram significativamente menores no dia 7 quando comparadas com as do dia 3 e diminuíram ainda mais no dia 14, período durante o qual não houve sinal de diminuição nas contagens bacterianas no grupo de infecção associada ao implante (Figura 6). Assim, o modelo de infecção associada ao implante mostrou infecção mais grave e persistente do que o modelo de abscesso subcutâneo sob uma dose equivalente de infecção.

Uma análise mais aprofundada da intensidade da infiltração de células inflamatórias nos tecidos infectados dos camundongos por meio da coloração H & E revelou que o grupo de abscesso subcutâneo exibiu um menor grau de infiltração celular inflamatória no dia 7 quando comparado com o dia 3 e uma diminuição notável no dia 14 (Figura 7). A infiltração de células inflamatórias no grupo de infecção associada ao implante continuou alta durante o período de 14 dias. Finalmente, a análise histopatológica dos principais órgãos do grupo de infecção associada ao implante revelou que todos os principais órgãos eram essencialmente normais usando nosso método de modelagem e que não havia manifestação óbvia de lesões no desfecho em comparação com camundongos normais (Figura 8). Esses resultados sugerem que nosso método de modelagem é altamente seguro e confiável e é adequado para o estudo de infecções associadas a implantes.

figure-results-1
Figura 1: Protocolo do modelo de infecção associada ao implante. (A) A anestesia foi mantida com sistema de anestesia inalatória com entrega de cone nasal; Inserção: anestesia de indução através de uma câmara de indução de gás. (B) O preparo da pele foi realizado por raspagem e desinfecção do sítio cirúrgico. (C) Uma incisão dorsal transversal foi feita usando uma lâmina estéril. (D) Um implante de titânio estéril foi inserido por via subcutânea através da incisão. (E) Suspensão bacteriana (2 ×10 5 UFC/mL) foi aplicada na superfície de titânio para induzir infecção. (F) O local da incisão foi esterilizado e suturado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Esquema de agrupamento experimental, coleta de amostras e procedimentos de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Imagens representativas dos locais de incisão em ambos os modelos nos dias 1, 3, 5, 7, 10 e 14. Barra de escala: 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Análise da carga bacteriana do tecido periférico. (A) Imagens representativas de colônias bacterianas de culturas de placas espalhadas nos dias 3, 7 e 14. Linha superior: modelo de abscesso subcutâneo; Linha inferior: Modelo de infecção associada ao implante. (B) Mudanças quantitativas na carga bacteriana ao longo do tempo em ambos os grupos. (C) Esquema do método de diluição em série usado para quantificação bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da superfície do implante de titânio nos dias 3, 7 e 14. Esferas amarelas indicam S. aureus; O fundo azul representa a superfície de titânio. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Coloração de Giemsa do tecido periférico nos dias 3, 7 e 14 em ambos os modelos. As setas vermelhas indicam colônias bacterianas. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-7
Figura 7: Coloração de hematoxilina e eosina (H&E) do tecido periférico nos dias 3, 7 e 14 em ambos os modelos. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-8
Figura 8: Coloração H & E dos principais órgãos no dia 14 no modelo de infecção associada ao implante e camundongos de controle saudáveis. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Como em todos os modelos animais, as divergências imunológicas intrínsecas entre as respostas murinas e humanas31 exigem uma interpretação cautelosa dos achados relativos à tradução clínica. O modelo de infecção do implante representa uma simulação controlada que não recapitula totalmente a complexidade dos cenários clínicos. Além disso, a heterogeneidade do biomaterial clínico (por exemplo, variância da composição) pode modular significativamente a patogênese bacteriana, um parâmetro padronizado neste cenário experimental32.

Embora o modelo murino forneça vantagens práticas para investigações preliminares, suas limitações translacionais devem ser reconhecidas. A incorporação de animais idosos (18 meses de idade) ou geneticamente obesos recapitularia melhor as condições metabólicas e imunológicas dos pacientes mais vulneráveis a infecções associadas a implantes33,34. Além disso, os paradigmas de carga mecânica controlada podem preencher a lacuna entre os modelos de implantes estáticos e o ambiente articular dinâmico35.

