Method Article

Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, estabelecemos um método proteômico baseado em espectrometria de massa usando regiões isoladas de interesse em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Este protocolo é usado para analisar o proteoma de áreas específicas do tecido em seções de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A proteômica baseada em espectrometria de massa (MS) permite uma análise abrangente do proteoma em uma ampla gama de amostras biológicas, incluindo células, tecidos e fluidos corporais. Seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE), comumente usadas para arquivamento de longo prazo, surgiram como recursos valiosos para estudos proteômicos. Além de seus benefícios de armazenamento, os pesquisadores podem isolar regiões de interesse (ROIs) de regiões de tecido normal por meio de esforços colaborativos com patologistas. Apesar desse potencial, ainda falta uma abordagem simplificada para experimentos proteômicos que englobem isolamento de ROI, preparação de amostras proteômicas e análise de MS. Neste protocolo, é apresentado um fluxo de trabalho integrado que combina macrodissecação de ROIs, preparação de amostras baseada em armadilhas em suspensão e análise de MS de alto rendimento. Por meio dessa abordagem, as ROIs dos tecidos FFPE dos pacientes, consistindo em neoplasias císticas serosas benignas (SCN) e neoplasias mucinosas papilares intraductais pré-cancerosas (IPMN) diagnosticadas por patologistas, foram macrodissecadas, coletadas e analisadas, resultando em alta cobertura de proteoma. Além disso, as diferenças moleculares entre as duas neoplasias císticas pancreáticas distintas foram identificadas com sucesso, demonstrando assim a aplicabilidade dessa abordagem para o avanço da pesquisa proteômica com tecidos FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante décadas, tecidos humanos excisados cirurgicamente foram arquivados como blocos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE). Esses blocos de tecido preservam inicialmente a estrutura tridimensional (3D) embutida na parafina. Os tecidos são posteriormente fatiados com micrótomos, montados em lâminas e corados - comumente com hematoxilina e eosina (HE) ou imuno-histoquímica (IHQ) - para facilitar o diagnóstico histopatológico por patologistas experientes 1,2. Os tecidos FFPE oferecem vantagens distintas para armazenamento a longo prazo devido à reticulação de proteínas induzida pela formalina, que interrompe a atividade enzimática e proteolítica3. Por apoiarem a construção de conjuntos de amostras grandes e bem arquivados, os tecidos FFPE têm sido considerados uma pedra angular para a descoberta de biomarcadores em diversos campos, incluindo genômica 4,5,6,7.

No entanto, sua aplicação em proteômica baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) tem historicamente apresentado desafios. Uma limitação importante é a reticulação de proteínas induzida por formalina, que interfere na digestão tríptica - uma etapa crítica na análise global do proteoma8. Além disso, a pequena quantidade de proteína recuperável das lâminas de tecido muitas vezes torna os métodos convencionais de preparação de amostras inadequados. Apesar desses desafios, os avanços demonstraram que as ligações cruzadas de proteínas podem ser revertidas por meio de tratamento prolongado em alta temperatura 9,10,11. Ao mesmo tempo, os métodos de preparação de amostras otimizados para amostras de proteína de baixa quantidade expandiram o uso de tecidos FFPE na pesquisa proteômica12 , 13 , 14 , 15 .

Uma vantagem significativa do uso de lâminas de tecido FFPE em proteômica reside em sua capacidade de permitir uma análise específica da região. As lâminas FFPE geralmente contêm lesões e tecido normal adjacente (ANT). Analisar todo o tecido indiscriminadamente corre o risco de confundir os resultados devido a assinaturas moleculares mistas. Em contraste, isolar e analisar regiões de interesse (ROIs) - lesões versus ANT - permite uma caracterização mais precisa das características moleculares específicas das regiões patológicas. Consequentemente, as abordagens baseadas em FFPE tornaram-se cada vez mais populares em estudos proteômicos 16,17,18,19,20. Apesar de sua aplicação crescente, um fluxo de trabalho simplificado que descreve todo o experimento proteômico passo a passo ainda permanece escasso. Em particular, um protocolo baseado em vídeo não foi publicado.

Neste estudo, foi estabelecido um fluxo de trabalho proteômico robusto baseado em LC-MS, adaptado para o perfil preciso de alterações moleculares em regiões específicas da lesão. Usando tecidos FFPE diagnosticados por dois patologistas, as ROIs de neoplasias císticas serosas benignas (SCN) e neoplasias mucinosas papilares intraductais pré-cancerosas (IPMN) foram macrodissecadas, coletadas e analisadas. O protocolo incorpora uma macrodissecação de ROIs, preparação de amostra baseada em armadilhas de suspensão otimizada para entradas mínimas de proteínas e análise de aquisição independente de dados (DIA)-MS de faixa estreita. Este método permitiu a identificação de mais de 9.000 proteínas de áreas teciduais de aproximadamente 1 cm², decifrando assinaturas proteômicas distintas associadas a SCN e IPMN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital da Universidade Nacional de Seul (IRB No. 1904-114-1028). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar do estudo. Informações detalhadas sobre todos os materiais utilizados neste protocolo são apresentadas na Tabela de Materiais.

