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Artigo de método

Células semelhantes a ilhotas derivadas de transplante de células ductais em ratos

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DOI:

10.3791/68066

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1 de agosto de 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

Neste artigo

Resumo

As células semelhantes a ilhotas derivadas de células ductais demonstram potencial para o tratamento do diabetes, reduzindo os níveis de glicose no sangue e aumentando a produção de insulina em ratos diabéticos. No entanto, permanecem desafios para garantir função celular, defesa imunológica e segurança suficientes. Investigações adicionais são necessárias para aumentar a capacidade terapêutica dessas substâncias.

Resumo

O uso de células semelhantes a ilhotas derivadas de células ductais surgiu como uma abordagem potencial para o tratamento do diabetes tipo 1. Pacientes diabéticos têm síntese insuficiente de insulina em seus corpos devido à destruição autoimune das células beta pancreáticas responsáveis pela produção de insulina. Dentro dessa estrutura, o objetivo do transplante de células das ilhotas é restabelecer a capacidade dos pacientes de produzir insulina. No entanto, obstáculos como a aquisição insuficiente de células de ilhotas do pâncreas do doador e reações imunes dificultam a ampla aplicação desse método terapêutico. Em circunstâncias específicas, as células ductais pancreáticas possuem a capacidade de se transformar em células que produzem insulina. Essas células podem ser cultivadas em um ambiente controlado e convertidas em células semelhantes a ilhotas que têm a capacidade de liberar insulina, tornando-as adequadas para transplante. Essa estratégia inovadora oferece o potencial de interromper a progressão do diabetes tipo 1 e reduzir a dependência de injeções de insulina. Neste estudo, células semelhantes a ilhotas derivadas de células ductais foram transplantadas para o fígado através da veia porta do fígado em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Após o transplante, notamos reduções substanciais nos níveis de glicose no sangue dos ratos a partir do dia 5, que continuaram por 15 dias. Além disso, um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) demonstrou que ratos diabéticos que receberam transplantes de células semelhantes a ilhotas produziram significativamente mais insulina do que o grupo controle. Esses resultados sugerem que as células semelhantes a ilhotas derivadas de células ductais podem ser uma abordagem terapêutica promissora para o diabetes. Os principais obstáculos neste campo de estudo incluem alcançar capacidade funcional suficiente para as células, protegê-las do sistema imunológico e garantir sua segurança para aplicação terapêutica. Estudos futuros têm o potencial de produzir insights cruciais para otimizar o uso dessas células em ambientes terapêuticos, com foco no aumento da eficácia e segurança.

Introdução

O diabetes tipo 1 é um distúrbio autoimune persistente marcado pela destruição das células beta do pâncreas que produzem insulina. Os tratamentos atuais incluem principalmente a terapia com insulina de longo prazo, que, embora bem-sucedida no controle dos níveis de glicose no sangue, não fornece uma cura para a condição ou interrompe seu avanço1. A investigação de terapias alternativas para diabetes tipo 1 é motivada pela necessidade de alternativas mais eficazes do que a ênfase existente no tratamento com insulina. Pesquisas em andamento foram motivadas por isso, concentrando-se em tratamentos alternativos, como o transplante de células de ilhotas, que busca restabelecer a capacidade inerente do corpo de produzir insulina. Ainda assim, o fato de as células das ilhotas doadoras serem difíceis de encontrar e haver uma chance de rejeição imunológica dificultou a ampla utilização desse tratamento. Como resultado, a comunidade científica tornou-se cada vez mais interessada em encontrar fontes alternativas de células que produzam insulina 1,2,3.

Este método busca alavancar o potencial de regeneração dessas células para estabelecer um suprimento sustentável de células secretoras de insulina4. Investigações in vitro demonstraram a capacidade dessas células ductais de serem transformadas em células funcionais semelhantes a beta, capazes de secreção de insulina em resposta à estimulação da glicose5. Essa linha de investigação é especialmente vital, considerando os resultados desfavoráveis ligados ao transplante convencional de ilhotas devido às intrincadas respostas imunes envolvidas. Numerosos estudos indicam que as células derivadas de ductos não apenas têm a capacidade intrínseca de gerar insulina, mas também podem demonstrar características que podem promover tolerância imunológica, mitigando assim alguns desafios associados às técnicas tradicionais de transplante 5,6,7,8. Essas células podem ser cultivadas fora do corpo, convertidas em células semelhantes a ilhotas que podem liberar insulina e, posteriormente, implantadas em indivíduos com diabetes. Investigações pré-clínicas, que englobaram experimentos com ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina, demonstraram que o transplante dessas células pode efetivamente reduzir os níveis de glicose no sangue e aumentar a secreção de insulina9.

Nossa abordagem se concentrou em acelerar o processo de diferenciação e melhorar a funcionalidade das células produtoras de insulina, aumentando o meio de cultura celular padrão com insulina-transferrina-selênio (ITS) 10 , 11 , 12 , isoxazol 9 (ISX-9) 13 , 14 e GLP-115 . Esses fatores são relatados como essenciais para facilitar a diferenciação pancreática e aumentar a secreção de insulina. A integração desses componentes teve como objetivo obter células funcionais semelhantes a ilhotas de forma mais eficiente, garantindo sua capacidade de produzir e liberar insulina em resposta à estimulação da glicose 9,10,11,12,13,14.

