Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

Summary

Aqui descrevemos um protocolo que facilita a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em astrócitos funcionais específicos do prosencéfalo. Isso permite investigações sobre o papel das células gliais na patogênese de distúrbios do neurodesenvolvimento, como a Síndrome do X Frágil, e modelagem de outros distúrbios cerebrais.

Abstract

A síndrome do X frágil (SXF), uma das principais causas hereditárias de transtorno do espectro do autismo e deficiência intelectual, foi estudada extensivamente usando modelos de roedores. Mais recentemente, sistemas modelo derivados de células-tronco humanas também foram usados para obter insights mecanicistas sobre a fisiopatologia do FXS. No entanto, esses estudos se concentraram quase exclusivamente nos neurônios. Além disso, apesar das evidências crescentes de um papel fundamental da glia na função neuronal na saúde e na doença, pouco se sabe sobre como os astrócitos humanos são afetados pela SXF.

Portanto, neste estudo, desenvolvemos com sucesso um protocolo que captura os principais marcos espaço-temporais do desenvolvimento do cérebro e também se alinha com o processo de gliogênese. Juntos, isso oferece uma estrutura útil para estudar distúrbios do neurodesenvolvimento. Primeiro, padronizamos as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos na linhagem neuroectodérmica com supressor duplo de mães contra a inibição decapentaplégica (SMAD) e pequenas moléculas. Posteriormente, utilizamos fatores de crescimento específicos e citocinas para gerar células progenitoras astrocíticas derivadas de pacientes (APCs) de controle (CTRL) e FXS. O tratamento de APCs com fator neurotrófico ciliar, uma citocina diferenciadora, regulou e levou as células progenitoras à maturação astrocítica, produzindo astrócitos que expressam proteínas ácidas fibrilares gliais específicas do prosencéfalo.

Descobrimos que esses astrócitos são funcionais, como evidenciado por suas respostas de cálcio à aplicação de ATP, e exibem metabolismo glicolítico e mitocondrial desregulado em FXS. Em conjunto, essas descobertas fornecem uma plataforma experimental útil de origem humana para a investigação de consequências autônomas e não autônomas de células de alterações na função astrocítica causadas por distúrbios do neurodesenvolvimento.

Introduction

A Síndrome do X Frágil (FXS), uma forma hereditária comum de deficiência intelectual e transtorno do espectro do autismo (TEA), é causada pela falta de ribonucleoproteína mensageira do X frágil (FMRP) produzida pelo gene da ribonucleoproteína 1 do mensageiro do X frágil (FMR1) (OMIM: # 300624, https://www.omim.org/entry/300624). O FMRP desempenha um papel na regulação da tradução de mRNA, formação e transporte de grânulos de mRNA e regulação mediada por microRNA da expressão gênica¹. Assim, a perda de FMRP afeta não apenas o desenvolvimento do cérebro, mas também a função cerebral adul....

Protocol

Todos os experimentos usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) (Tabela 1) foram realizados após a obtenção das aprovações regulatórias institucionais apropriadas. A Figura 1A representa o protocolo completo de diferenciação de hiPSCs para astrócitos específicos do prosencéfalo maduro.

1. Manutenção e expansão de hiPSCs

1. Um dia antes de plaquear os iPSCs, cubra um prato de 6 poços com Matrigel diluído 1:60 (uma matriz extracelular [ECM]) em Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) e....

Results

As colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) foram mantidas usando meio definido comercialmente disponível e imunomarcado para marcadores de pluripotência, Oct4 e Nanog (Figura 1B). FXS e CTRL APCs mostraram proporções comparáveis altamente enriquecidas de células imunopositivas para vimentina e NFIA ( Figura 1C , D ). Descobrimos que as APCs derivadas de hiPSCs saudáveis e FXS mostra.......