O atual modelo de infecções associadas a implantes subcutâneos, embora demonstre utilidade no estudo da formação precoce de biofilme, apresenta vários desafios técnicos que merecem discussão. Em relação à variabilidade da taxa de infecção, o espectro observado desde a depuração espontânea até a disseminação descontrolada provavelmente reflete a heterogeneidade nas respostas imunes do hospedeiro. Para resolver isso, o pré-tratamento imunossupressor (por exemplo, dexametasona ou ciclofosfamida) poderia simular melhor a imunidade comprometida característica de pacientes típicos com infecção associada a implantes36, particularmente aqueles com diabetes ou idade avançada. Além disso, a implementação de condições isquêmicas locais durante a cirurgia por meio de oclusão vascular breve pode promover uma colonização bacteriana mais consistente, criando um microambiente hipóxico transitório favorável à adesão microbiana.

Os desafios técnicos na visualização de biofilme, particularmente a ruptura de delicadas matrizes extracelulares durante o processamento convencional de MEV, exigem refinamentos metodológicos. A adoção de técnicas de secagem de pontos críticos representa uma alternativa superior à liofilização padrão para preservação estrutural. Abordagens complementares, como a microscopia confocal com coloração fluorescente de lectina, permitem a caracterização tridimensional do biofilme sem os artefatos introduzidos pelos protocolos de desidratação37.

As vantagens de avaliar a infecção associada ao implante são a simplicidade do procedimento, a alta taxa de sucesso e a ampla aplicabilidade. Comparativamente falando, o método de infecção subcutânea por MRSA construído por Ching-Wen Tseng et al. é mais simples, mas não aplicável a modelos de infecção associada a implantes38. Os modelos de infecção articular periprotética de camundongo construídos por39 e o modelo de infecção associada a implantes espinhais construído por Benjamin V. Kelley et al. estão mais próximos de situações clínicas reais40. No entanto, o procedimento de inserção do implante requer mais prática para um pesquisador iniciante. Este método de modelagem é altamente seguro e confiável, permite uma investigação abrangente dos mecanismos fisiopatológicos e apoia o desenvolvimento de critérios diagnósticos com estratégias terapêuticas direcionadas.

Olhando para o futuro, este sistema modelo oferece oportunidades interessantes para inovação tecnológica. A integração do rastreamento bacteriano bioluminescente (via cepas marcadas com lux) permitiria o monitoramento longitudinal da progressão da infecção em animais vivos41. A plataforma é particularmente adequada para avaliar novas estratégias antimicrobianas, incluindo revestimentos de implantes funcionalizados por antibióticos. Abordagens de manipulação genética, como nocaute direcionado de vias de sinalização imune (por exemplo, deficiência de MyD88), podem fornecer informações importantes sobre os determinantes do hospedeiro da persistência do biofilme. Esses avanços metodológicos prometem aumentar a confiabilidade dos modelos pré-clínicos de infecção associada a implantes e seu valor preditivo para tradução clínica.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82102586 para Z.S., 82272512 para C.Z., 82472463 para C.Z.), Programa de Pesquisa em Saúde da Província de Anhui (AHWJ2024Aa20445 para Z.S., AHWJ2024Aa10144 para C.Z.), Fundação de Ciências Naturais da Província de Anhui, Projeto Juventude Distintiva (2108085J40 para C.Z.), o Programa Provincial de Pesquisa e Desenvolvimento Chave de Anhui - Especialização em Tradução de Pesquisa Médica Clínica (202304295107020020 para CZ), a Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China (2020M671893 para ZS), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (WK9110000155 para ZS, YD9110002053 para CZ), o Projeto de Compilação de Pesquisa Científica da Província de Anhui (2022AH051251 para ZS, 2022AH010076 para CZ), e os Fundos de Pesquisa do Centro de Medicina Líder e Tecnologias Avançadas do IHM (2023IHM01070 para C.Z., 2023IHM01074 para C.Z.). Também somos gratos pelo apoio do Core Facility Center for Medical Sciences, The First Affiliated Hospital of USTC (Anhui Provincial Hospital). Este trabalho foi parcialmente realizado no Centro de Instrumentos para Ciências Físicas, Universidade de Ciência e Tecnologia da China. Também somos gratos pelo apoio do Laboratório de Nível 2 de Biossegurança da Instalação Central, Instituto de Saúde e Medicina, Centro Nacional de Ciências Abrangente de Hefei.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de tetróxido de ósmio a 1%Qualquer marca
Solução de glutaraldeído a 2,5%Qualquer marca
Solução de paraformaldeído a 4%Qualquer marca
75% de etanolQualquer marca
Sistema automatizado de coloração de GramBIOMERIEUXPrevi Grama de Cor
Gabinete de BiossegurançaThermo Fisher Científico1500
Placa de ágar sangueSHIGOUYIKLCP002
Creme depilatórioVeet
LiofilizadorEYELAFDU-2110
IsofluranoRingpuIsoflurano
Centrífuga de alta velocidade de baixa temperaturaSCILOGEXCF1524R
Análise de Espectrometria de Massa Microbiana BIOMERIEUXVITEK MS
Suturas não absorvíveis com agulhasXangai JinhuanF308
Seccionamento de parafina  sistemaLeica
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)BiosharpBL302A
Microscópio eletrônico de varreduraHITACHISU8010
Máquina de anestesia para pequenos animaisRWDR500
EspectrofotômetroJINGHUA721
Terc-butanolQualquer marca
Sistema de Análise Quantitativa de Células de Tecido Panorâmico TGGnósticos de TecidosTISSUEFAXS PLUS
Homogeneizador de tecidosIKAT10 básico ULTRA-TURRAX
Caldo de soja tríptico (TSB)SolarbioLA0110
Incubadora de oscilação vertical de porta únicaSakeziEsci-1020