No transplante de ilhotas, a rejeição imunológica constitui um obstáculo significativo para alcançar resultados bem-sucedidos. As ilhotas transplantadas alogênicas são vulneráveis ao ataque imunológico, necessitando de terapias imunossupressoras para evitar a rejeição16,17. O envolvimento das células ductais pancreáticas na rejeição imunológica durante o transplante de ilhotas representa um campo de estudo em desenvolvimento. Acredita-se que as células ductais possam ter propriedades que poderiam reduzir a rejeição imunológica, o que tornaria as ilhotas transplantadas mais propensas a sobreviver e funcionar adequadamente. Ilieva et al. demonstraram que ilhotas co-cultivadas com células ductais exibiram necrose central e apoptose reduzidas, indicando um efeito protetor contra danos imunomediados. Esse efeito pode ser mediado por fatores como o fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF-2) secretado pelas células ductais, conforme observado por Marín-Cañas et al. (2019)18. O efeito protetor é essencial, pois a rejeição imunológica representa um desafio considerável para o sucesso do transplante de ilhotas, especialmente no diabetes tipo 1. As células ductais em enxertos de ilhotas têm sido associadas a uma função e sobrevida aprimoradas do enxerto, provavelmente atribuíveis à sua capacidade de secretar fatores imunomoduladores que atenuam a resposta imune19.

Apesar dos avanços promissores, alguns obstáculos devem ser resolvidos para garantir a eficácia operacional e a segurança dessas terapias baseadas em células para uso clínico. É essencial verificar se as células induzidas exibem propriedades funcionais comparáveis às células beta nativas e estabelecer técnicas eficazes para proteger essas células de agressões do sistema imunológico para garantir sua sobrevivência e funcionalidade prolongadas20,21. À medida que este domínio de pesquisa progride, o conhecimento abrangente e a resolução desses obstáculos serão essenciais para alavancar a promessa de células produtoras de insulina derivadas de células ductais no tratamento do diabetes tipo 1 22,23,24.

Este estudo tem como objetivo avaliar a eficiência in vivo de células semelhantes a ilhotas derivadas de células ductais, desenvolvidas em condições ótimas, para a restauração do controle glicêmico em um modelo de rato diabético induzido por estreptozotocina.

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Protocolo

Este estudo aderiu às recomendações do ARRIVE, garantindo que o projeto, a execução e o relatório da pesquisa atendessem a altos padrões de bem-estar animal e integridade experimental (https://arriveguidelines.org). A Universidade Medipol de Ancara obteve a aprovação do comitê de ética (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) e autorização institucional. Todos os métodos foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos aplicáveis. Todas as medidas foram decretadas para minimizar o sofrimento dos animais e empregar o número mínimo de animais necessários para atingir os objetivos científicos.

1. Preparação das soluções

  1. Solução enzimática: Prepare uma solução de colagenase com 50 mg de colagenase de Clostridium histolyticum tipo V em pó. Prepare uma solução de 50 mL combinando colagenase com HBSS (contendo Ca-Mg) para atingir uma concentração de 1 mg / mL. Utilizar 7 ml da solução por amostra e colocar o restante no congelador a -20 °C.
    NOTA: A concentração recomendada de colagenase é de 1 mg/1 mL. Antes de ser aspirada para as seringas, a colagenase deve ser misturada com a solução pré-preparada de HBSS até uma concentração de 1 mg/ml.
  2. Solução de lavagem 1: Retire 62,5 mL de 500 mL de HBSS sem vermelho de fenol. Adicione 50 mL de FBS ao HBSS restante com muito cuidado. Adicione 5 mL de penicilina/estreptomicina (P/S), 5 mL de L-glutamina (L-Gln) e 2,5 mL de HEPES 1 M. Traga o volume para 500 mL.
    NOTA: Com a adição de vermelho de fenol, o volume final consiste em 88% de HBSS, 10% de FBS, 1% de P/S e 1% de l-Gln. Para evitar a formação de espuma e garantir a precisão, incorpore cuidadosamente o soro fetal bovino passo a passo.
  3. Meio de cultura para células e solução de lavagem 2: Retire 62,5 mL de 500 mL de Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI com L-Gln). Tenha cuidado para evitar que o FBS espume durante a adição gradual de 50 mL ao RPMI restante. Adicione 2.5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de P/S e 5 mL de L-Gln. Certifique-se de que o volume total seja de 500 mL. Conservar a 4 °C.
  4. Soluções de gradiente de densidade: Prepare as soluções de densidade final diluindo a solução de densidade de 1100 mg / mL com solução de HBSS para obter uma faixa de densidade intermediária de 1062-1096 mg / mL. Para garantir a precisão, verifique com um densitômetro a densidade de cada solução preparada. Utilizar a solução de concentração 1077 como referência. Uma vez obtidas as concentrações desejadas (1062-1096 mg/ml), transferir as soluções para recipientes herméticos e conservá-las num local escuro a 4 °C para manter a sua estabilidade.
  5. Prepare uma solução de azul de tripano a 0,4%. O desenvolvimento celular é promovido pela solução salina tamponada com fosfato (PBS), que tem um pH de 7,4.
  6. Meio de crescimento de cultura celular: Combine 43,4 mL de Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) e Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-baixa glicose). Adicione 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1% de L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) e 0,2 mL de HEPES 1 M. Completar o volume final para 100 ml. Conservar a 4 °C.
  7. Meio de diferenciação de cultura celular: Adicione 43,4 mL de RPMI com 43,4 mL de DMEM-baixa glicose. Adicione 10% de FCS, 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1% de L-Gln, 1% de P / S e 0,2 mL de 1 M HEPES na mistura. Além disso, adicione 1 μL de Isoxazol 9 (ISX-9) diluído em 4 mL de etanol ao meio de diferenciação. Finalmente, adicione 24 μL de uma solução de peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) a uma concentração de 50 nM no meio de cultura celular.
    NOTA: ISX-9 e GLP-1 só são adicionados frescos durante as mudanças de cultura; eles são pré-preparados. É necessária uma nova preparação para qualquer material cultural.
  8. Solução de ditizona (DTZ): Dissolva 100 mg de ditizona em 20 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e misture bem. Adicione 30 mL de HBSS à solução resultante e mexa até obter uma mistura homogênea. Filtrar a solução com filtros de 0,2 ou 0,4 μm. Adicione 50 mL de HBSS à solução filtrada. Rotular a solução com a data de preparação. Quando os sólidos estiverem completamente decompostos, passe a solução por um dispositivo de filtro de 0,4 μm. Coloque a solução filtrada em tubos de 2 mL e use-os imediatamente, após o descongelamento. Manter a solução produzida a -20 °C.
  9. Solução de Krebs: Em um recipiente de 250 mL, adicione 1,68 g de cloreto de sódio (para 115 mM), 0,50 g de bicarbonato de sódio (para 24 mM), 0,09 g de cloreto de potássio (para torná-lo 5 mM), 0,05 g de cloreto de magnésio (para 1 mM), 0,09 g de cloreto de cálcio (para 2,5 mM) e 0,25 g de albumina de soro bovino (para 0,1%). Adicione 6,25 mL de HEPES 1 M. Ajuste o volume para 250 mL adicionando água deionizada e mexa até que tudo esteja combinado. Ajuste o pH para uma faixa de 7,3 a 7,5, usando NaOH 1 M ou HCl 1 M. Filtre através de um filtro de 0,22 μm. Armazene as soluções em temperatura ambiente. Em banho-maria a 37 °C, adicionar as soluções quando estiverem prontas a ser utilizadas.
  10. Solução de alta concentração de glicose: Meça e adicione 149,1 mg de D-(+)-glicose a um tubo. Adicione 50 ml de solução de Krebs ao tubo e misture bem agitando. Filtre através de um filtro de 0,22 μm.
  11. Solução de baixa concentração de glicose: Combine 1 mL de solução de alta concentração de glicose 16,7 mM com 9 mL de solução de Krebs.

