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Detecção e Isolamento de Câncer em Biópsias de Próstata Utilizando Histologia Raman Estimulada e Inteligência Artificial

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DOI:

10.3791/68083

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10 de junho de 2025

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1Genecentrix Inc., 2Vancouver Prostate Center, University of British Columbia, 3Invenio Imaging, 4Dept. of Urology, NYU Langone Health, 5Dept. of Radiology, NYU Langone Health, 6Dept. of Biomedical Engineering, NYU Langone Health, 7Dept. of Urologic Sciences, University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para detecção de câncer de próstata usando histologia Raman estimulada (SRH) em amostras de biópsia devido às vantagens sobre a histopatologia tradicional, com foco na preparação de amostras, imagens e inteligência artificial para melhorar a relação câncer-tecido. Além disso, suporta biobanco para transcriptômica, modelos de organoides ou xenoenxertos e identificação de margens cirúrgicas intraoperatórias.

Resumo

O câncer de próstata continua sendo uma das neoplasias malignas mais prevalentes que afetam os homens em todo o mundo, tornando a detecção precoce e os avanços na medicina de precisão cruciais para uma intervenção e tratamento eficazes. Um protocolo padronizado é apresentado para utilizar histologia Raman estimulada (SRH) com inteligência artificial (IA) integrada na detecção do câncer de próstata, oferecendo avanços significativos em relação aos métodos histopatológicos convencionais. A SRH fornece esses avanços aumentando a eficiência por meio de imagens quase em tempo real e sem rótulos de tecidos frescos e não corados, eliminando assim os atrasos associados à análise de biópsia tradicional.

Usando microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) para detectar as frequências vibracionais específicas das ligações CH2 associadas a lipídios e ligações CH3 ligadas a proteínas e DNA, tecidos cancerígenos e benignos em biópsias de próstata podem ser diferenciados. O modelo de IA aumenta ainda mais a precisão do diagnóstico, alcançando 98,6% de precisão na identificação do câncer de próstata. O protocolo descreve etapas essenciais para preparação de amostras, imagens e análise de dados, facilitando processos aprimorados de biobanco e permitindo aplicações posteriores, como transcriptômica e estudos de xenoenxerto. Essa abordagem acelera o fluxo de trabalho diagnóstico e se mostra promissora para aplicações intraoperatórias, potencialmente ajudando os cirurgiões a identificar margens positivas no intraoperatório. Além disso, a capacidade de reescanear e ajustar as proporções de câncer para tecido permite uma análise mais personalizada de amostras de biópsia, melhorando a detecção de tumores em tecidos não processados. Mais pesquisas e validações são necessárias para a adoção generalizada da SSR na prática clínica.

Introdução

O câncer de próstata continua sendo uma das principais neoplasias malignas que afetam os homens em todo o mundo, sendo a detecção precoce fundamental para uma intervenção e tratamento bem-sucedidos1. Historicamente, o diagnóstico de câncer de próstata tem se baseado fortemente na avaliação histopatológica de amostras de biópsia de próstata, mais comumente por meio da coloração de hematoxilina e eosina (H&E)2. Embora eficazes, os métodos tradicionais de análise de biópsia de próstata geralmente resultam em um período de espera de vários dias a semanas, dependendo da cidade ou país, devido a fatores processuais e logísticos. Esses atrasos surgem de várias etapas trabalhosas, incluindo fixação de formalina, incorporação de parafina, seccionamento e coloração de H&E. Assim, o tempo de processamento cumulativo, agravado pelo alto volume de amostras de biópsia, pode atrasar o diagnóstico e o planejamento do tratamento.

Avanços recentes nas tecnologias de imagem, particularmente estimularam a microscopia de espalhamento Raman (SRS), podem transformar as práticas diagnósticas, fornecendo um método de imagem robusto, sem fundo e facilmente interpretável 3,4. O SRS utiliza dois feixes de laser, o feixe da bomba (ωp) e o feixe de Stokes (ωs), que interagem com a amostra. Quando a diferença de frequência (Δω = ωp −ωs) corresponde a uma frequência vibracional molecular específica (Ω), o sinal é amplificado devido ao ganho ou perda Raman estimulado. Esse processo aumenta o contraste das vibrações moleculares, permitindo imagens altamente sensíveis dos tecidos 3,4. O SRS permite a detecção de vibrações moleculares associadas às vibrações de estiramento do CH2 (2.845 cm-1), correlacionadas com lipídios, e vibrações de estiramento do CH3 (2.930 cm-1), ligadas a proteínas e DNA4. A detecção do sinal SRS normalmente envolve um esquema de transferência de modulação de alta frequência, permitindo o isolamento preciso dos sinais vibracionais fracos do ruído de fundo.