1. Recuperação do antígeno tecidual de FFPE para a preparação da amostra da proteômica

NOTA: Certifique-se de que os bisturis e todos os materiais, como o tubo usado, sejam estéreis para evitar qualquer contaminação cruzada. Os protocolos deste estudo podem ser adaptados para qualquer tecido FFPE com pequenas modificações com base na configuração do laboratório.

  1. Corte seções de tecido FFPE de 10 μm de blocos de tecido FFPE de montagem inteira e coloque-os em lâminas de vidro.
    NOTA: Neste estudo, o tecido FFPE do cisto pancreático humano (dois tipos diferentes de tecido cístico - SCN e IPMN) foi usado para a preparação da amostra proteômica.
  2. Remova a cera de parafina do tecido FFPE (desparafinizar) com duas lavagens em xileno com cuidado: uma por 5 min e outra por 2 min.
  3. Reidrate o tecido através de uma lavagem em série com mistura graduada de etanol: 3 min cada em etanol 100%, 85%, 70% e 50%, seguido de um enxágue em água deionizada.
    NOTA: Certifique-se de que o xileno e o etanol sejam manuseados em uma capela de exaustão química.

2. Extração de proteína tecidual FFPE

  1. Prepare uma lâmina de tecido corada com HE ou IHC na qual a ROI seja indicada por patologistas.
  2. Coloque a lâmina de tecido não corado e a lâmina de tecido manchado com as costas voltadas uma para a outra, alinhando-as. Certifique-se de que o ROI seja observado através da lâmina de vidro.
  3. Remova as regiões de tecido sem interesse usando o bisturi.
    NOTA: Se o tecido normal adjacente deve ser analisado, colete-os nos outros tubos.
  4. Raspe as ROIs do tecido para o centro da lâmina usando o bisturi e transfira-as para os tubos limpos de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas.
  5. Adicione 180 μL de tampão de lise de dodecil sulfato de sódio (SDS) (5% SDS, 2 mM de tris (2-carboxietil)fosfina) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl em água deionizada) a cada tubo.
    NOTA: Certifique-se de que o volume do tampão de lise seja suficiente para solubilizar o tecido durante a sonicação e suspender as proteínas extraídas. O tampão insuficiente pode levar à lise tecidual incompleta, enquanto o tampão excessivo pode diluir o lisado de proteína.
  6. Realize a sonicação da sonda a uma amplitude de 20%, aplicando 10 ciclos de 5 s ligado e 5 s desligado.
  7. Incubar as amostras a 100 °C durante 3,5 h com 1.000 x g.
    NOTA: Realize a sonicação com água das amostras por 1 minuto a cada hora durante a incubação para uma extração eficiente de proteínas.
  8. Após a incubação, resfrie a amostra em temperatura ambiente (RT) por 10 min. Centrifugue as amostras a 16.000 x g por 10 min em RT para separar os detritos teciduais do sobrenadante.
  9. Recolher o sobrenadante num tubo limpo e rotulado e conservá-lo a -80 °C até nova utilização.

3. Quantificação de proteínas do lisado tecidual FFPE

NOTA: A maioria das etapas do ensaio de ácido bicinconínico para quantificação de proteínas é baseada nas instruções do fabricante com pequenas modificações. Recomenda-se que os reagentes sejam preparados de acordo com as diretrizes do fabricante.

  1. Preparar padrões de albumina sérica bovina (BSA) de concentração variável, diluindo em série a solução-mãe (2 mg/ml de BSA). Se necessário, diluir as amostras com um factor de diluição de 20 ou 40.
  2. Preparar a água desionizada como branco e o tampão de lise SDS como controlo de amostras.
  3. Pipete 9 μL de padrões, branco, controle de amostra e amostras para o centro do poço da microplaca.
  4. Adicione 4 μL de solução reagente de compatibilidade à amostra em cada poço.
  5. Tampe o prato e misture em uma coqueteleira em velocidade média por 1 min. Depois disso, incube a placa a 37 °C por 15 min.
  6. Adicione 260 μL do reagente de trabalho BCA a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 °C por 30 min.
  7. Resfrie o prato em RT por 3 min.
  8. Meça a absorvância dos poços a 562 nm em um leitor de placas.
  9. Subtrair o valor de absorvância de 562 nm do ensaio em branco do valor de todas as amostras e controlo da amostra.
  10. Além disso, subtraia o valor de absorbância de 562 nm do controle de amostra subtraído em branco de todas as amostras.
  11. Plotar e utilizar a curva padrão para determinar a concentração de proteínas de cada amostra.
    NOTA: Certifique-se de que os 200-250 μg estimados de proteínas sejam extraídos de três lâminas de vidro de tecidos FFPE, cada uma com uma área aproximada de 1 cm2.