Referências

  1. Calabro, L., Lutton, C., Din, A. F. S. E., Richards, R. G., Moriarty, T. F. Biomaterials Associated Infection: Immunological Aspects and Antimicrobial Strategies. Moriarty, T. F., Zaat, S. A. J., Busscher, H. J. , Springer. New York. 273-304 (2013).
  2. Shiels, S. M., Bedigrew, K. M., Wenke, J. C. Development of a hematogenous implant-related infection in a rat model. BMC Musculoskel Disord. 16 (1), 255(2015).
  3. Su, Z., et al. Bioresponsive nano-antibacterials for H2S-sensitized hyperthermia and immunomodulation against refractory implant-related infections. Sci Adv. 8 (14), eabn1701(2022).
  4. Dong, J., et al. Honeycomb-inspired ZIF-sealed interface enhances osseointegration via anti-infection and osteoimmunomodulation. Biomaterials. 307, 122515(2024).
  5. Mei, J., et al. Biofilm microenvironment-responsive self-assembly nanoreactors for all-stage biofilm-associated infection through bacterial cuproptosis-like death and macrophage re-rousing. Adv Mater. 35, 2303432(2023).
  6. Zhang, P., et al. An enzymatic and metal-organic framework system to prevent biofilm infections. Cell Rep Phys Sci. 6, 102468(2025).
  7. Su, Z., et al. Enzymatic bionanocatalysts for combating peri-implant biofilm infections by specific heat-amplified chemodynamic therapy and innate immunomodulation. Drug Resist Updates. 67, 100917(2023).
  8. Li, Q., et al. Biofilm homeostasis interference therapy via 1O2-sensitized hyperthermia and immune microenvironment re-rousing for biofilm-associated infections elimination. Small. 19, 2300592(2023).
  9. Conn, P. M. Animal Models for the Study of Human Disease. , Academic Press. (2017).
  10. Stavrakis, A. I., et al. Combination prophylactic therapy with rifampin increases efficacy against an experimental Staphylococcus epidermidis subcutaneous implant-related infection. Antimicrob Agents Chemother. 58 (4), 2377-2386 (2014).
  11. Su, Z., et al. Biodegradable oxygen-evolving metalloantibiotics for spatiotemporal sono-metalloimmunotherapy against orthopedic biofilm infections. Nat Commun. 15, 8058(2024).
  12. Yang, N., et al. Silver-quercetin-loaded honeycomb-like Ti-based interface combats infection-triggered excessive inflammation via specific bactericidal and macrophage reprogramming. Bioact Mater. 43, 48-66 (2025).
  13. Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of Staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clin Microbiol Rev. 29 (2), 401-427 (2016).
  14. Gong, J., et al. Multi-functional bio-HJzyme engineered polyetheretherketone implant with cascade-amplification therapeutic capabilities toward intractable implant-associated infections. Small. 21 (7), 2409437(2025).
  15. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nat Rev Microbiol. 16 (7), 397-409 (2018).
  16. Qin, L., et al. Prospects and challenges for the application of tissue engineering technologies in the treatment of bone infections. Bone Res. 12, 28(2024).
  17. Luo, Z., et al. Enhanced bacterial cuproptosis-like death via reversal of hypoxia microenvironment for biofilm infection treatment. Adv Sci. 11 (19), 2308850(2024).
  18. Ding, J., et al. Biofilm microenvironment activated antibiotic adjuvant for implant-associated infections by systematic iron metabolism interference. Adv Sci. 11 (17), 2400862(2024).
  19. Cheng, J., et al. Biofilm heterogeneity-adaptive photoredox catalysis enables red light-triggered nitric oxide release for combating drug-resistant infections. Nat Commun. 14, 7510(2023).
  20. Zhu, W., et al. Photothermal nanozyme-based microneedle patch against refractory bacterial biofilm infection via iron-actuated Janus ion therapy. Adv Mater. 34, 2207961(2022).