A microscopia SRS possui recursos de seccionamento óptico que permitem imagens tridimensionais precisas sem a necessidade de seccionamento físico do tecido. Isso é obtido alinhando e focalizando a bomba e os feixes de laser Stokes em um ponto limitado por difração dentro da amostra, onde vibrações moleculares específicas são excitadas. A natureza confocal do SRS, derivada de sua dependência quadrática da intensidade dos lasers, garante que os sinais sejam confinados ao plano focal, excluindo contribuições fora de foco e fornecendo informações químicas altamente localizadas 5,6. Essa imagem com resolução de profundidade preserva a integridade do tecido, eliminando o corte mecânico, reduzindo o tempo de processamento e mantendo o contexto biológico e molecular da amostra.

Com base nos princípios da SRS, a histologia Raman estimulada (SRH) utiliza esses dados vibracionais moleculares para criar imagens pseudo-H & E de tecido fresco e não corado em tempo real, fornecendo aos médicos ferramentas de diagnóstico mais rápidas e eficientes 7,8. Essa capacidade de gerar imagens de alta qualidade tornou a SSR uma ferramenta indispensável para pesquisa e potenciais aplicações clínicas9. Recentemente, a avaliação da margem intraoperatória usando SRH forneceu feedback patológico quase em tempo real durante a ablação parcial da glândula e prostatectomia radical, permitindo ajustes imediatos do tratamento10,11.

O gerador de imagens SRH aproveita as vibrações moleculares intrínsecas para fornecer informações sobre a composição do tecido. A SSR pode ser usada para diferenciar efetivamente os tecidos cancerígenos dos benignos da próstata, analisando as propriedades vibracionais do CH2 e do CH3 7,12. O gerador de imagens SRH captura essas vibrações e produz imagens pseudo-H&E que aumentam o contraste nuclear, servindo como uma alternativa rápida à histopatologia convencional e fornecendo imagens de alta qualidade em 2-8 min, dependendo do tamanho do tecido 7,8.

A eficácia da SSR para o exame patológico rápido de biópsias de próstata não processadas foi avaliada. Os patologistas foram treinados para interpretar imagens de SSR de núcleos de biópsia de próstata obtidos ex vivo de espécimes de prostatectomia8. O método de varredura SRH foi otimizado para permitir a aquisição de imagens de alta resolução em minutos, reduzindo significativamente o tempo necessário em comparação com a histopatologia tradicional. Amostras de biópsia contendo uma mistura de histologia benigna e maligna serviram como um conjunto de treinamento para os patologistas, que então realizaram uma avaliação cega de um conjunto separado de biópsias imageadas por SRH e processadas por coloração H & E para servir como verdade. Os resultados mostraram que a acurácia média do patologista para identificar o câncer de próstata foi de 95,7%, com boa concordância na detecção de cânceres clinicamente significativos, indicando que a SSR pode efetivamente apoiar o diagnóstico quase em tempo real8.

Em estudos subsequentes, a inteligência artificial (IA) foi integrada para aumentar ainda mais a precisão do diagnóstico, a eficiência e a facilidade de implementação. Este modelo de IA emprega técnicas de aprendizado profundo para analisar características vibracionais e morfológicas capturadas por SRH, permitindo a classificação automatizada de amostras de biópsia de próstata em regiões benignas, cancerígenas e não diagnósticas, simplificando significativamente o processo de avaliação patológica9. A integração SRH-IA demonstrou precisão impressionante, alcançando 96,5% na detecção do câncer de próstata, com taxas de sensibilidade e especificidade de 96,3% e 96,6%, respectivamente9. Ao integrar a IA com a SSR, foi alcançado um desempenho diagnóstico compatível com o de patologistas experientes.

