Efeitos da Shikonin na via de sinalização HIF-1α/VEGF em camundongos com lesão pulmonar aguda causada por sepse

Resumo

O protocolo tem como objetivo avaliar a eficácia da shikonin no alívio da lesão pulmonar aguda causada por sepse em camundongos. Ao direcionar a via HIF-1α / VEGF, o estudo investiga como diferentes doses de shikonin influenciam as taxas de sobrevivência, patologia pulmonar e expressão de marcadores inflamatórios, destacando seus potenciais benefícios terapêuticos.

Resumo

A sepse geralmente causa lesão pulmonar aguda (LPA), uma complicação de alta mortalidade. A via HIF-1α/VEGF desempenha um papel fundamental na sepse, e a shikonina, um composto natural com propriedades anti-inflamatórias, pode aliviar a lesão pulmonar ao direcionar essa via. Os camundongos Balb/c foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo simulado, grupo modelo, grupo de tratamento de baixa dose e grupo de tratamento de alta dose. O grupo sham foi submetido a laparotomia sem ligadura e punção cecal (CLP), enquanto o grupo modelo foi submetido a CLP para induzir lesão pulmonar aguda relacionada à sepse. Após a modelagem, os grupos de tratamento de baixa e alta dose receberam shikonin por gavagem nas doses de 12,5 mg/kg e 50 mg/kg, respectivamente, uma vez ao dia por 14 dias. A taxa de sobrevida de 7 dias dos camundongos foi monitorada. A coloração de hematoxilina e eosina (HE) foi usada para avaliar a patologia do tecido pulmonar, a relação de peso úmido/seco (W/D) pulmonar foi medida e um Western blot foi realizado para detectar a expressão de HIF-1α, VEGF, TNF-α e IL-6 no tecido pulmonar. A Shikonin melhorou significativamente a taxa de sobrevivência de camundongos sépticos, com o maior efeito observado no grupo de alta dose (p < 0,05). Em comparação com o grupo modelo, a relação P/D pulmonar e o dano tecidual nos grupos tratados com shikonina foram significativamente reduzidos de maneira dose-dependente. Além disso, a shikonina regulou significativamente a expressão de HIF-1α, VEGF, TNF-α e IL-6, com o grupo de alta dose mostrando a redução mais pronunciada (p < 0,05). A shikonina alivia a lesão pulmonar aguda em camundongos sépticos, potencialmente inibindo a expressão de HIF-1α e reduzindo a produção de fatores inflamatórios relacionados.

Introdução

A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica grave desencadeada por infecção. ¹ Muitas vezes leva à disfunção de múltiplos órgãos e pode se tornar fatal à medida que a condição progride. ² Apesar do uso de terapias como ventilação mecânica e cuidados de suporte, as taxas de mortalidade por LPA associada à sepse permanecem altas, chegando a 30%-40%³. Esses tratamentos abordam principalmente os sintomas e não as causas subjacentes, limitando sua eficácia geral. Portanto, a identificação de novas abordagens terapêuticas que visam as causas da lesão pulmonar pode melhorar significativamente os resultados dos pacientes na sepse.

Estudos recentes identificaram o fator 1α induzível por hipóxia (HIF-1α) como um regulador crítico na progressão da LPA induzida por sepse ^4,5. O HIF-1α se acumula no tecido pulmonar durante a sepse, impulsionando a expressão de genes a jusante que exacerbam a inflamação e o dano tecidual⁶. Esse processo contribui significativamente para o agravamento da lesão pulmonar. Portanto, direcionar a via de sinalização HIF-1α oferece uma abordagem promissora para mitigar as respostas inflamatórias e hipóxicas observadas na LPA induzida por sepse.

Na busca por tratamentos mais eficazes, a Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem fornecido informações valiosas ^7,8. A shikonina é um composto de antraquinona extraído de Lithospermum erythrorhizon⁷. Apresenta notáveis efeitos anti-inflamatórios⁹, antibacterianos¹⁰ e antitumorais¹¹. A sicenina pode aliviar a lesão pulmonar induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS), sugerindo seu potencial papel terapêutico em doenças pulmonares¹². Ao mesmo tempo, alguns estudos também propuseram que a shikonin pode aliviar o dano oxidativo causado pela sepse, regulando o sistema de macrófagos mononucleares, equilibrando as respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. No entanto, os mecanismos por trás dos efeitos protetores da shikonin na LPA induzida por sepse não são totalmente compreendidos. Isso representa uma lacuna crítica na pesquisa atual.

Neste estudo, pretendemos explorar os efeitos protetores da shikonin em um modelo de camundongo de LPA induzida por sepse usando ligadura e punção cecal (CLP). A tecnologia CLP desempenha um papel importante na pesquisa da sepse, pois pode simular respostas inflamatórias sistêmicas complexas e disfunção de múltiplos órgãos, tornando-a adequada para avaliar a eficácia de novas estratégias de tratamento. A tecnologia CLP é relativamente mais relevante clinicamente em comparação com os métodos tradicionais de injeção de LPS: ela simula a resposta inflamatória sistêmica causada pela translocação da microbiota intestinal, que está mais próxima do processo patológico da sepse clínica. Pode ser graduado e controlado: ajustando o comprimento da ligadura e o tamanho da perfuração, a gravidade da doença pode ser controlada e é adequado para todo o estudo da sepse. Além disso, pode simular mudanças dinâmicas semelhantes na disfunção de múltiplos órgãos e na resposta de citocinas. Ao investigar o papel da shikonina na modulação da via de sinalização HIF-1α / VEGF, esperamos fornecer informações sobre novas estratégias terapêuticas que abordem os mecanismos subjacentes da lesão pulmonar relacionada à sepse, potencialmente melhorando os resultados clínicos.

Protocolo

O protocolo obteve a aprovação do Centro de Animais Experimentais da Universidade Médica de Wenzhou. Camundongos C57Bl/6 machos (5-6 meses de idade; 20–25 g) foram usados no presente estudo. Os detalhes dos principais reagentes e dos equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do modelo de camundongo com sepse

1. Ratos domésticos sob uma temperatura constante de 25 °C, 50% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 h.
2. Após um período de aclimatação de 7 dias, divida aleatoriamente os camundongos em quatro grupos: grupo simulado, grupo modelo, grupo de tratamento de baixa dose e grupo de tratamento de alta dose, com 20 camundongos em cada grupo.
3. Com base em referências de um estudo anterior¹³, tratar o grupo de baixa dose com uma concentração de 12,5 mg/kg de purpurina por 14 dias e o grupo de alta dose com uma concentração de 50 mg/kg por 14 dias. Para o grupo de cirurgia simulada, realizar laparotomia, tração cecal, redução e fechamento sem ligadura ou punção e tratar com a mesma dose de soro fisiológico por 14 dias. As etapas experimentais para o grupo sepse são as seguintes.
4. Após jejum noturno (água era permitida), anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico (40-80 mg/kg) em condições estéreis durante todo o processo. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
5. Verifique a anestesia adequada como desaceleração da frequência respiratória, diminuição da tensão muscular e nenhuma resposta óbvia ao estresse ao apertar levemente os membros inferiores com pinça hemostática.
6. Realizar a desinfecção com etanol 75%, 3x. Faça uma incisão longitudinal de cerca de 1 cm na posição central esquerda do abdômen do camundongo e abra a pele, a fáscia e os músculos em camadas para expor a cavidade abdominal.
7. Usando uma pinça oftálmica de ponta romba em ambas as mãos, explore suavemente a cavidade abdominal, localize e liberte o ceco do camundongo e ligue-o a uma distância de cerca de 1 cm da extremidade do ceco.
8. Use uma agulha 21G para perfurar e ligar a extremidade do ceco, esprema suavemente uma pequena quantidade de conteúdo intestinal do local da punção usando uma pinça oftálmica de ponta romba e, em seguida, recupere-a para o ceco.
9. Realize a ressuscitação fluídica subcutânea com 1 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9%. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Observamos que o animal que foi submetido à cirurgia não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
10. Após 7 dias de modelagem CLP, administre anestesia excessiva para eutanásia.
    NOTA: Devido aos possíveis efeitos irritantes da purpurina na pele, trato respiratório e trato digestivo, bem como sua alta toxicidade para organismos aquáticos, poluição ambiental, use proteção individual durante o experimento.

2. Avaliação de modelos animais

1. Observação de sobrevivência de camundongos
   1. Realize o manuseio do animal conforme descrito acima. Registre a taxa de mortalidade dentro de 1 semana após a modelagem para análise estatística. Alguns camundongos morrem sem sepse antes da eutanásia, enquanto os camundongos modelo CLP têm uma certa taxa de mortalidade (Tabela 1).
   2. Medição da relação entre o peso úmido e seco do pulmão
      1. Após 24 h de modelagem, anestesiar os camundongos novamente de acordo com as etapas 1.4-1.5.
      2. Faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 1 cm no lado esquerdo da linha média da clavícula do camundongo e remova a pele, a fáscia e as camadas musculares para expor a cavidade torácica com tesouras cirúrgicas e pinças.
      3. Remova o pulmão esquerdo e drene o fluido da superfície. Medir o peso húmido e depois secar numa estufa a 80 °C durante 72 h até um peso constante para obter o peso seco.
      4. Calcule o teor de água pulmonar como:
         Teor de água pulmonar = (Peso úmido - Peso seco) / Peso úmido x 100%.
   3. Comparação histopatológica dos tecidos pulmonares
      1. Em pontos de tempo especificados, colete o pulmão esquerdo conforme descrito acima na etapa 2.2. Fixe o pulmão em formaldeído neutro a 10%, embeba-o em parafina e corte-o em 5 μm de espessura.
      2. Desparafine o pulmão em xileno, 2x, por 5-10 min de cada vez. Realize a reidratação com etanol em série com 100%, 95%, 85% e 75%, por 3 min por gradiente. Mergulhe em água destilada por 2 min.
      3. Manchar com aproximadamente 100 mL de solução de hematoxilina por 10 min e depois enxaguar com água destilada para remover qualquer cor flutuante.
      4. Adicione cerca de 70 ml da solução de diferenciação e deixe de molho durante 30 s. Em seguida, mergulhe em água da torneira 2x, de cada vez por 3-5 min.
      5. Adicione aproximadamente 100 mL de solução de corante de eosina gota a gota por 2 min. Despeje o excesso de solução de corante e desidrate rapidamente conforme descrito abaixo.
      6. Realize desidratação, transparência e vedação conforme descrito abaixo.
         1. Mergulhe as amostras em etanol gradiente: 75%, 85%, 95% e 100% de etanol (I) por 2-3 s cada. Mergulhe em etanol 100% (II) por 1 min e mergulhe em xileno 2x por 1 minuto de cada vez. Usando um canudo ou conta-gotas, pingue goma neutra na superfície das fatias de tecido e espalhe-a uniformemente o máximo possível para evitar a formação de bolhas. Sele e observe ao microscópio a 400x.
      7. Selecione 10 campos aleatórios por seção de pulmão. Peça a um patologista para pontuar alterações patológicas, como edema alveolar, hemorragia e infiltração de neutrófilos, de 0 (normal) a 4 (dano grave). Use a pontuação total para avaliação.
   4. Western blotting
      1. Extraia proteínas nucleares do tecido pulmonar de acordo com as instruções do kit de extração de proteínas nucleares e meça a concentração de proteínas usando o método BCA de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Preparar amostras de carga de proteínas com 50 μg de proteína carregada por amostra. Prepare o gel separador SDS-PAGE (10%) e o gel de empilhamento (3%). Realize eletroforese a 80 V por 45 min e, em seguida, transfira a proteína para a membrana de PVDF a 110 V por 60 min após as amostras terem entrado no gel de separação.
      3. Transfira as proteínas para uma membrana e bloqueie por 60 min. Incubar com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais, 1:1000) durante a noite a 4 °C, seguido de anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais, 1:1000) incubação a 37 °C por 2 h.
      4. Lave a membrana com TBST e use ECL para visualização. Em uma sala escura, adicione os reagentes preparados em uma membrana de PVDF e realize imagens de agitação e fluorescência. Os reagentes ECL interagem com biomoléculas na membrana, produzindo fortes reações de quimioluminescência, que são registradas por instrumentos de imagem de fluorescência.
      5. Analise o valor da escala de cinza das bandas de proteínas usando um sistema de análise de imagem, Método de Quantificação de Banda (Para obter informações detalhadas sobre o sistema usado para analisar a densitometria de banda, consulte Imagem do NIH).
   5. Análise estatística
      1. Use o SPSS 26.0 para análise estatística. Use ANOVA unidirecional para comparar as médias de vários grupos e testes LSD-t para comparações em pares. Considere um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Para avaliar o potencial terapêutico da shikonina, primeiro avaliamos seu efeito na sobrevida em camundongos sépticos durante um período de 7 dias. O tratamento com shikonin melhorou as taxas de sobrevida de maneira dose-dependente (Figura 1).

Dada a ocorrência generalizada de lesão pulmonar na sepse, também avaliamos o edema pulmonar em camundongos. O edema pulmonar foi avaliado pela medida da relação entre o peso úmido e seco (P/D) do pulmão. A ...

Discussão

Como o modelo padrão-ouro para pesquisa de sepse, o modelo CLP é um passo fundamental neste experimento porque o CLP imita a complexidade da sepse humana melhor do que muitos outros modelos. A LPA associada à sepse continua sendo um desafio clínico crítico devido às suas altas taxas de mortalidade e à eficácia limitada dos tratamentos atuais^14,15. Nosso estudo demonstra, pela primeira vez, que a shikonina melhora significativamen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
H& Kit de coloração E kit de coloração	Solaibao Technology	G1120HE
centrífuga de baixa temperatura	Sigma	3K15
Microplate Reader	Bio-Rad	Modelo 680
anticorpo monoclonal VEGF-receptor1 de coelho	Abcam	ab238632
anticorpo policlonal HIF-1&alfa de coelho	Abcam	ab51608
SDS-PAGE sistema de eletroforese	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822