2. Isolamento do pâncreas de ratos

  1. Comece com uma coorte de três ratos de laboratório Wistar Albino (3 meses de idade/macho) pesando entre 220 g e 280 g. Anestesiar os animais com uma combinação de cetamina (35-50 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Verifique a profundidade da anestesia pela falta da resposta de retirada do pedal. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar que sequem.
  2. Inicie o processo cirúrgico com uma incisão abdominal na linha média de 3-4 cm ao longo da linha alba com uma tesoura. (Figura 1A). Realize uma manipulação delicada do fígado exercendo uma leve pressão física com os dedos na caixa torácica para elevar o diafragma. Exteriorize o fígado e posicione-o em gaze estéril para estabilidade.
  3. Prepare uma solução padronizada de colagenase na dose de 28 mg / g de peso corporal e retire 7 mL (cerca de 7 g) na seringa para ratos com peso entre 250 e 300 g. Modifique o volume da solução com base no peso corporal de cada animal.
  4. Incisar o ducto pancreático. Usando uma tesoura vascular fina, corte o ducto perto do fígado. Use posições anatômicas em relação ao pâncreas e à vasculatura circundante para identificar o ducto. Use dicas de localização, como vasos sanguíneos próximos e características do tecido, para garantir a precisão. Faça um corte perfeito neste local para oclusão.
    NOTA: A incisão era mínima - muito pequena para ser medida com precisão - mas suficientemente larga para permitir a inserção do cateter. A incisão permite uma colocação suave e eficiente do cateter, garantindo um trauma mínimo no tecido circundante.
  5. Insira um cateter com uma entrada integrada dentro da abertura ductal gerada (Figura 1B). Após a colocação correta, prenda o cateter usando uma pinça cirúrgica (por exemplo, micropinça) para evitar deslocamento.
  6. Administre a solução enzimática de colagenase por infusão controlada por meio de depressão gradual e intencional do êmbolo.
  7. Após a inflação, use instrumentos cirúrgicos finos para separar cuidadosamente o tecido pancreático das estruturas circundantes. Realize a excisão rapidamente e com manobras precisas e suaves para minimizar os danos aos tecidos. Imediatamente após a remoção, coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL sobre gelo para interromper qualquer atividade enzimática.
  8. Todo o processo deve levar cerca de 60 s para um pâncreas25. Além disso, até que todos os pâncreas estejam ingurgitados, mantenha a colagenase e os pâncreas removidos no gelo.

figure-protocol-1
Figura 1: Processamento pancreático. (A) O pinçamento da abertura do ducto pancreático no duodeno e (B) A insuflação da colagenase tipo 5 resulta em uma imagem do pâncreas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3 Isolamento de células ductais do tecido pancreático