Por meio da extensa avaliação da SSR com patologistas e do desenvolvimento de um modelo de IA integrado ao gerador de imagens de SSR, os recursos dessa tecnologia foram significativamente avançados. Este protocolo descreve as etapas detalhadas para preparar amostras de biópsia de próstata, imagens usando o gerador de imagens SRH e analisar os dados com ferramentas assistidas por IA. Seguindo essas etapas, pesquisadores e médicos podem aproveitar essa nova técnica para aprimorar a detecção, pesquisa e tratamento do câncer de próstata.

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Protocolo

Este protocolo envolve o uso de espécimes humanos e segue as diretrizes de cuidados humanos da Universidade da Colúmbia Britânica. A pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) sob os seguintes números de aprovação ética: SRH: H23-00459, AI: H24-00585 e Biobank: H21-03722. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos humanos antes da coleta das amostras. Todos os procedimentos foram conduzidos em conformidade com os padrões éticos institucionais e regulamentares para garantir a proteção e confidencialidade dos participantes.

1. Ligue o SRH Imager

  1. Ligue o gerador de imagens SRH (Figura 1A). Deixe o sistema aquecer por 30 minutos para garantir que o laser atinja a temperatura operacional ideal para obter imagens precisas.

2. Prepare a câmara de fluido

  1. Conecte uma seringa de 50 mL cheia de água esterilizada à válvula da seringa no lado esquerdo da interface do gerador de imagens SRH (Figura 1B). Certifique-se de que a seringa esteja bem encaixada para manter a circulação adequada do fluido.

3. Faça login no sistema

  1. Depois que o sistema carregar, use o monitor touchscreen para inserir o nome de usuário e a senha.
  2. Selecione o nome de usuário apropriado e digite a senha. Toque em Fazer login.
  3. Aceite o Aviso de Isenção de Responsabilidade para reconhecer que o estudo é para fins de pesquisa se usado fora dos Estados Unidos ou da União Europeia.

4. Crie um novo estudo

  1. Selecione Criar novo estudo nas opções de exibição: Criar novo estudo, Continuar estudo existente e Exibir estudo existente.

5. Insira as informações do caso

  1. Insira informações relevantes do caso , incluindo sobrenome, nome, número do registro médico, data de nascimento, número de acesso, ID do estudo, nome do médico, número do quarto, localização anatômica primária e módulo de análise.
  2. Salve as amostras como John Doe (por exemplo).
  3. Em Localização anatômica primária, selecione Próstata (somente para uso em pesquisa).
  4. Para Modo de análise, escolha Câncer de próstata (somente para uso em pesquisa) para usar a IA integrada para detecção de câncer de próstata.

6. Finalize a criação do estudo e encha a câmara de fluido

  1. Toque em Criar estudo depois de inserir as informações do caso.
  2. Quando solicitado pelo sistema, toque em Confirmar para confirmar que os dados serão usados apenas para fins de pesquisa.
  3. Encha a câmara de fluido com água esterilizada conforme as instruções.
  4. Toque em Avançar quando solicitado e selecione Adquirir nas opções exibidas.
  5. Toque em Carregar Novo Espécime, e o sistema exibirá Preparar Espécime & Carregar Lâmina NIO.

7. Preparação da amostra e da lâmina

  1. Recupere a lâmina da biópsia da próstata. Use uma pinça de tecido com dentes para abrir cuidadosamente a lamínula anexada. Enquanto segura a lâmina e a lamínula abertas, use a pinça de tecido para colocar a biópsia de próstata do meio RPMI com segurança na ranhura da lâmina. Feche cuidadosamente a lamínula e prenda a amostra.
  2. Abra o suporte da lâmina na interface do gerador de imagens SRH e insira a lâmina preparada no suporte da lâmina, garantindo o alinhamento adequado. Feche a tampa do gerador de imagens SRH. Quando o sistema detectar a tampa fechada, toque em Avançar para continuar.

8. Defina os parâmetros de aquisição de imagem

  1. Defina os seguintes parâmetros de imagem:
    1. Para o nome da amostra: Selecione a biópsia 1 A para a primeira biópsia.
    2. Para Área de Digitalização: Selecione 0,4 mm x 6,1 mm, 3 regiões (Apenas para Utilização em Investigação) para digitalizar toda a biópsia.
    3. Para Posição de digitalização: Use a imagem na tela para ajustar manualmente o local de digitalização.
  2. Toque em Adquirir imagem para prosseguir.
  3. Revise os detalhes da amostra exibidos na tela e confirme selecionando Continuar.