Discussion

Aqui, descrevemos um método para gerar astrócitos humanos derivados de iPSC que servem como uma plataforma de ensaio para caracterizar alterações funcionais induzidas por FXS. Esses astrócitos são funcionalmente viáveis em cultura e exibem várias propriedades, como evidenciado por uma série de medições realizadas no presente estudo. Uma etapa crítica neste protocolo é a conversão inicial de iPSCs em corticosferas usando o método de levantamento enzimático. Nesta fase, otimizar o tempo de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145
Accutase  solução	Sigma-Aldrich	A6964	Meio de desprendimento de células enzimáticas
Adenosina 5′-trifosfato sal de magnésio	Sigma-Aldrich	A9187
Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12634010
Antibiótico-Antimicótico (100x)	ThermoFisher Scientific	15240062
B-27 Suplemento (50x), sem soro	ThermoFisher Scientific	17504044
Albumina	de soro bovinoSigma-Aldrich	A9418
Concentrado lipídico quimicamente definido	ThermoFisher Scientific	11905031
colagenase, tipo IV, pó	ThermoFisher Scientific	17104019
desoxirribonuclease I	Worthington Biochemical Corporation	LK003170
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
Dispase II, pó	ThermoFisher Scientific	17105041
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	ThermoFisher Scientific	14190144
Essential 8 Médio	ThermoFisher Scientific	A1517001
FXS1, FXS2	Instituto Coriell de Pesquisa Médica	GM07072, células	de pacientes GM05848 FXS
Suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	35050061	substituto de glutamina
Nutrientes F-12 da Ham's	ThermoFisher Scientific	11765054
Células de controle saudáveis	Centro Médico Cedars-Sinai	ND30625	células de controle saudáveis
Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína	Sigma-Aldrich	H3149
IMDM	ThermoFisher Scientific	12440053
Insulina, Roche 11376497001
193189	Stratech Scientific	S2618-SEL
Fator Inibidor de Leucemia humano	Sigma-Aldrich	L5283
Matrigel  Matriz de Membrana Poral Reduzida por Fator de Crescimento (TFG)	Corning	354230
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2/bFGF) Proteína Recombinante	Peprotech	450-33
Mr. Recipiente de congelamento gelado	ThermoFisher Scientific	5100-0001	cryobox
N-2 Suplemento (100x)	ThermoFisher Scientific	17502048
N-acetil-L-cisteína	Sigma-Aldrich	A9165
Meio Neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049
Nunc Biobanking e Tubos Criogênicos de Cultura de Células	ThermoFisher Scientific	377267
Nunc Célula Tratada com Cultura de Células Prato de 6 poços	ThermoFisher Scientific	140675
Sistema de Dissociação de Papaína	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
Penicilina-Estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Proteína CNTF Humana Recombinante, CF	R& D Systems	257-NT-010
Proteína EGF Humana Recombinante, CF	R& Suplemento RevitaCell	236-EG-01M
Systems (100x)	ThermoFisher Scientific	A2644501
SB431542	Tocris	1614
Seahorse XFe24 Analyzer	Kit
Teste de Estresse de Glicólise Seahorse XF	103015-100
Lâminas	VWR International	55411-050
Anticorpos
Anticorpo primário	Company	Número de catálogo<	strong>Diluição
Oct4 (C-10)	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	Diluição: 1:250 Anticorpo secundário: IgG anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 568
Nanog	R & D Systems	AF1997	Diluição: 1:100 Anticorpo secundário: IgG anti-cabra de burro, Alexa Fluor 488
Vimentina	Abcam	Ab5733	Diluição: 1:500 Anticorpo secundário: IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 488
NFIA	Abcam	Ab41851	Diluição: 1:500 Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3	Sigma	C9205	Diluição: 1:500 Anticorpo secundário: NA
GFAP	DAKO	Z0334	Diluição: 1:500 Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568
S100β	DAKO	IR504	Diluição: 1:500 Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra, Anticorpo anti-núcleos Alexa Fluor 488
, clone 235-1	Merck Millipore	MAB1281	Diluição: 1:1000 Anticorpo secundário: IgG1 anti-rato de cabra, Alexa Fluor 555
Anticorpos secundários			Dilution
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11004	1:1000
IgG anti-Cabra para burros, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	1:1000
IgY anti-frango para cabras, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11039	1:1000
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11011	1:1000
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11034	1:1000
Cabra anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21127	1:1000