Transplante ortotópico de membro anterior de rato

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para demonstrar a viabilidade microcirúrgica do transplante de membros torácicos de ratos. Este modelo pode servir como uma importante plataforma translacional para a pesquisa de VCA.

Resumo

O alotransplante composto vascularizado (VCA) envolve o transplante de vários tipos de tecidos - incluindo pele, músculo, osso e nervos - oferecendo uma opção reconstrutiva promissora para pacientes com lesões traumáticas graves ou desfigurações. Apesar de seu potencial transformador, a VCA encontrou desafios significativos, como rejeição de enxertos, complicações crônicas de imunossupressão e complexidades da recuperação neuromuscular.

Utilizamos um modelo de membro anterior de rato como uma plataforma econômica e anatomicamente relevante para enfrentar esses desafios. O membro anterior do rato reflete de perto a anatomia do membro humano, aumentando o impacto translacional de nossas descobertas. Estudos anteriores validaram esse modelo para medir a recuperação funcional de forma confiável e reprodutível, estabelecendo-o como uma ferramenta fundamental para avaliar a trajetória de rejeição de enxertos de membros torácicos.

Além disso, o modelo oferece uma oportunidade valiosa para explorar abordagens terapêuticas inovadoras e servir como uma boa plataforma translacional para novas técnicas de preservação. Por meio de uma investigação mais aprofundada desse modelo, pretendemos aprofundar nossa compreensão dos mecanismos por trás da rejeição do enxerto e da recuperação neuromuscular. Em última análise, este trabalho se esforça para abrir caminho para melhorar os resultados clínicos da VCA, abordando as limitações atuais e os desafios futuros na medicina de transplante.

Introdução

O Alotransplante Composto Vascularizado (VCA) é um procedimento de mudança de vida para reconstruir defeitos teciduais graves. VCA refere-se ao transplante de um tecido composto composto por pele, músculo, ossos, tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e nervos. Um maior refinamento e exploração das técnicas de VCA beneficiariam profundamente os pacientes que sofrem lesões traumáticas ou desfigurações¹. No entanto, sua aplicação mais ampla é desafiada por obstáculos contínuos, como rejeição do enxerto, complicações da imunossupressão de longo prazo, recuperação neuromuscular e logística peri-transplante.

O modelo de membro anterior de rato emergiu como a escolha preferida para estudos de VCA devido à sua relação custo-benefício e sua grande semelhança com as características anatômicas e neuromusculares humanas ^2,3. Nosso trabalho anterior demonstrou que esse modelo fornece um meio confiável e reprodutível de avaliar a recuperação funcional comportamental⁴. Neste estudo, apresentamos um guia detalhado e passo a passo das técnicas microcirúrgicas essenciais necessárias para este modelo.

À medida que a pesquisa de VCA continua a evoluir, o modelo de membro anterior de rato permitirá a investigação mecanicista do processo de rejeição, regeneração nervosa e recuperação funcional neuromuscular. Os pesquisadores podem explorar novas técnicas de preservação, avaliar a eficácia dos métodos de perfusão por máquina e testar terapias imunomoduladoras emergentes, que podem ajudar a reduzir a dependência atual da imunossupressão de longo prazo.

Protocolo

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (RA18M74) de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde e pela Associação Americana para o Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório.