  21. Shen, Z., et al. Overcoming the oxygen dilemma in photoredox catalysis: Near-infrared (NIR) light-triggered peroxynitrite generation for antibacterial applications. Angew Chem Int Ed. 135, e202219153(2023).
  22. Sun, J., et al. Local delivery of gaseous signaling molecules for orthopedic disease therapy. J Nanobiotechnol. 21 (1), 58(2023).
  23. Liu, Q., et al. Nano-fat actuated lipometabolic reprogramming of macrophages for intracellular infections in biofilm microenvironment. Adv Funct Mater. 34, 2405852(2024).
  24. Zhang, X., et al. Targeted modulation and enhancement of macrophages via sonodynamic therapy-driven cupferroptosis-like stress for implant-associated biofilm infections. Nano Today. 54, 102092(2024).
  25. Wang, Z., et al. Balancing bioresponsive biofilm eradication and guided tissue repair via pro-efferocytosis and bidirectional pyroptosis regulation during implant surgery. ACS Nano. 18 (20), 13196-13213 (2024).
  26. Xu, D., et al. Nanoadjuvant-triggered STING activation evokes systemic immunotherapy for repetitive implant-related infections. Bioact Mater. 35, 82-98 (2024).
  27. Hu, X., et al. Biomimetic metal-organic framework combats biofilm-associated infections via hyperthermia-enhanced bacterial metabolic interference and autophagy-promoted adaptive immunity. Adv Funct Mater. 34, 2310509(2024).
  28. Wang, Q., et al. Biofunctional magnesium coating of implant materials by physical vapour deposition. Biomater Transl. 2 (3), 248-256 (2021).
  29. Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous infection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J Vis Exp. (48), e2528(2011).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Histopathology: Methods and Protocols. Day, C. E. , Springer. New York. 31-43 (2014).
  31. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  32. Lee, S. W., et al. How microbes read the map: Effects of implant topography on bacterial adhesion and biofilm formation. Biomaterials. 268, 120595(2021).
  33. Zhang, L. -j, et al. Age-related loss of innate immune antimicrobial function of dermal fat is mediated by transforming growth factor beta. Immunity. 50 (1), 121-136.e5 (2019).
  34. Zhang, L. -j, et al. Diet-induced obesity promotes infection by impairment of the innate antimicrobial defense function of dermal adipocyte progenitors. Sci Transl Med. 13 (577), eabb5280(2021).
  35. Carli, A. V., et al. Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection. J Bone Joint Surg Am. 98 (19), 1666-1676 (2016).
  36. Li, X., et al. Comparative analysis of the effects of cyclophosphamide and dexamethasone on intestinal immunity and microbiota in delayed hypersensitivity mice. PLOS ONE. 19 (10), e0312147(2024).
  37. Thanabalasuriar, A., et al. Neutrophil extracellular traps confine Pseudomonas aeruginosa ocular biofilms and restrict brain invasion. Cell Host Microbe. 25 (4), 526-536.e4 (2019).
  38. Tseng, C. W., et al. Subcutaneous infection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J Vis Exp. (48), e2528(2011).
  39. Yang, C., et al. A periprosthetic joint Candida albicans infection model in mouse. J Vis Exp. (204), e65263(2024).
  40. Kelley, B. V., et al. In vivo mouse model of spinal implant infection. J Vis Exp. (160), e60560(2020).
  41. Greig, D., et al. Platelet deficiency represents a modifiable risk factor for periprosthetic joint infection in a preclinical mouse model. J Bone Joint Surg Am. 103 (11), 1016-1025 (2021).

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Modelo de Infecção AnimalModelo de Infecção MurinaImplante de TitânioStaphylococcus AureusFormação de BiofilmeAbscesso SubcutâneoQuantificação da Carga BacterianaMicroscopia Eletrônica de VarreduraAnálise Histológica
Modelo animal de infecções associadas a implantes em camundongos
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.