É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

1.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/68081

⸱

6 de junho de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo que facilita a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em astrócitos funcionais específicos do prosencéfalo. Isso permite investigações sobre o papel das células gliais na patogênese de distúrbios do neurodesenvolvimento, como a Síndrome do X Frágil, e modelagem de outros distúrbios cerebrais.

Resumo

A síndrome do X frágil (SXF), uma das principais causas hereditárias de transtorno do espectro do autismo e deficiência intelectual, foi estudada extensivamente usando modelos de roedores. Mais recentemente, sistemas modelo derivados de células-tronco humanas também foram usados para obter insights mecanicistas sobre a fisiopatologia do FXS. No entanto, esses estudos se concentraram quase exclusivamente nos neurônios. Além disso, apesar das evidências crescentes de um papel fundamental da glia na função neuronal na saúde e na doença, pouco se sabe sobre como os astrócitos humanos são afetados pela SXF.

Portanto, neste estudo, desenvolvemos com sucesso um protocolo que captura os principais marcos espaço-temporais do desenvolvimento do cérebro e também se alinha com o processo de gliogênese. Juntos, isso oferece uma estrutura útil para estudar distúrbios do neurodesenvolvimento. Primeiro, padronizamos as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos na linhagem neuroectodérmica com supressor duplo de mães contra a inibição decapentaplégica (SMAD) e pequenas moléculas. Posteriormente, utilizamos fatores de crescimento específicos e citocinas para gerar células progenitoras astrocíticas derivadas de pacientes (APCs) de controle (CTRL) e FXS. O tratamento de APCs com fator neurotrófico ciliar, uma citocina diferenciadora, regulou e levou as células progenitoras à maturação astrocítica, produzindo astrócitos que expressam proteínas ácidas fibrilares gliais específicas do prosencéfalo.

Descobrimos que esses astrócitos são funcionais, como evidenciado por suas respostas de cálcio à aplicação de ATP, e exibem metabolismo glicolítico e mitocondrial desregulado em FXS. Em conjunto, essas descobertas fornecem uma plataforma experimental útil de origem humana para a investigação de consequências autônomas e não autônomas de células de alterações na função astrocítica causadas por distúrbios do neurodesenvolvimento.

Introdução

A Síndrome do X Frágil (FXS), uma forma hereditária comum de deficiência intelectual e transtorno do espectro do autismo (TEA), é causada pela falta de ribonucleoproteína mensageira do X frágil (FMRP) produzida pelo gene da ribonucleoproteína 1 do mensageiro do X frágil (FMR1) (OMIM: # 300624, https://www.omim.org/entry/300624). O FMRP desempenha um papel na regulação da tradução de mRNA, formação e transporte de grânulos de mRNA e regulação mediada por microRNA da expressão gênica1. Assim, a perda de FMRP afeta não apenas o desenvolvimento do cérebro, mas também a função cerebral adulta. Tanto os níveis de transcrição de mRNA de FMR1 quanto a imunocoloração para FMRP no cérebro mostraram alta expressão neuronal, juntamente com expressão significativa também em células gliais2. No entanto, a grande maioria dos estudos anteriores em modelos animais de FXS se concentrou principalmente em neurônios e aberrações em sua função. Consequentemente, pouco se sabe sobre o papel da glia no FXS3. Tradicionalmente consideradas células de "suporte passivo"4, há evidências acumuladas de que os astrócitos são críticos na mediação de uma ampla gama de funções neuronais 5,6, incluindo a promoção da sinaptogênese7, refinamento do desenvolvimento de circuitos neurais8 e reciclagem de neurotransmissores9. Paralelamente, há evidências crescentes do papel dos astrócitos na patogênese da doença e muitas condições neurológicas têm sido associadas à disfunção astrocítica10.

Embora grande parte do trabalho anterior usando modelos animais de FXS tenha se concentrado na identificação e validação de vários alvos moleculares em neurônios para o tratamento de FXS, esses achados pré-clínicos nem sempre levaram a resultados clínicos bem-sucedidos. Além disso, contratempos em ensaios clínicos recentes também ressaltam a necessidade de sistemas de modelos baseados em humanos. Modelos de distúrbios neurológicos baseados em células-tronco cerebrais derivadas de células-tronco humanas oferecem uma estratégia poderosa para preencher essa lacuna entre insights mecanicistas de estudos com animais e sucesso limitado com resultados clínicos para os pacientes. No entanto, apenas um punhado desses estudos se concentrou em astrócitos e também principalmente em astrócitos de origem espinhal. Isso, por sua vez, é relevante à luz de estudos que mostram que a estrutura e a função dos astrócitos variam entre as regiões do cérebro11,12. Assim, uma melhor compreensão das alterações induzidas por doenças em astrócitos humanos também precisa levar em consideração essas diferenças específicas da região cerebral nos astrócitos. No entanto, modelos de distúrbios do neurodesenvolvimento usando astrócitos derivados de células-tronco humanas que são específicos para o prosencéfalo permanecem comparativamente pouco explorados13. Portanto, para começar a abordar essas lacunas, descrevemos protocolos para gerar astrócitos específicos do prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de pacientes (iPSCs) portadoras de mutações FXS; Além disso, mostramos que os astrócitos são funcionais e exibem metabolismo alterado.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) (Tabela 1) foram realizados após a obtenção das aprovações regulatórias institucionais apropriadas. A Figura 1A representa o protocolo completo de diferenciação de hiPSCs para astrócitos específicos do prosencéfalo maduro.

1. Manutenção e expansão de hiPSCs

  1. Um dia antes de plaquear os iPSCs, cubra um prato de 6 poços com Matrigel diluído 1:60 (uma matriz extracelular [ECM]) em Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) e armazene a 2-8 ° C.
    NOTA: Evite armazenar pratos revestidos com Matrigel por >5 dias a 2-8 °C, pois isso pode causar degradação de proteínas na ECM ao longo do tempo. Para evitar o ressecamento do prato, cubra um mínimo de 1 mL de Matrigel diluído 1:60 por um poço de um prato de 6 poços e espalhe uniformemente pelo prato. Se utilizar no mesmo dia, mantenha a placa numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO2 durante 1 h.
  2. No dia da cultura dos hiPSCs, remova o material de revestimento e adicione 1 mL de meio Essential 8 completo (meio basal E8 com suplemento Essential 8) junto com o inibidor de ROCK na concentração final de 1x e mantenha o prato em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO2 antes de adicionar os hiPSCs.
  3. Ressuspenda os hiPSCs em meio E8 completo junto com o inibidor de ROCK na concentração final de 1x para melhor aderência das colônias.
    NOTA: Não prepare grandes quantidades de meio de cultura. Preparar apenas durante 3-4 dias no máximo e conservar a 2-8 °C.
  4. No dia seguinte, reabasteça o meio E8 completo sem o inibidor de ROCK até que as células estejam 80% confluentes (aproximadamente 4-5 dias).
  5. Quando atingirem 80% de confluência, destacar as colônias enzimaticamente.
    1. Para passar as iPSCs, remova o meio gasto do prato e adicione 1 mL por poço de mistura pré-aquecida (37 ° C) de colagenase (2 mg / mL) e dispase (1 mg / mL) em uma proporção de 1: 1 e incube a 37 ° C por mais de 20-30 min para permitir que as colônias de iPSC se levantem.
      NOTA: Não deixe a loiça a 37 °C durante mais de 20-30 min; Além desse período, as colônias se desintegrarão e as células morrerão.
  6. Quando as colônias começarem a se levantar, retire os pratos da incubadora e neutralize a atividade enzimática adicionando 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  7. Raspar as colônias com DPBS e coletar a suspensão em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL de diâmetro largo.
  8. Triture suavemente a suspensão 2-3x para quebrar as colônias usando uma pipeta sorológica de 10 mL e permita que as colônias se estabeleçam.
    NOTA: Não transforme as colônias em células únicas; Isso pode fazer com que as células não adiram ao prato e causar mais morte celular. Além disso, não os deixe como grandes colônias; Isso levará a colônias mais diferenciadas posteriormente.
  9. Assim que as colônias se estabelecerem (aproximadamente após 2 min), aspire a mistura enzimática DPBS deixando aproximadamente 1 mL no tubo.
  10. Adicione 2 mL de DPBS ao tubo, misture as colônias batendo e deixe-as assentar. Repita isso 2x para remover toda a enzima residual das colônias. Remova o máximo de sobrenadante possível após a2ª lavagem, ressuspenda as colônias em 1 mL de meio E8 completo e coloque um prato preparado na hora, conforme mencionado nas etapas 1.2-1.3.
  11. Alternativamente, criopreserve uma proporção de colônias usando 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como solução crioprotetora para expansão e uso futuros.
    1. Prepare o meio de criopreservação na hora misturando 90% de meio E8 completo e 10% de DMSO como solução crioprotetora e coloque-o a 2-8 °C até o uso.
  12. Para crioreservar, siga as etapas 1.5-1.10.
  13. Durante a etapa 1.10, após a2ª lavagem, deixe as colônias assentarem e remova o sobrenadante. Às colônias, adicione 1 mL de meio de criopreservação a frio recém-preparado e transfira para criogeniais.
    NOTA: Depois de adicionar o meio de criopreservação às colônias, transfira rapidamente o conteúdo para criogeniais. O atraso pode resultar em uma taxa de renascimento mais baixa, pois o DMSO é um crioprotetor que pode danificar as células.
  14. Mova imediatamente os criotubos para uma caixa criogênica e mantenha em um freezer a -80 ° C durante a noite.
  15. No dia seguinte, mude todos os criogenianos para um tanque de nitrogênio líquido (tanque LN2 ) para uso futuro.
    NOTA: hiPSCs devem ser rotineiramente cariotipados usando bandas G (Figura Suplementar S1) para quaisquer anormalidades, caracterizados usando imunocitoquímica para pluripotência (Figura 1B) e testados para micoplasma.
    1. Para caracterizar hiPSCs usando imunocitoquímica, coloque as colônias em lamínulas de vidro de 13 mm revestidas com Matrigel 1:60 e autoclavadas. Quando estiverem 40% confluentes, lave as células com PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), fixe com paraformaldeído a 4% por 10 min, permeabilize com Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min e bloqueie com albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS por 1 h para evitar ligação inespecífica.
    2. Após o bloqueio, incubar as culturas com anticorpos primários por 1 h e depois lavar 3x com PBS-T por 5 min cada, seguido de anticorpos secundários correspondentes (Tabela de Materiais) no escuro por 1 h.
    3. Monte as lamínulas em lâminas de vidro com meio de montagem e adquira imagens por varredura a laser confocal a 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm. Capture imagens em 512 x 512 pixels; defina o tamanho do passo Z em 0,5 μm com 1 unidade arejada de diâmetro do orifício.

2. Geração e caracterização de células progenitoras astrocíticas (APCs)

  1. Levante enzimaticamente os hiPSCs conforme mencionado nas etapas 1.5-1.10 e coloque-os em uma placa de cultura em suspensão não aderente (100 mm) com meio quimicamente definido14 contendo 50% de meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 50% de mistura de nutrientes F-12 de Ham (F12), 5 mg / mL de BSA, 1% de concentrado lipídico quimicamente definido (CD-Lipid), 450 μM de monotioglicerol, 7 μg / mL de insulina, 15 μg / mL de transferrina, 1% de penicilina-estreptomicina suplementada com mitógenos de padronização do prosencéfalo N-acetilcisteína (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) e SB431542 (10 μM) por 7 dias.
    NOTA: Os inibidores de moléculas pequenas SB431542 e LDN-193189 (LDN) são inibidores da proteína morfogenética óssea e das vias de sinalização do fator de crescimento transformador beta.
    A partir deste ponto, o meio foi reabastecido uma vez a cada 2 dias ou seguindo o protocolo de segunda/quarta/sexta-feira.
  2. Colocar a suspensão celular num agitador orbital a 40 rpm durante 7 dias em condições normóxicas para facilitar o desenvolvimento das corticosferas (figura 1A).
  3. No dia 8, transfira as corticosferas para um meio de proliferação celular contendo DMEM/F12 avançado com 1% de antibiótico-antimicótico, 1% de suplemento de N2, 1% de substituto de glutamina, 0,1% de suplemento de B27 e 2,5 ng/mL de fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) por 7 dias.
  4. Induza as esferas para especificação glial, submetendo-as a meio de enriquecimento glial contendo DMEM / F12 avançado com 1% de antibiótico-antimicótico, 1% de N2, 1% de substituto de glutamina, 0,1% de suplemento de B27, 20 ng / mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), bFGF-H (20 ng / mL de bFGF-5 mg / mL de heparina) por 2 semanas para obter gliosferas precoces ( Figura 1A ).
  5. Para a maturação das gliosferas iniciais, substitua o bFGF-H por 20 ng/mL de fator inibidor da leucemia (LIF) e mantenha as esferas por 4 semanas.
  6. Após 4 semanas no meio de maturação, manter as esferas em meio de enriquecimento glial por períodos prolongados. Para evitar agregação e perda de viabilidade, a cada 2 semanas, pique mecanicamente as gliosferas usando uma lâmina industrial estéril e substitua todo o meio por DNase I para remover fragmentos de DNA gerados pelo corte.
  7. Dissocie as gliosferas em monocamadas de APCs usando um kit de dissociação de papaína e coloque em uma placa aderente tratada com cultura de células com diluição de 1:80 de revestimento de Matrigel.
  8. Propague os APCs em meio de enriquecimento glial até 80% confluente e passe-os enzimaticamente usando o meio de descolamento de células enzimáticas (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Para a passagem:
    1. Remova a mídia gasta e colete em um tubo cônico. Às células, adicione o meio de desprendimento de células enzimáticas e aguarde 1-2 min. Assim que as células começarem a se desprender, adicione o meio gasto para neutralizar a atividade enzimática.
    2. Recolher a suspensão celular e centrifugar a 800 x ɡ durante 2 min.
    3. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as células em meio de enriquecimento glial e coloque aproximadamente 1 x 106 células / poço em um prato de 6 poços revestido com Matrigel 1:80.
  10. Para criopreservação:
    1. Ressuspenda as células em uma mistura fria de 90% de meio de proliferação da corticosfera (sem bFGF) e 10% de crioprotetor. Transfira as células ressuspensas para criogeniais.
    2. Mova imediatamente os criotubos para uma caixa criogênica e mantenha no freezer a -80 ° C durante a noite.
    3. No dia seguinte, mude todos os criogenianos para um tanque de nitrogênio líquido (tanque LN2 ) para uso futuro.
      NOTA: Os APCs foram criopreservados com DMSO a 10% até a passagem número 6.
  11. Caracterize os APCs dissociados por imunocoloração (conforme mencionado nas etapas 1.15.1-1.15.3) com marcadores de vimentina e fator nuclear IA (NFIA) (Figura 1C, D) (consulte a Tabela de Materiais para diluições).
  12. Para confirmar a especificidade regional do prosencéfalo das APCs derivadas de hiPSC, teste as células para um marcador do prosencéfalo, como a caixa de garfo humano G1 (hFOXG1) (positivo) e o marcador do rombencéfalo, como o Homeobox B4 humano (hHOXB4) (negativo) usando qPCR em tempo real ( Figura 1E , F ).
    NOTA: As sequências de primers usadas para esses experimentos foram listadas na Tabela Suplementar S1.