1. Procedimento do dador (figura 1)

1. Realize a indução da anestesia por inalação de isoflurano na concentração de 5% e mantenha a 1% durante todo o procedimento. Inicie o procedimento após confirmar o nível preciso de anestesia por meio de pinça no dedo do pé.
2. Faça uma incisão circunferencial cerca de 1 cm acima do cotovelo. Divida a pele e exponha o tecido subcutâneo superficial subjacente sem danificá-lo (Figura 1A).
3. Disseque o tecido/fáscia subcutâneo, cauterize todos os vasos superficiais e faça o transecto. Posteriormente, o deltoide, parte do peitoral maior, e o tríceps braquial serão expostos.
4. Dissecar sem corte sob o músculo peitoral maior, revelando os vasos braquiais, bem como o nervo mediano e ulnar (Figura 1B).
5. Cauterize a veia superficial no músculo deltóide e faça o transecto proximal, depois faça o transecto do músculo deltóide perpendicularmente à orientação da fibra muscular. Em seguida, disseque e faça o transecto do peitoral maior e menor, revelando a artéria, a veia e o nervo axilares. (Figura 1C).
6. Passe o nervo mediano, ulnar e radial em sua extremidade proximal (logo após a divisão), preservando o máximo de comprimento possível.
7. Dissecar e liberar a artéria e a veia braquial.
8. Traneccione o bíceps braquial, o tríceps braquial e o músculo grande dorsal. Certifique-se de que o úmero esteja devidamente exposto após a conclusão da dissecção.
9. Use uma pinça rongeur para transeccionar o osso distal à tuberosidade deltoide do úmero.
10. Verifique suavemente o lúmen da artéria e veia braquial (Figura 1C). Lave o enxerto com 6 mL de solução salina heparinizada.
11. Monte o manguito de poliimida na artéria e na veia braquial, respectivamente (Figura 1D).
12. Envolva o enxerto com gaze de algodão húmida e guarde-o a 4 °C.
13. Eutanasiar o rato doador por meio de uma overdose de anestésico inalante (isoflurano). Uma vez completamente sem resposta a um beliscão no dedo do pé, faça uma toracotomia e excise o coração.

2. Procedimento do destinatário (Figura 2)

1. Realize a indução da anestesia por inalação de isoflurano na concentração de 5% e mantenha a 1% durante todo o procedimento. Confirme o estado da anestesia por pinça do dedo do pé.
2. Faça uma incisão circunferencial cerca de 1-2 cm acima do cotovelo.
3. Dissecar os vasos subcutâneos e cauterizar os vasos maiores para expor o deltoide, parte do peitoral maior e o músculo tríceps braquial.
4. Realize uma dissecção romba abaixo do músculo peitoral maior para revelar os vasos braquiais, bem como o nervo mediano e ulnar.
5. Transeccionar o deltoide e parte do músculo peitoral maior e menor em sua extremidade distal, expondo os vasos braquiais, nervos mediano e ulnar (Figura 2A).
6. Dissecar e seccionar o nervo mediano e ulnar em sua extremidade distal. Ligue todos os ramos vasculares (Figura 2B).
7. Aplique o bíceps braquial, o tríceps braquial e o músculo grande dorsal para expor o úmero. Cauterize cuidadosamente qualquer sangramento dos músculos seccionados.
8. Transeccione o úmero na tuberosidade deltóide. Use cera óssea para selar a cavidade da medula.
9. Use uma haste intramedular para reconectar a cavidade da medula óssea do doador e do receptor e, em seguida, use cera óssea para selar a conexão. Suturar o músculo tríceps braquial com uma sutura absorvível 6-0, criando assim uma plataforma para a anastomose dos vasos.
10. Realize neurorrafia epiperineural com sutura 10-0 interrompida do nervo radial.
11. Realizar a anastomose vascular utilizando a técnica de balonete sem sutura (Figura 2C).
12. Realizar neurorrafia epiperineural com suturas interrompidas 10-0 para reconectar os nervos mediano e ulnar (Figura 2D).
13. Reconecte o músculo deltóide e peitoral maior usando suturas interrompidas.
14. Feche a ferida com sutura não absorvível 4-0.
15. Administre solução salina morna e estéril a 2% do peso corporal por via subcutânea no final da cirurgia.
16. Observe o animal por pelo menos 4 h sob uma lâmpada de aquecimento para recuperação. Devolva-o ao alojamento de animais quando estiver alerta, puder ficar em pé, demonstrar movimento coordenado e obter água e comida de forma independente.