4. Precipitação de proteína com acetona

NOTA: Certifique-se de que um total de 100-300 μg de proteína seja usado para precipitação de acetona e digestão de proteínas baseada em aprisionamento de suspensão.

  1. Colocar a amostra de proteína (correspondente a 100-300 μg) num tubo compatível com acetona.
  2. Adicione acetona a -20 °C em um volume cinco vezes maior que o volume da amostra ao tubo.
  3. Incubar a mistura a -20 °C durante 18 h.
  4. Centrifugue o tubo a 16.000 x g por 15 min.
  5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de proteína.
  6. Adicione 500 μL de acetona a -20 °C e repita as etapas 4.4-4.5.
  7. Seque a amostra ao ar.

5. Digestão de proteínas baseada em armadilhas de suspensão

NOTA: O procedimento de digestão de proteínas baseado em filtro de retenção de suspensão foi adaptado das instruções do fabricante com pequenas modificações.

  1. Preparar tampão de lise de retenção em suspensão (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB em água desionizada).
  2. Adicione 40 μL do tampão ao tubo de amostra e vortex completamente para dissolver o pellet de proteína seco ao ar.
  3. Incubar a amostra a 100 °C com agitação a 1.000 x g durante 35 min.
  4. Adicionar 10 μL do reagente alquilante (100 mM de cloroacetamida [CAA] em 100 mM pH 8,5 brometo de tetraetilamónio [TEAB]) à amostra.
  5. Incubar em RT com agitação a 300 x g por 1 h.
  6. Prepare um acidificante (ácido trifluoroacético [TFA] a 10% em água deionizada) com cuidado. Certifique-se de que o TFA, um ácido forte, seja manuseado em uma capela química.
  7. Adicione 5 μL de acidificante à amostra para obter uma concentração final de 1% de TFA (volume final da amostra: 55 μL).
  8. Verifique o pH da amostra usando papel de pH. Certifique-se de que o pH seja inferior a 1.
  9. Adicione 350 μL de tampão de ligação/lavagem-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB em 90% MeOH) à amostra para reter proteínas.
    NOTA: Evite vórtices e centrifugação durante o aprisionamento de proteínas (etapa 5.9) para evitar a perda de amostras. Quantidades suficientes de proteína garantem a formação de partículas de proteína coloidal visíveis com aparência translúcida.
  10. Coloque a coluna de retenção em suspensão em um tubo de 2 mL e transfira toda a amostra, incluindo qualquer material insolúvel, para a coluna de retenção em suspensão.
  11. Centrifugue a coluna a 4.000 x g por 50 s para reter proteínas.
    NOTA: Certifique-se de que toda a amostra passe pela coluna; caso contrário, repita a centrifugação até completar a filtração.
  12. Adicionar 400 μL do tampão de lavagem-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) à coluna, centrifugar a 4000 x g durante 50 s e rejeitar o escoamento.
  13. Repita a etapa 5.12 três vezes.
  14. Adicione 400 μL do tampão-1, centrifugue a 4000 x g por 50 s e descarte o fluxo.
  15. Repita a etapa 5.14 três vezes.
  16. Centrifugue a 4000 x g por 1,25 min para garantir a passagem completa do tampão-1.
  17. Transferir a coluna de aprisionamento em suspensão para um novo tubo de amostra para digestão enzimática.
  18. Adicione 125 μL de tampão de digestão (0,16 μg/μL de tripsina/Lys-C em 50 mM pH 8,5 TEAB) à coluna de retenção de suspensão e tampe para evitar a evaporação.
    NOTA: A relação tripsina / Lys-C deve ser de 1:10 (peso / peso). Garanta um mínimo de 10 μg de tripsina/Lys-C para uma digestão eficaz.
  19. Incubar a 37 °C durante 18 h sem agitar.
  20. Prepare os seguintes tampões de eluição: tampão-1 (50 mM pH 8,5 TEAB em água deionizada), tampão-2 (0,2% FA em água deionizada) e tampão-3 (50% de acetonitrila [ACN] em água deionizada).
  21. Adicione 80 μL de tampão de eluição-1 à coluna de retenção em suspensão e centrifugue a 4000 x g por 1,25 min.
  22. Repita a etapa 5.20 com 80 μL de tampão de eluição-2 e tampão-3.
  23. Colete peptídeos eluídos e transfira-os para um tubo novo e limpo.