3. Geração e caracterização de uma população homogênea de astrócitos específicos do prosencéfalo

  1. Diferenciação de astrócitos de APCs
    1. Use o meio de diferenciação astrocítica (ADM) por 14 dias para diferenciar APCs em astrócitos. O meio de diferenciação astrocítica contém neurobasal, 1% antibiótico-antimicótico, 1% substituto da glutamina, 1% suplemento de N2, 0,2% suplemento de B27, 1% de meio de aminoácidos não essenciais (NEAA) e 10 ng/mL de fator neurotrófico ciliar (CNTF).
    2. Confirme a identidade astrocítica usando imunocoloração (conforme mencionado nas etapas 1.15.1-1.15.3.) com proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e marcadores de expressão S100β (Figura 2A, B).
  2. Síntese proteica de novo em APCs e astrócitos
    1. Mantenha APCs e astrócitos do prosencéfalo derivados de hiPSC em lamínulas de vidro estéreis autoclavadas de 13 mm e imunocore-os conforme mencionado nas etapas 1.15.1-1.15.3.
    2. Para a síntese de proteínas de novo , use o método de marcação de aminoácidos fluorescente não canônico (FUNCAT), explicado brevemente nas etapas 3.2.3-3.2.6 (Figura 3A).
    3. Para garantir a deficiência de metionina, remova o meio de crescimento das culturas e substitua por meio livre de metionina e cisteína misturado com 1 mM de L-azidohomoalanina (AHA) por 30 min a 37 ° C e 5% de CO2.
    4. Lave as culturas com PBS-T, fixe com paraformaldeído a 4% por 10 min, permeabilize com Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min e bloqueie com BSA a 3% em PBS por 1 h para evitar ligação inespecífica.
    5. Incube as culturas no escuro por 1 h em temperatura ambiente com a mistura de reação química de células Click e Alkyne Alexa Fluor 647, seguida por anticorpos primários por 1 h e anticorpos secundários correspondentes (Tabela de Materiais) por 1 h (Figura 3B).
    6. Monte as lamínulas em lâminas de vidro com meio de montagem e use-as para análise de imagem posterior.
      1. Adquira imagens por varredura a laser confocal em 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm.
      2. Capture imagens em 512 x 512 pixels; defina o tamanho do passo Z em 0,5 μm com 1 unidade arejada de diâmetro do orifício.
      3. Mantenha os parâmetros de microscopia e imagem em uma configuração constante em todos os tipos de células. Capture imagens para cada réplica biológica na mesma sessão.
      4. Realize medições de intensidade usando qualquer software de análise de imagem padrão (por exemplo, Fiji ou Imaris). Em Imaris, use o módulo SURFACES para produzir medições volumétricas de corpos celulares positivos para sinal de marcação de aminoácidos fluorescente não canônico (FUNCAT) com Vimentina (APCs) e GFAP (astrócitos) limitando a faixa de voxel (250-350) para remover detritos.
        NOTA: Mantenha os parâmetros em todas as réplicas biológicas para ambos os tipos de células.
  3. Ondas de cálcio oscilatórias induzidas por adenosina 5′-trifosfato (ATP)
    1. Colocar astrócitos em uma placa com fundo de vidro (35 mm) a 5 × 103 células/placa para medir a resposta celular ao ATP.
    2. Deixe as células aderirem ao fundo de vidro por 24 h, lave-as 3x com HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) sem cálcio e incube em meio de cultura com corante métrico de proporção 5 μM Fura-2AM e 0,02% Pluronics F127 por 1 h em temperatura ambiente.
      NOTA: Fura-2AM é um produto químico sensível à luz e à temperatura; armazenar a -20 °C.
    3. Após a incubação, lave 2x com meio de cultura e substitua por 2 mM Ca2+ contendo HBSS e obtenha imagens das células na velocidade de 2 FPS usando uma objetiva de óleo de 60x (1,35 NA) em um microscópio invertido com compensação de desvio de foco.
    4. Registre as respostas de cálcio induzidas por ATP pela aplicação de ATP em banho na concentração final de 5 mM aos 25anos (Figura 4A).
    5. Desenhe regiões de interesse ao redor de cada célula usando Fiji / ImageJ e calcule a proporção F340 / F380 em todos os pontos de tempo (Figura 4B).
  4. Ensaios metabólicos celulares
    NOTA: A taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) das células vivas foram medidas de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Um dia antes do ensaio, permitir que os astrócitos adiram à microplaca (densidade de semeadura de 1,5 ×10 4 ) em meio CNTF e incubar a 37 °C com 5% de CO2.
    2. Para o ensaio de estresse de glicólise:
      1. Substituir o meio de cultura celular por meio de base suplementado com 2 mM de glutamina (pH ajustado para 7,4) e incubar numa câmara não-CO2 a 37 °C durante 1 h.
        NOTA: O pH deve ser ajustado em banho-maria a 37 °C.
      2. Insira a placa do cartucho no instrumento para calibrar o sensor. Após a calibração, substitua a placa do cartucho pela placa de cultura de células na concentração final dos seguintes componentes do kit: 10 mM de glicose, 1 μM de oligomicina e 50 mM de 2-desoxi-glicose (2-DG) (Figura 5A).
      3. No final do teste, lisar as células e estimar o teor total de proteínas.
    3. Para o ensaio de tensão mitocondrial:
      1. Substituir o meio CNTF por meio de base suplementado com 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato, 10 mM de glicose (pH ajustado para 7,4) em banho-maria a 37 °C.
      2. Incubar a placa numa câmara não-CO2 a 37 °C durante 1 h. Enquanto isso, insira a placa do cartucho no instrumento para calibrar o sensor.
      3. Após a calibração, substitua a placa do cartucho pela placa de cultura de células com uma concentração final dos seguintes componentes do kit: 1,5 μM de oligomicina, 1 μM de carbonilcianeto-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) e 0,5 μM de rotenona/antimicina A (Figura 5C).
      4. No final do teste, lisar as células e estimar o teor total de proteínas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

As colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) foram mantidas usando meio definido comercialmente disponível e imunomarcado para marcadores de pluripotência, Oct4 e Nanog (Figura 1B). FXS e CTRL APCs mostraram proporções comparáveis altamente enriquecidas de células imunopositivas para vimentina e NFIA ( Figura 1C , D ). Descobrimos que as APCs derivadas de hiPSCs saudáveis e FXS mostra...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, descrevemos um método para gerar astrócitos humanos derivados de iPSC que servem como uma plataforma de ensaio para caracterizar alterações funcionais induzidas por FXS. Esses astrócitos são funcionalmente viáveis em cultura e exibem várias propriedades, como evidenciado por uma série de medições realizadas no presente estudo. Uma etapa crítica neste protocolo é a conversão inicial de iPSCs em corticosferas usando o método de levantamento enzimático. Nesta fase, otimizar o tempo de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Sumantra Chattarji pelos fundos internos. Agradecemos ao Prof. Gaiti Hasan pelo acesso à configuração de imagem de cálcio, ao Centro Central de Imagens e Fluxo do Centro Nacional de Ciências Biológicas, a Padmanabh Singh e Prangya Hota pela revisão e sugestões, e à equipe do Labmate Asia por sua assistência na realização de ensaios Seahorse XF.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-TioglicerolSigma-AldrichM6145
Accutase  soluçãoSigma-AldrichA6964Meio de desprendimento de células enzimáticas
Adenosina 5′-trifosfato sal de magnésioSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antibiótico-Antimicótico (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Suplemento (50x), sem soroThermoFisher Scientific17504044
Albuminade soro bovinoSigma-AldrichA9418
Concentrado lipídico quimicamente definidoThermoFisher Scientific11905031
colagenase, tipo IV, póThermoFisher Scientific17104019
desoxirribonuclease IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD2650
Dispase II, póThermoFisher Scientific17105041
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MédioThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Instituto Coriell de Pesquisa Médica GM07072, célulasde pacientes GM05848 FXS
Suplemento GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061substituto de glutamina
Nutrientes F-12 da Ham'sThermoFisher Scientific11765054
Células de controle saudáveis Centro Médico Cedars-SinaiND30625células de controle saudáveis 
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suínaSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulina, Roche 11376497001
193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Fator Inibidor de Leucemia humanoSigma-AldrichL5283
Matrigel  Matriz de Membrana Poral Reduzida por Fator de Crescimento (TFG)Corning354230
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2/bFGF) Proteína RecombinantePeprotech450-33
Mr. Recipiente de congelamento geladoThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Suplemento (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-acetil-L-cisteínaSigma-AldrichA9165
Meio NeurobasalThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanking e Tubos Criogênicos de Cultura de CélulasThermoFisher Scientific377267
Nunc Célula Tratada com Cultura de Células Prato de 6 poçosThermoFisher Scientific140675
Sistema de Dissociação de PapaínaWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicilina-EstreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
Proteína CNTF Humana Recombinante, CF R& D Systems257-NT-010
Proteína EGF Humana Recombinante, CFR& Suplemento RevitaCell236-EG-01M
Systems (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Kit
Teste de Estresse de Glicólise Seahorse XF103015-100
LâminasVWR International55411-050
Anticorpos 
Anticorpo primárioCompanyNúmero de catálogo<strong>Diluição
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Diluição: 1:250
Anticorpo secundário: IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Diluição: 1:100
Anticorpo secundário: IgG anti-cabra de burro, Alexa Fluor 488
VimentinaAbcamAb5733Diluição: 1:500
Anticorpo secundário: IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Diluição: 1:500
Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Diluição: 1:500
Anticorpo secundário: NA
GFAPDAKOZ0334Diluição: 1:500
Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Diluição: 1:500
Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Anticorpo anti-núcleos Alexa Fluor 488
, clone 235-1Merck MilliporeMAB1281Diluição: 1:1000
Anticorpo secundário: IgG1 anti-rato de cabra, Alexa Fluor 555
Anticorpos secundários  Dilution
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
IgG anti-Cabra para burros, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
IgY anti-frango para cabras, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Cabra anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000
Mistura de LDN humanoda D de Teste de Estresse Mito de Célula XF Seahorse da Agilent Technologies Kit de da Agilent Technologies Placas de Cultura de Tecidos Agilent Technologies 103020-100 cm Transferrin Roche 10652202001 VWR Transferrin da Biostar Life TCD000100 tech

Referências

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Síndrome do X FrágilCélulas-Tronco Pluripotentes InduzidasCélulas Progenitoras de AstrócitosDiferenciação de AstrócitosMeio de Enriquecimento GlialImagem de CálcioMetabolismo GlicolíticoRespiração MitocondrialMarcadores de ImunoestocagemTranstornos do Neurodesenvolvimento
Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.