9. Adquira a imagem SRH

  1. Permita que o gerador de imagens SRH foque automaticamente e adquira imagens que geram a imagem SRH final.
  2. Deixe o gerador de imagens escanear a biópsia em três seções (varredura 1, varredura 2 e varredura 3), conforme mostrado na Figura 2A.
  3. Deixe o gerador de imagens combinar as seções para formar uma imagem SRH completa (Figura 2B), produzindo uma imagem pseudo-H & E para avaliação.

10. Exibição da imagem SRH

  1. Veja a imagem de SSR da biópsia de próstata fresca e não corada. A imagem imita a coloração H & E usando um esquema de cores rosa / roxo que destaca as vibrações moleculares CH2 (associadas a lipídios) e as vibrações moleculares CH3 (relacionadas a proteínas e DNA).

11. Interpretação AI da imagem SRH apenas para uso em pesquisa

  1. Aplique a sobreposição de IA clicando no ícone (>>) na tela. A sobreposição de IA identifica regiões cancerígenas em vermelho, regiões não cancerígenas em verde e regiões não diagnósticas em violeta (Figura 3A).
  2. Revise o gráfico de barras quantificando a porcentagem de tecido canceroso, tecido não canceroso e tecido não diagnóstico (Figura 3B).
  3. Retorne à imagem SRH original sem a sobreposição de IA clicando no ícone (<<).

12. Zoom e navegação da imagem SRH

  1. Use as funções de aumentar e diminuir o zoom na tela sensível ao toque para explorar diferentes regiões da biópsia em detalhes.
  2. Use os ícones de navegação para percorrer a imagem para um exame abrangente da amostra de biópsia.

13. Isolamento do tecido selecionado

  1. Após a varredura inicial, remova cuidadosamente a biópsia da lâmina. Use uma pinça de tecido com dentes para levantar a lamínula anexada e libere suavemente a biópsia.
  2. Coloque a biópsia em um Telfa umedecido embebido em solução salina para manter a integridade do tecido durante o processo de corte.
  3. Use uma lâmina cirúrgica para aparar áreas não cancerígenas identificadas na sobreposição gerada por IA da imagem SRH, avaliando visualmente a sobreposição para determinar as regiões ideais para remoção. Concentre-se na remoção de áreas normalmente localizadas nas extremidades da biópsia para aumentar a proporção câncer-tecido. Certifique-se de que haja tecido suficiente para nova digitalização.

14. Digitalize novamente a biópsia

  1. Examine novamente a biópsia seguindo o mesmo procedimento descrito nas etapas 9-11.
  2. Ajuste a área e a posição da varredura para confirmar um aumento da proporção câncer-tecido (visto na Figura 3C-E). Revise a imagem SRH atualizada e a sobreposição de IA para verificar as porcentagens de regiões cancerígenas e não cancerígenas.
  3. Repita o corte e a nova digitalização até que a proporção desejada seja alcançada.

15. Biobanco e criopreservação

  1. Remova a biópsia da lâmina usando uma pinça de tecido com dentes . Coloque a biópsia em um criotubo.
  2. Congele o criotubo em nitrogênio líquido para garantir a preservação rápida da amostra.
  3. Transfira o criotubo em nitrogênio líquido para um freezer a -80 °C ou instalação de armazenamento de nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.

16. Exporte dados de imagem

  1. Toque no ícone do avião de papel para exportar dados de imagem para armazenamento e análise posterior.
  2. Para selecionar o local de exportação, toque na opção Selecionar local de exportação e escolha entre USB (não identificado), USB (completo) e iPhone (completo). Selecione USB (Completo) e escolha um disco rígido externo para exportação de dados.
  3. Para selecionar a série de imagens a ser exportada, selecione Todo o estudo para exportar todas as séries de imagens de SSR para o paciente, em vez de uma série específica.
  4. Aguarde até que o sistema exiba Exportação em andamento e toque em Confirmar quando a exportação for concluída.