6. Quantificação de peptídeos

NOTA: A maioria das etapas do ensaio quantitativo de peptídeo colorimétrico é adaptada das instruções do fabricante com pequenas modificações. Recomenda-se que os reagentes sejam preparados de acordo com as diretrizes do fabricante.

  1. Preparar uma série de padrões diluindo em série a solução-mãe do padrão (1 mg/ml). Se necessário, diluir as amostras utilizando um factor de diluição de 4 ou 5.
  2. Prepare a água deionizada como o branco e uma mistura de eluição buffer-1, buffer-2 e buffer-3 em proporções iguais como controle de amostra.
  3. Coloque 20 μL de padrões, branco, controle de amostra e amostras no centro de cada poço de microplaca.
  4. Adicione 180 μL do reagente de trabalho a cada poço e misture bem a placa em um agitador de placas por 1 min.
  5. Cubra a placa e incube-a a 37 °C por 20 min.
  6. Deixe a placa esfriar em RT por 3 min.
  7. Medir a absorvância dos alvéolos a 480 nm utilizando um leitor de placas.
  8. Subtrair o valor de absorvância de 480 nm do ensaio em branco do valor de todas as amostras e do controlo da amostra.
  9. Além disso, subtraia o valor de absorbância de 480 nm do controle de amostra subtraído em branco de todas as amostras.
  10. Plote e use a curva padrão para calcular a concentração de peptídeos para cada amostra.

7. Análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa

  1. Após a quantificação dos peptídeos, liofilizar 20 μg de peptídeos.
  2. Redissolva os peptídeos em 40 μL de tampão aquoso (3% de ACN em água de ácido fórmico [FA] a 0,1%) por 10 min em um banho de sonicação. A concentração peptídica resultante será de 0,5 μg/μL.
  3. Centrifugue a amostra a 16.000 x g por 60 min e transfira as amostras para frascos para análise de MS.
  4. Injete 2 μL de cada amostra usando o amostrador automático do sistema nano LC-MS/MS.
  5. Separe os peptídeos em uma coluna de fase reversa (coluna de 0,075 mm ID x 150 mm, embalada com material C18 de 3 μm, usando um gradiente de 127 minutos de acetonitrila de 5% a 35% a 100 nL / min. Ionize os peptídeos por meio de uma fonte de íons de nanospray e transfira-os para um espectrômetro de massa baseado em orbitrap.
  6. Analise os peptídeos usando um método de aquisição independente de dados de faixa estreita21.
  7. Aplique a seguinte configuração de parâmetro MS: Faixa MS m/z: 495-745, alvo de resolução: 15000, alvo AGC: 3 x 10E6, tempo máximo de injeção: automático, janela MS/MS: Definido pelo usuário (Supplementary File 1), alvo de resolução: 45000, alvo AGC 3 x 10E6, tempo máximo de injeção: automático, Energia de colisão HCD: 22%, 26%, 30%.
    NOTA: Recomenda-se realizar uma verificação inicial da qualidade do instrumento analisando amostras padrão antes da análise. Use o software de aquisição de dados MS para configurar os parâmetros (consulte a Tabela de Materiais).

8. Análise de dados para pesquisa proteômica

NOTA: Para pesquisa proteômica de dados brutos de MS, ferramentas de código aberto foram usadas para converter o formato de dados LC-MS e realizar pesquisa de proteoma (consulte a Tabela de Materiais). Os parâmetros utilizados para a análise dos dados são detalhados no Arquivo Suplementar 2. Para obter instruções básicas de uso de ferramentas de software livre, consulte o link incluído na Tabela de Materiais.

  1. Converta os arquivos brutos do espectro MS/MS (*.raw) obtidos do LC-MS para o formato *.mzML usando software de código aberto.
  2. Use os arquivos brutos convertidos em formato (*.mzML) como entrada para um mecanismo de pesquisa de código aberto para realizar a pesquisa de proteoma.
  3. Inicie a pesquisa proteômica com base nos parâmetros especificados no Arquivo Suplementar 2.

9. Análise estatística

NOTA: Para análise estatística para identificar proteínas diferencialmente expressas, uma ferramenta de código aberto foi usada para realizar a análise univariada (por exemplo, teste t de Student; consulte a Tabela de Materiais). Recomenda-se consultar as instruções básicas de uso da ferramenta de código aberto por meio do link fornecido na Tabela de Materiais.