  1. Após a extração cirúrgica, incubar o pâncreas em banho-maria a 37 °C durante 12 min.
  2. Adicione 25 mL de solução de lavagem 1 ao tubo para neutralizar a atividade da colagenase. Agite manualmente o tubo para promover a quebra do tecido pancreático. Execute todos os procedimentos subsequentes em um campo estéril com fluxo laminar.
  3. Mantenha todas as mídias no gelo. Centrifugar as amostras a 4 °C, a 100 x g durante 1 min, e colocar o travão na posição máxima. Descarte o sobrenadante. Ao pellet celular, adicione 25 mL da solução de lavagem 1 e ressuspenda a mistura.
  4. Efectuar novamente a centrifugação e rejeitar o sobrenadante. Ao pellet, adicione 25 mL da solução de lavagem 1 e ressuspenda. Coe o tecido pancreático processado através de uma malha de aço de 425 μm para eliminar quaisquer fragmentos vasculares residuais ou de tecido não digerido.
  5. Após a filtração, completar o volume para 25 ml com a solução de lavagem 1. Realize a centrifugação 1x a 100 x g por 1 min a 4 °C. Remova o sobrenadante.
  6. Transfira o pellet para um novo tubo usando uma pipeta de plástico estéril após adicionar 50 mL de meio RPMI. Centrifugar novamente a amostra a 100 x g durante 1 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento para análise posterior.
    NOTA: Todas as etapas restantes foram realizadas dentro de gabinetes de fluxo laminar em condições estéreis adequadas para experimentos de cultura de células.
  7. Adicione 10 mL de solução de densidade 1.077 ao pellet adquirido após o último, seguido de uma suave ruptura e homogeneização do pellet batendo na borda do tubo com um dedo.
    NOTA: A faixa de densidade para isolar as células das ilhotas do tecido pancreático circundante é de aproximadamente 1,077, em contraste com a densidade do meio, que é de aproximadamente 1,00126. Consequentemente, empregamos a solução de densidade 1.077 para este objetivo.
  8. Adicione 10 mL de RPMI e centrifugue a 600 x g por 12 min a 4 °C com os freios desligados. Este procedimento estabeleceu uma divisão baseada na densidade dentro dos tubos, resultando no acúmulo de células de ilhotas em uma camada logo abaixo da camada RPMI, posicionada diretamente abaixo da camada RPMI.
  9. Remover as células das ilhotas e o RPMI foram eliminados. O objetivo desta etapa era purificar as células das ilhotas para aumentar sua remoção dos tecidos pancreáticos, resultando em um processo de isolamento de células ductais mais puro.
  10. Remova qualquer tecido pancreático extra em um novo tubo de 50 mL usando uma pipeta. Adicione 10 mL de solução de densidade 1,096 ao pellet de tecido.
  11. Em seguida, adicione lentamente 10 mL de gradiente de solução de densidade 1,062 com uma seringa. Preste atenção em manter uma distribuição homogênea de componentes. Faça um gradiente empilhando soluções em ordem do mais denso para o menos denso.
  12. Adicione 10 mL de RPMI por cima. Tubos de centrífuga a 600 x g por 12 min a 4 °C sem freios. Após a rotação, diferentes camadas de densidade são vistas. As células ductais estão na camada intermediária, abaixo da camada RPMI.
  13. Remova cuidadosamente as células ductais usando uma pipeta Pasteur descartável e coloque-as em um tubo separado de 50 mL. Adicione 25 mL de solução de lavagem 2 e misture a suspensão suavemente batendo no tubo com um dedo.
  14. Gire o tubo a 100 x g por 1 min e descarte o sobrenadante. Execute mais duas rodadas de centrifugação com o pellet. Após a última lavagem, adicione 2 mL de solução de lavagem 2 ao pellet27.

4. Isolamento e cultura de células ductais

  1. Inocular as células colhidas num balão T25 e adicionar 5 ml de fluidos de cultura de células pré-aquecidos. Mantenha a incubadora a 5% de CO2e 37 °C.
    NOTA: Manter as temperaturas fisiológicas estáveis é importante para que a cultura de células funcione, então todas as soluções foram aquecidas a cerca de 37 ° C antes de serem usadas.
  2. Após 24 horas, aspire o meio com cuidado. Enxágue as células duas vezes com solução de lavagem 2. Adicionar meio de cultura de células frescas e colocar o balão de volta na incubadora. As células que aderiram à superfície do frasco foram chamadas de células ductais.
  3. Substitua o meio de crescimento a cada 3 dias. Se a cor do meio mudar muito rapidamente, significa que ele está perdendo nutrientes e se tornando mais ácido, o que indica que o meio deve ser trocado com mais frequência.
  4. Células de passagem uma vez que as células nos frascos atingem 80% de confluência. Lave com 1-2 mL de PBS 2x e livre-se de qualquer meio extra.
  5. Adicionar 2 ml de solução de dissociação enzimática (sem vermelho de fenol) para iniciar o processo de degradação enzimática e separar as células da superfície do frasco.
  6. Incube por 2-3 min e avalie o descolamento celular sob um microscópio de 10x. Se as células permanecerem parcialmente ligadas, reincubar novamente a 37 °C durante mais 2 min.
  7. Depois que as células estiverem completamente separadas da superfície do frasco, interrompa a digestão da enzima adicionando cerca de 8 mL de meio de crescimento celular, que é 4x o volume da solução de dissociação enzimática. Bata suavemente nas paredes do frasco.
    NOTA: O tapping, que pode ajudar as células a se separarem, reduz o tempo total de incubação e impede que as enzimas danifiquem a membrana celular, garantindo que isso aconteça após o contato prolongado com a solução de dissociação enzimática.
  8. Depois de adicionar meios de cultura celular, transfira a suspensão celular para tubos de 15 ml e centrifugue a 150 x g durante 10 min a 25 °C com uma configuração de desaceleração suave (velocidade 9 de ruptura) para peletar as células.
  9. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 6-8 mL de solução de lavagem 2. Repita a centrifugação como acima. Descarte o sobrenadante. O procedimento foi repetido para garantir a eliminação completa da solução de dissociação enzimática.
  10. Usando pipetagem suave, ressuspenda o pellet em 5 mL de meio de cultura de células frescas para fazer uma suspensão celular uniforme. Nesta fase, execute a contagem de células.
  11. Misture 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e conte as células usando um hemocitômetro.
  12. Semear 1 × 106 células por balão T25 utilizando a suspensão contada.
    NOTA: A essa altura, a maioria das células havia sido identificada como células ductais. Um bom número de células foi semeado em cada prato com base na contagem de células que foi feita. Com base no que vimos nos experimentos, as células foram espalhadas em dois frascos T25 diferentes, uma vez que atingiram o melhor nível de confluência em um frasco. Isso foi feito para manter a eficiência da proliferação alta. Conseguimos separar com sucesso as células ductais do tecido do pâncreas de ratos usando esse método. Depois de serem separadas com sucesso, as células foram preparadas para novos experimentos de acordo com o plano de estudo.
  13. Continue cultivando até a passagem 4. Células de passagem quando necessário para manter as condições ideais de crescimento.
    NOTA: A partir da passagem 4, houve um aumento notável no número de células entre os dias 3 e 9. Como as células tendem a ser menos capazes de se dividir após mais ciclos, esse método garantiu que houvesse células viáveis suficientes. Uma vez que as células ductais cresceram o suficiente, elas começaram a se transformar em células semelhantes a ilhotas. Com base no que descobrimos, as células entre os estágios 3 e 6 têm as taxas mais rápidas de proliferação. A passagem 4 mostra um aumento particularmente notável no número de células ductais. No entanto, após a passagem 6, houve um declínio na capacidade proliferativa. O protocolo foi ajustado com base nesses resultados para obter o número certo de células, mantendo sua viabilidade e utilidade28.

5. Diferenciação de células ductais em aglomerados semelhantes a ilhotas

  1. Colha as células ductais da passagem 4 usando o procedimento de passagem padrão. Lave duas vezes com 1-2 mL de PBS para remover o meio residual e as células soltas.
  2. Adicionar 2 ml de solução de dissociação enzimática (sem vermelho de fenol) ao balão. Incubar a 37 °C por 2-3 minutos e monitorar sob um microscópio de 10x.
  3. Se as células permanecerem presas, incube por mais 2 minutos. Pare a reação enzimática adicionando 8 mL de meio de crescimento celular.
  4. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml e centrifugar a 150 × g durante 10 minutos a 25 °C, regulando 9 para acelerar e abrandar.
  5. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 6-8 mL de solução de lavagem 2. Centrifugue e descarte o sobrenadante.
  6. Ressuspenda o pellet final em 5 ml de meio fresco. Conte as células conforme descrito anteriormente.
  7. Semeie 1 × 105 células por poço em uma placa de seis poços, adicionando 3 mL de meio por poço. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
  8. Substitua o meio a cada 3 dias durante os primeiros 7 dias. Ajuste a frequência se a cor do meio mudar rapidamente.
  9. Mude gradualmente para o meio de diferenciação após 7 dias. Continue cultivando por 15 dias no total (7 dias de crescimento + 8 dias de diferenciação). Troque o meio a cada 2 dias durante a diferenciação.
  10. No dia 8, comece a fase de diferenciação. Após 4 dias, lave as células duas vezes com PBS e adicione 500 μL de solução de dissociação enzimática.
  11. Incube 2-3 min, interrompendo a reação adicionando 2 mL de meio de crescimento. Centrifugue a 150 x g por 10 min a 25 °C. Ressuspenda e semeie novamente 1 x 105 células por poço em placas de seis poços.
  12. No 15º dia, realize uma análise microscópica completa para caracterizar e confirmar claramente a formação de agregados celulares semelhantes a ilhotas24.

6. Quantificação da concentração de zinco em células ductais diferenciadas por Ditizona

  1. Descongele e equilibre a solução DTZ do armazenamento a -20 °C. Adicione 3-4 gotas de solução DTZ a cada poço das células diferenciadas de 15 dias. Observe ao microscópio. Identifique as células produtoras de insulina pela coloração vermelha28 (Figura 2).

figure-protocol-2
Figura 2: Imagens microscópicas de células ductais semelhantes a ilhotas. Imagens em (A) dia 11 de cultura (20x), (B) dia 13 de cultura (20x), (C, D) dia 15 de cultura (20x). As células foram visualizadas após a coloração com Ditizona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Teste de estimulação de glicose

  1. Semeie 1 x 104 aglomerados semelhantes a ilhotas por poço em uma placa de 24 poços com 1 mL de meio de diferenciação por poço.
  2. No dia 15, estimule as células com glicose. Remova o meio existente e adicione 1 mL de solução com baixo teor de glicose (1,67 mM). Incubar 1 h a 37 °C.
  3. Colete o meio e transfira para tubos de 2 mL. Adicione 1 ml de solução com elevado teor de glucose (16,7 mM). Incubar 1 h. Colete o meio para análise. Recolher o meio de cultura celular a cada intervalo de 1 h entre a adição de diferentes soluções de glicose.
  4. Realize o ELISA de insulina seguindo as instruções do fabricante. Uma vez removida da bolsa de alumínio, deixe a microplaca se equilibrar à temperatura ambiente antes de iniciar o procedimento ELISA.
  5. Adicione 10 μL de reagente à amostra, controle e poços padrão. Adicione 75 μL de solução conjugada de trabalho. Sela a placa e incube por 2 h em temperatura ambiente com agitação (700-900 rpm).
  6. Lave os poços 6x com 350 μL de tampão de lavagem. Adicione 100 μL de substrato de 3,3 ', 5,5,5,5-tetrametilbenzidina (TMB) por poço. Sele as placas e incube 15 min no escuro com agitação (700-900 rpm) em temperatura ambiente.
  7. Adicione 100 μL de solução de parada por poço e misture agitando suavemente a placa para interromper o processo. Remova as bolhas e leia a absorbância a 450 nm. Meça durante 30 min após a adição da solução de paragem27.

8. Ilhéus e transplante de células ductais semelhantes a ilhotas

  1. Anestesiar ratos com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Higienize e cubra o local da cirurgia. Faça uma incisão na linha média de 2-3 cm.
  2. Deslocar os intestinos e expor a veia porta usando afastadores. Realizar venotomia e inserir um cateter pré-preenchido com solução salina (Figura 3A).
  3. Infundir 100-500 μL de suspensão celular na veia porta. Remova o cateter e feche a venotomia com suturas ou adesivo. Feche o abdome e monitore a recuperação, fornecendo analgesia conforme necessário (Figura 3B).

figure-protocol-3
Figura 3: Transplante de ilhotas e células semelhantes a ilhotas. (A) Intracateter intravenoso estéril usado para transplantar ilhotas e células semelhantes a ilhotas. (B) Transplante de ilhotas e células semelhantes a ilhotas em uma seringa estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ)

  1. Ratos rápidos 12 h. Administrar 45 mg/kg de STZ por via intraperitoneal, dissolvido em tampão citrato frio (pH 4,5).
    NOTA: O jejum de 12 h antes da injeção de STZ aumenta a expressão de GLUT2, o que facilita o transporte de glicose nas células beta pancreáticas. Esse processo aumenta a captação de STZ nas células, resultando em maior dano às células beta. Esse mecanismo facilita a progressão da hiperglicemia mais significativa e aumenta a eficácia do modelo de diabetes.
  2. Confirme o diabetes 48-72 h após a injeção com glicose no sangue >250 mg / dL. Classificar os ratos que geralmente atingiram valores de glicose no sangue acima de 250 mg/dL como diabéticos e incorporá-los ao experimento29.

10. Preparação de ilhotas e células semelhantes a ilhotas para transplante

  1. Colha as células após o tratamento com a solução de dissociação enzimática por 1 min. Raspe as células que aderem à superfície. Substitua por meio novo e colete as células.
  2. Centrifugue a 300 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet em 100-150 μL de solução salina. Realize a contagem de células e ajuste a contagem de células para 1000 IEQ ou 800 ilhotas por rato ou 1 x 105 células semelhantes a ilhotas por rato.

11. Transplante de veia porta

  1. Anestesiar os animais por injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Higienizar a região do abdômen do animal com uma solução estéril (betadine ou etanol 70%). Envolva a área cirúrgica com um campo estéril.
  3. Faça uma incisão na linha média, com aproximadamente 2-3 cm de comprimento, para obter acesso à cavidade abdominal.
  4. Deslocar os intestinos para revelar o fígado. Prenda os lobos esquerdo e direito do fígado com afastadores estéreis. Exponha a superfície ventral do fígado para localizar a veia porta.
  5. Enxágue previamente o cateter de polietileno (PE-10 ou PE-50) com solução salina e encha-o completamente. Use uma pinça microcirúrgica para segurar um ramo da veia porta - normalmente o ramo lateral esquerdo ou direito.
  6. Realize uma pequena venotomia (cerca de 1-2 mm). Insira cuidadosamente o cateter no local da venotomia. Para evitar o deslocamento, use material de sutura ou fórceps para ancorar o cateter, normalmente usando um fio de sutura 6-0.
  7. Verifique o posicionamento preciso do cateter administrando gradualmente soluções salinas estéreis. O cateter entregou gradualmente a célula de ilhotas preparada e a suspensão de células semelhantes a ilhotas na veia porta. O volume total é de 100-500 μL.
  8. Após a conclusão da infusão, remova o cateter e use adesivo de tecido estéril ou suturas absorvíveis para selar o local da venotomia.
  9. Realize o gerenciamento de hemorragia. Reposicione todos os tecidos ao redor do fígado e suture os músculos abdominais usando fio absorvível. Prenda a pele com suturas ou clipes.
  10. Mantenha o animal sob vigilância em um ambiente quente. Forneça analgésicos adequados para o controle da dor durante o despertar da anestesia (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg / kg). Observe os animais por 48 h. Examinar indícios de infecção, edema no sítio cirúrgico ou hemorragia30.

12. Monitoramento de glicose no sangue

  1. Avalie os níveis iniciais de glicose no sangue. Segure o rato com cuidado e use uma lanceta para fazer um pequeno corte na ponta da cauda. Remova suavemente a gota inicial de sangue usando um cotonete estéril.
  2. Aplique a segunda gota de sangue na tira de teste de glicose e documente o nível de glicose basal31.

13. Teste de tolerância à glicose intraperitoneal

NOTA: Os ratos são submetidos ao Teste de Tolerância à Glicose Intraperitoneal (IPGTT) para avaliar a eficiência da depuração de glicose da corrente sanguínea. Este teste oferece informações sobre o metabolismo da glicose, sensibilidade à insulina e possíveis condições diabéticas. O teste de tolerância à glicose intraperitoneal foi realizado no dia 15 e no dia 15 pós-transplante. A principal justificativa para implementar uma duração de jejum designada antes do IPGTT é estabilizar os níveis basais de glicose e garantir um estado metabólico consistente. O período de jejum facilita a depleção dos estoques de glicogênio hepático, permitindo uma avaliação mais confiável da resposta de tolerância à glicose. O jejum de 6 h reduz os efeitos pós-prandiais, enquanto o jejum noturno (aproximadamente 12-16 h) pode ter implicações distintas, potencialmente influenciando a sensibilidade à insulina e o metabolismo da glicose.