17. Desligue o microscópio SRH

  1. Toque em Sair e siga as instruções de desligamento exibidas na tela.
  2. Selecione Continuar sem quando solicitado a arquivar dados de imagem (se já exportados).
  3. Descarte a amostra de acordo com os protocolos laboratoriais apropriados.
  4. Toque em Avançar e esvazie a câmara de fluido usando a seringa anexada, conforme as instruções.
  5. Toque em Avançar quando solicitado e selecione Sim nas opções exibidas.
  6. Remova e descarte a seringa.
  7. Toque em Desligar para desligar completamente o microscópio SRH.

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Resultados

A aplicação de SRH integrada com IA demonstrou a rápida detecção e caracterização do câncer de próstata em amostras de biópsia em minutos. A Figura 2A descreve o procedimento de varredura em várias etapas do gerador de imagens SRH, onde três varreduras distintas (varredura 1, varredura 2 e varredura 3) foram realizadas na amostra de biópsia. Cada varredura capturou assinaturas vibracionais moleculares únicas correspondentes ao conteúdo de lipídios, proteínas e DNA, essenciais para gerar uma ...

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Discussão

O protocolo de SSR para detecção de câncer de próstata representa um avanço significativo em imagens médicas e histopatologia. A SSR permite imagens quase em tempo real e sem marcação de tecido fresco e não corado, permitindo a detecção rápida de câncer de tecidos não processados sem os atrasos associados aos métodos histopatológicos tradicionais 3,4,5,6,7,8,9....

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Divulgações

C. Freudiger é funcionário, acionista e diretor da Invenio Imaging e possui patentes de microscopia espectroscópica Raman estimulada que são licenciadas de forma independente. A. Ion-Margineanu é acionista da Invenio Imaging.

Agradecimentos

Reconhecemos as contribuições da equipe de pesquisa do Vancouver Prostate Center e da NYU Langone Health, e o suporte técnico fornecido pela Invenio Imaging. Este trabalho foi financiado pelo Centro de Inovação do Ministério da Saúde da Colúmbia Britânica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Recipiente de nitrogênio líquido de bancadaThermo Científico11-670-4B
CitotuboGreiner Bio-One126279
Dumont #5 Pinça FinaFerramentas de Belas Ciências11254-20
Lâmina de biópsia de próstata NIOInvenio Imaging, Inc.AT0013
Solução RPMIThermo Fisher Científico11875093
Solução salinaBaxter
Gerador de imagens SRH (sistema de imagem a laser NIO)Invenio Imaging, Inc.
Lâmina cirúrgicaFisher Científico501094395

Referências

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Epstein, J. I., et al. The 2014 International Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus Conference on Gleason Grading of Prostatic Carcinoma: Definition of grading patterns and proposal for a new grading system. Am J Surg Pathol. 40 (2), 244-252 (2016).
  3. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nat Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  4. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  5. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  6. Cheng, Q., Miao, Y., Wild, J., Min, W., Yang, Y. Emerging applications of stimulated Raman scattering microscopy in materials science. Matter. 4 (5), 1460-1483 (2021).
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  8. Mannas, M. P., et al. Stimulated Raman histology, a novel method to allow for rapid pathologic examination of unprocessed, fresh prostate biopsies. Prostate. 83 (11), 1060-1067 (2023).
  9. Mannas, M. P., et al. Stimulated Raman histology interpretation by artificial intelligence provides near-real-time pathologic feedback for unprocessed prostate biopsies. J Urol. 211 (3), 384-391 (2024).
  10. Mannas, M. P., et al. Intraoperative margin assessment with near real time pathology during partial gland ablation of prostate cancer: A feasibility study. Urol Oncol. 43 (1), 64.e19-64.e25 (2024).
  11. Mannas, P. M., et al. MP61-18 stimulated Raman histology, a novel method for intraoperative surgical margin assessments during robotic assisted laparoscopic prostatectomy. J Urol. 209 (Supplement 4), (2023).
  12. Hollon, T., et al. Artificial-intelligence-based molecular classification of diffuse gliomas using rapid, label-free optical imaging. Nat Med. 29 (4), 828-832 (2023).
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  14. Sarri, B., et al. In vivo organoid growth monitoring by stimulated Raman histology. Npj Imaging. 2 (1), 18(2024).
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