3. Gerenciamento pós-transplante de longo prazo

1. Monitore os animais todos os dias em busca de sinais de dor e angústia, conforme definido abaixo.
   1. Verifique se há anorexia indicada pela ausência de fezes na gaiola.
   2. Verifique se o animal não bebe água, levando à desidratação evidenciada pelo enrolamento da pele.
   3. Verifique se o animal está curvado, sem vontade de se mover, favorecendo um membro ou guardando o local da incisão.
   4. Verifique se o animal não consegue se limpar, refletindo em uma pelagem com babados ou suja.
   5. Verifique se o animal lambe/arranha excessivamente. Verifique se há vermelhidão e inchaço no local da incisão e automutilação.
   6. Verifique se há comportamento agressivo, especialmente ao tentar pegar o animal.
   7. Verifique se o animal está ofegante, tem dificuldade para respirar e tem secreção nasal/ocular marrom-avermelhada.
   8. Verifique se há sepse.
2. Remover as suturas aos 14 dias de pós-operatório.
3. Administre uma segunda dose de buprenorfinaSR (dose no rato: 1,0 mg / kg SC) no 2º dia pós-operatório (POD2; 48 h após a dose inicial).
4. Inicie uma avaliação funcional semanal na semana 4 após o transplante.
   1. Resumidamente, sob anestesia geral, fixe o membro anterior do animal em abdução de 90°. Coloque dois eletrodos de agulha separados por 1 mm na axila perto da inserção do peitoral maior no úmero.
   2. Estimule o nervo mediano proximal por via percutânea a 10 V para induzir uma contração tetânica máxima dos flexores.
   3. Assim que a flexão digital completa formar uma preensão, coloque um laço de metal conectado a um medidor de força na palma da mão e prenda-o dentro dos dedos flexionados. Em seguida, puxe o medidor de força até que a pegada seja perdida, registrando a força máxima (em Newtons).

Resultados

A sobrevida do enxerto pode ser monitorada e determinada por meio de observação macroscópica. Imagens representativas de acompanhamento de curto prazo (POD7) e de longo prazo (POD120) são mostradas na Figura 3. O enxerto pôde se recuperar sem sinais aparentes de necrose. Os dados de sobrevida são mostrados na Figura 4. As amostras de pele e músculo são colhidas no ponto final designado. Imagens histológicas representativas são mostradas na F...

Discussão

O transplante ortotópico de membros torácicos em ratos é um modelo comumente utilizado em transplante reconstrutivo experimental, pois não apenas contém tecidos compostos vascularizados, mas também permite a avaliação da recuperação funcional. Uma técnica de sutura convencional para anastomose vascular é altamente complexa e exige habilidades microcirúrgicas avançadas que requerem anos de treinamento microcirúrgico. Para reduzir muito o tempo e os custos, uma técnica de anastomose vascul...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10-0 Micro Sutura Não Estéril	AROSurgical	TK-107038
4-0 Sharpoint Nylon	Essuturas Pretas	A1667N
4-0 Sharpoint Polysyn Taper	Estuturas	G214N
Seringas de 5 mL	MDC	2045
6-0 seda	Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Micro Vaso Duplo	S& T	00480
B-1 V Braçadeira de microvaso simples	S & T	00462
BD Quincke Agulhas espinhais	405073
Porta-agulhas Castroviejo Micro Porta-agulhas	F.S.T	12061-02
Chatilon DFE II medidor de força	Ametek	DFE II série
Algodão tiped	JH Supply loja	100252
tesouras finas - Carboneto de tungstênio	FST	14569-09
Fórceps	S & T	FRS-15 RM-8
Esponjas de Gaze	Fisher Scientific	22-362178
Halsted-Mosquito Hemostats	FST	13009-12
Heparina	JHH Farmácia	NDC 63323-540-05
IV Cateter Radiopaco 24 G	SMTH5053
Joalheiros Pinças de Coagulação Bipolar, Aço Inoxidável	ASSI	103000BPS03
Tesoura de mola Vannas com cabo redondo	FST	15400-12
Pinça especial	S & Dilatadores	FRAS-15 RM-8
- Instrumentos balanceados	FST	18602-15