  1. Sujeitar os ratos a um período de jejum de 6 horas, com apenas acesso à água permitido durante a noite, garantindo que a duração do jejum não exceda 12 horas. Garanta um período de jejum uniforme para todos os indivíduos para reduzir a variabilidade nas medições de glicose.
  2. Antes de a glicose ser administrada, pese os ratos. Para preparar uma solução estéril, dissolva 20 g de glicose em 100 mL de solução salina estéril.
    NOTA: A dosagem padrão é geralmente de 2 g de glicose / kg de peso corporal (2 g / kg). O volume total dado é determinado pelo peso corporal do animal.
  3. Avalie os níveis basais de glicose no sangue. Segure o rato e use uma lanceta para fazer uma pequena incisão na ponta da cauda. Remova suavemente a primeira gota de sangue usando um cotonete estéril.
  4. Aplique a segunda gota de sangue na tira de teste de glicose e registre o nível basal de glicose.
  5. Com base no peso corporal do rato, administrar a quantidade adequada de solução de glicose a uma taxa de 2 g/kg.
  6. Antes da administração intraperitoneal (IP) da solução de glicose, manuseie suavemente o rato. Injete glicose na cavidade peritoneal, não no tecido subcutâneo ou em qualquer órgão, e certifique-se de que seja administrada corretamente.
  7. Após a injeção de glicose, colete amostras de sangue em intervalos especificados para monitorar os níveis de glicose. Os intervalos de tempo típicos são 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção.
  8. Em cada ponto, colete sangue cortando a veia da cauda. Antes de cada coleta de sangue, certifique-se de que a cauda seja limpa com um cotonete embebido em álcool.
  9. Em cada ponto de tempo designado, meça os níveis de glicose e documente usando um medidor de glicose.
  10. Durante o teste, monitore os ratos quanto a quaisquer sinais de desconforto ou reações adversas. Para minimizar o estresse dos animais entre as medições, mantenha um ambiente quente e silencioso.
  11. Após a última medição da glicemia, limpar as feridas da cauda e confortar os animais29.

14. Análise da insulina através de ELISA após colheita de sangue

NOTA: As etapas deste protocolo são para coletar sangue da aorta abdominal de um rato e, em seguida, usar o método de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para testar a insulina.

  1. Anestesie o rato antes da coleta de sangue, conforme descrito anteriormente. Coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal em uma plataforma cirúrgica estéril.
  2. Depile a área abdominal e desinfete a área com etanol a 70% ou solução de iodo para garantir a esterilidade.
  3. Faça uma incisão na linha média com bisturi para penetrar na pele e nas camadas musculares e expor a cavidade abdominal.
  4. Retraia os intestinos para acessar a aorta abdominal localizada adjacente à coluna. Use uma seringa heparinizada para inserir a agulha na aorta abdominal em um pequeno ângulo.
  5. Colete sangue (geralmente 1-3 mL, dependendo do tamanho do rato) na seringa. Aplique sucção gradual e consistente para evitar colapso vascular ou hemólise do sangue.
  6. Coloque o sangue coletado em um tubo de centrífuga e mantenha-o no gelo.
  7. Se o animal for sacrificado após o procedimento, realize a eutanásia de acordo com as diretrizes éticas institucionais.
  8. Centrifugue o sangue coletado a 300 x g por 10-15 min a 4 ° C para garantir a separação do plasma ou soro. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e conservá-lo a -80 °C para posterior análise da insulina.
    NOTA: É importante evitar hemólise durante a coleta de sangue, pois isso pode afetar a precisão dos resultados do ELISA (Figura 4)29.

figure-protocol-4
Figura 4: Amostras de sangue foram obtidas da veia da cauda de ratos em tubos sanguíneos para análise de insulina na conclusão do experimento no dia 15 pós-transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

15. Medição de insulina por ELISA

  1. Prepare o kit ELISA de insulina de acordo com as instruções do fabricante. Permita que todos os reagentes, padrões e amostras atinjam a temperatura ambiente antes de iniciar o ensaio.
  2. Determine o número necessário de poços na placa ELISA para padrões, controles e amostras de soro de rato.
  3. Prepare as amostras de soro de rato para análise, diluindo-as conforme indicado no protocolo do kit ELISA, por exemplo, diluição de 1:10 em PBS.
  4. Prepare os padrões de insulina por diluição seriada para gerar uma curva padrão, por exemplo, variando de 0 a 10 ng / mL.
  5. Dispense padrões, controles e amostras de soro de rato diluídas (geralmente 50-100 μL por poço) nos poços indicados da placa ELISA. Dispense a solução de anticorpos de detecção fornecida com o kit em cada poço para garantir uma distribuição uniforme.
  6. Incube a placa pelo tempo especificado (normalmente 1-2 h) à temperatura ambiente ou de acordo com as instruções fornecidas.
  7. Após a incubação, certifique-se de que os poços sejam lavados com o tampão de lavagem designado, normalmente PBS contendo 0,05% de Tween-20, para remover substâncias não ligadas. Execute a etapa de lavagem 3x a 5x de acordo com as instruções do kit, certificando-se de que qualquer líquido restante seja completamente removido após cada lavagem.
  8. Coloque a solução de substrato em cada poço. O substrato irá interagir com o anticorpo ligado à enzima, causando uma mudança de cor; A intensidade da cor está relacionada à quantidade de insulina presente na amostra. Incube a placa na escuridão pelo tempo indicado pelo kit, normalmente variando de 15 a 30 min.
  9. Adicione a solução de parada a cada poço para encerrar a reação colorimétrica. A mudança de cor se estabilizará após a adição da solução de parada, que normalmente é amarela.
  10. Meça imediatamente a densidade óptica (OD) de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 nm (ou conforme especificado pelo kit).
  11. Gere uma curva padrão plotando as concentrações conhecidas de padrões de insulina em relação aos valores de densidade óptica (DO) correspondentes.
  12. Calcular a concentração de insulina em amostras de soro de rato utilizando a curva padrão e os valores de DO correspondentes. Os níveis de insulina devem ser relatados em ng/mL ou outras unidades apropriadas29.

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Resultados

Análise de microscopia de luz

Durante os exames do14º dia das células ductais, a análise por microscopia de luz revelou que as células se agrupavam e formavam uma estrutura semelhante a uma ilhota. Essa mudança estrutural indica que, após um certo período, as células ductais mudam suas características morfológicas entrando em uma ordem organizacional e ganhando uma aparência de ilhota. A tendência das células de se agruparem provavelmente se deve aos efeitos da comu...

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Discussão

O estudo da capacidade funcional de células semelhantes a ilhotas de diferentes fontes tem atraído considerável interesse na pesquisa do diabetes. A pesquisa inicial mostra que essas células podem liberar insulina quando os níveis de glicose são elevados, o que sugere que elas podem ser capazes de imitar as funções das ilhotas pancreáticas naturais. Os pesquisadores utilizaram a coloração com ditizona para verificar a semelhança fenotípica das células semelhantes a ilhotas com as ilhotas pancreáticas, como evidenciado pe...

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Divulgações

Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelo(s) autor(es).

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à equipe do laboratório por suas contribuições para o estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de Sódio 0,9%Sahar PharmaPara remoção de pâncreas e transplante de células
Pipeta sorológica de 10 mL - estérilCorning4488Para isolamento
Placa de 24 poçosCorning353047Para GSIS 
Pipeta sorológica de 25 mL - estérilCorning4489Para isolamento
70% de etanol ISOLAB64-17-5Para desinfecção de ratos
betadine Baticonol  1186Para desinfecção de ratos
Biocholl 1077SigmaL6715-BCPara purificação do pâncreas
Biocoll, Densidade 1,10 g/mLSigmaL6155-BCPara purificação do pâncreas
Medidores de glicose no sangue e tiras de teste de glicoseOn Call PlusPara medir a glicose no sangue
BSASigmaA9418Para preparação de krebs
CaCl2Sigma57647902Para preparação de krebs Composição do
cateter: Cateter de polietileno (intracath intravenoso)  Bico24G  e 14GPara pâncreas e fígado
CentrífugaThermoST1R PlusPara isolamento 
Colagenase Tipo V, ≥ 1 FALGPA unidades/mg sólido,
>125 CDU/mg sólido 		SigmaC9263- 1GPara digestão do pâncreas
D-(+)-glicose Sigma50-99-7Para GSIS e IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Para determinação de ilhotas
DMSOSigmaD8779Para resolver a DTZ
Dulbecco ' s Águia Modificada' s Médio (DMEM— baixa glicose) Gibco11885084Para cultura de células
Tubo EppendorfISOLABPara lavagem de células
Tubo Falcon (50 mL)ISOLABLB. IS.078.02.009Para isolamento
de soro fetal bovino (FBS)SigmaN4637Para isolamento e cultura de pâncreas
Agulha fina e material de sutura (tamanho 6-0 ou 7-0)PROLENE Blue 18" Agulha P-1 | 8697GPara remoção de pâncreas e transplante de células
peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) Aladdinrp174144Para Cultura de Células
Hank's solução salina balanceada (HBSS com Ca-Mg) CapricórnioHBSS-1APara preparação enzimática
HBSS sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenolBIOCHROM  L2015Para isolamento do pâncreas
HEPESLonzaPara cultura de células
Insulina ElisaAlpco80-INSRT-E01Para insulina elisa
insulina-transferrina-selênio (ITS)GibcoITS -GPara cultura de células
Isoxazol 9 (ISX-9) AladdinI304735-10mgPara cultura de células
KClSigma329820207Para preparação de krebs
Cetamina HCl 200 mg/mLNexGenPara ratos anestesia
Laminar Flow CabinetsLabor IldamBSC-1100IIA2-XPara isolamento e período de cultura
LancetasAyset28 GPara medição de glicemia
L-glutamina Sigma59202cPara isolamento e cultura do pâncreas
MgCl2Sigma329759772Para preparação do leitor de microplacas krebs
Leitor multimodoBioTek SynergyPara agitador de microplacas de insulina elisa
VWR  444-0270Para insulina elisa
Microscópio microcirúrgicoEMZ-200TR3.9X Para remoção de pâncreas e transplante de células
Tesoura e fórceps microcirúrgicosAesculapPara remoção de pâncreas e transplante de células Inserção de
Cultura de Células Penduradas Millicell, polietileno tereftalato 8.0µ m MILLIPOREPIEP30R48 Para GSIS 
NaClSigma7647-14-5Para preparação de krebs
NaHCO3Sigma144-55-8Para preparação de krebs
Pipeta Pasteur 3 MlBIOSIGMAPara isolamento
de penicilina/estreptomicina SigmaPara isolamento e cultura do pâncreas
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) BIOCHROM  L1815Para passagem celular
Afastador (para a estabilização do fígado e tecidos conjuntivos)AesculapPara remoção de pâncreas e transplante de células
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI com L-Gln)CapricórnioRPMI-APara isolamento e cultura do pâncreas
Steril Cotton TippedDynarexPara remoção de pâncreas e transplante
de célulasSeringa estéril (10 mL)Ayset32MM 22GPara reação Collegenase
CronômetroKenkoKK613DPara IPGTT
Streptozotocin (STZ) Sigma18883-66-4Para ratos diabéticos ocorrem
de Filtro de Driver de Seringa (GP-0.22 µ m-3 mm)MillexSLGP033RSPara esterilização de meio de cultura celular
Balão T25Thermo130189Para cultura
Reagentes TrypLE ExpressGibcoPara banho-maria de passagem celular
Trabalho IldamALB128para reação de collegenase
Xylazine 2% w / v Solução para injeçãoRompunpara anestesia de ratos
H1 Unidade

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