  1. Importe a lista de proteínas identificadas (*.txt) para a ferramenta de código aberto.
  2. Categorize as amostras em grupos. Para este estudo, foram designados dois grupos: SCN e IPMN.
  3. Execute a transformação Log2 dos valores de abundância para ajustar a distribuição de dados para aproximar a distribuição normal.
  4. Aplique uma etapa de filtragem para remover proteínas com valores ausentes. Neste estudo, foi necessário um mínimo de dois valores válidos em cada grupo para inclusão.
  5. Impute valores ausentes usando uma abordagem baseada em distribuição normal para gerar uma lista abrangente de proteínas quantificadas para análise univariada subsequente.
  6. Realize um teste t de Student para identificar proteínas diferencialmente expressas entre os dois grupos. Neste estudo, foi aplicada a correção da taxa de descoberta falsa (FDR) de Benjamini-Hochberg.
  7. Extrair as proteínas diferencialmente expressas que satisfaçam os seguintes critérios: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 e |fold- change| ≥ 2.

10. Análise de bioinformática

NOTA: Uma ferramenta comercial de bioinformática foi usada para análise de super-representação (por exemplo, análise da via Ingenuity, consulte a Tabela de Materiais). Antes de usar esta ferramenta, é recomendável consultar as instruções do fabricante.

  1. Importe a lista de DEPs (*.txt) para a ferramenta comercial.
  2. Inicie a análise do núcleo para realizar a análise de super-representação.
  3. Exporte vias canônicas significativas enriquecidas a partir dos DEPs usando o teste exato de Fisher (valor p ajustado < 0,05). Identifique caminhos de interesse que sejam relevantes para a pesquisa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A preparação de amostras proteômicas baseadas em filtro de aprisionamento de suspensão estabelecida, combinada com quantificação sem marcação usando aquisição independente de dados de disparo único, foi aplicada a tecidos FFPE císticos pancreáticos (Figura 1). O isolamento preciso da ROI durante o processamento do tecido FFPE foi obtido em diferentes tecidos císticos pancreáticos FFPE (Figura 2A), resultando na aquisição de cromatogramas de íons totais reprodutí...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método proteômico rápido e eficiente que utiliza ROIs isolados de seções de tecido FFPE montadas em lâminas de vidro para diagnóstico patológico. Quando a intervenção cirúrgica é vantajosa, as neoplasias sólidas, como cânceres e cistos, são ressecadas cirurgicamente e preservadas para avaliação patológica. Para armazenamento de longo prazo, os tecidos são fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE). Os blocos de tecido FFPE são então seccionados com uma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflito de interesse a declarar

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todas as figuras neste artigo foram criadas com BioRender (http://www.biorender.com). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) (Grant No. RS-2023-00253403 e RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1% FA em ACN (grau LC-MS)Fisher ChemicalLS120-212
0,1% FA em água (grau LC-MS)Fisher ChemicalLS118-4
0,5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8,5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8,5)Centrífuga BIOSOLUTIONBTO21
A-14CSatorious167709
Acetona (grau HPLC)Fisher ScientificA949-4
ACN (grau HPLC)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (grau HPLC)Thermo Scientific022920.k2
papel CRADVANTEC70406001
DIA-NN versão 1.9 Código aberto https://github.com/vdemichev/DiaNNMotor de Busca de Proteômica
Leitor de microplacas EPOCH2Agilent 
EtanolMERCKK50505283 836
FA (grau LC-MS)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Ferramenta de bioinformática
Liofilizador (armadilha SRF110R+vaper)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (grau HPLC)MERCKUN1230
Kit de ensaio de proteína BCA Microplate compatívelThermo Scientific23252
MSConvert Código aberto http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlsoftware de transformação de dados MS
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 coluna de separação Thermo ScientificES903
PerseusFerramenta estatística de códigoaberto
PIERCE cloroacetamida Formato sem pesoThermo ScientificA39270
PIERCE Peptídeo colorimétrico quantitativo EnsaioThermo Scientific23275
Agitador de placas Sonda Sonda SSerikerVS-202D
VibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µ Ponta de pipeta L ThermoScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µ Ponta de pipeta L ThermoScientificTLR106RS-Q
BisturiBard-Parker372615
S-Trap: Preparação Rápida Universal de Amostras MSPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Frasco 0,2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Tripsina / Lys-C (grau LC-MS)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249
LC Water (grau HPLC)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS software de aquisição de dados
XyleneSigma-Aldrich102033629
2106208 com https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlVerde

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles