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Artigo de método

Estabelecimento do modelo de camundongo para psoríase por Imiquimod

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DOI:

10.3791/68111

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20 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Characteristic Experimental Animal Models of Guangxi, 3Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, 4College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um modelo de camundongo altamente eficaz e estável de psoríase estabelecido através da utilização de imiquimode. Além disso, detalhamos as metodologias empregadas para avaliar a gravidade da psoríase.

Resumo

A psoríase é uma condição cutânea comum, crônica, recidivante e inflamatória, caracterizada por infiltração espessa da pele, escamas e eritema. A patogênese da doença é altamente complexa, envolvendo a interação de vários fatores, como genética, imunidade e fatores ambientais. Para investigar os mecanismos subjacentes à psoríase, os pesquisadores desenvolveram vários modelos animais da doença. No entanto, a variabilidade nas metodologias tem apresentado desafios para a construção desses modelos de forma consistente. Neste estudo, estabelecemos e avaliamos de forma abrangente um modelo de camundongo com psoríase altamente eficiente e estável usando imiquimod (IMQ). Camundongos C57BL / 6J fêmeas de grau SPF de 8 semanas de idade foram usados para estabelecer o modelo de camundongo com psoríase. Após uma semana de aclimatização, foram excluídos camundongos com pele irritada ou danificada nas áreas depiladas. A partir do segundo dia, o creme IMQ a 5% (62,5 mg/d) foi aplicado diariamente nas regiões depiladas do pescoço e costas por sete dias consecutivos. Durante o experimento, foram realizadas medições diárias de peso corporal, fotografia da pele, pontuação da pele e observações comportamentais. Após o experimento, foram realizadas a determinação do índice de baço, análise histológica da pele, detecção de citocinas séricas e detecção do nível de mRNA da pele. Os resultados mostraram que os camundongos do grupo IMQ desenvolveram sintomas típicos semelhantes aos da psoríase, incluindo eritema, escamas e espessamento da pele, acompanhados por aumento do comportamento de coçar, perda de peso, índice elevado do baço e aumento da espessura da pele. E alterações significativas nos níveis de TNF-α, IL-23 e IL-17A no soro, bem como nos níveis de mRNA de IL-23, IL-17A, IL-17F e IFN-γ na pele. Os níveis séricos de citocinas (TNF-α, IL-23, IL-17A) e a expressão de mRNA da pele de marcadores pró-inflamatórios (IL-23, IL-17A, IL-17F, IFN-γ) foram notavelmente regulados positivamente. Em contraste, o grupo controle não apresentou tais alterações. Ao otimizar a duração da indução do IMQ e padronizar o protocolo de administração, enquanto monitora dinamicamente as alterações cutâneas, este estudo visa fornecer uma estrutura padronizada para os pesquisadores construírem modelos confiáveis de psoríase.

Introdução

A psoríase é uma doença cutânea sistêmica comum, crônica, recidivante e inflamatória, sendo a psoríase em placas a manifestação clínica mais predominante1. Suas características clínicas geralmente incluem infiltração cutânea, espessura, escamas e eritema2, e também pode desencadear uma variedade de complicações, incluindo artrite psoriásica, depressão, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares1. Além disso, a psoríase é frequentemente acompanhada de prurido crônico3. Globalmente, a psoríase afeta de 2% a 3% da população4, e sua incidência está aumentando. Portanto, o estabelecimento de modelos animais confiáveis que mimetizem de perto as características patológicas da psoríase humana é crucial para descobrir sua patogênese e desenvolver novas estratégias terapêuticas.

No campo da pesquisa dermatológica, a psoríase tem recebido atenção significativa devido à sua patogênese complexa, que envolve a interação de fatores genéticos, imunológicos e ambientais, apresentando desafios consideráveis para um estudo aprofundado1. Pesquisas atuais indicam que o início da psoríase é mediado principalmente por células T, que, ao serem ativadas, estimulam os queratinócitos a superproliferar e alterar a secreção de citocinas durante seu processo de diferenciação5. Nesse processo, o eixo Interleucina (IL)-23/IL-17 desempenha um papel fundamental. A IL-23 promove a diferenciação e ativação de células Th17, que produzem citocinas como IL-17A e IL-17F, desempenhando um papel significativo no desenvolvimento da psoríase 6,7,8. Atualmente, a patogênese da psoríase engloba inúmeras alterações moleculares. Estes envolvem citocinas como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), o eixo IL-23/IL-17, IL-37, vias de sinalização intracelular como fator nuclear-κB (NF-κB) e transdução de sinal de Janus quinase e ativador transcricional (JAK-STAT). Além disso, está intimamente associado a moléculas relacionadas ao açúcar, ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), aminoácidos, vias do metabolismo lipídico, bem como a fatores reguladores epigenéticos, incluindo metilação do DNA e modificação de histonas. Esses alvos estão intrinsecamente entrelaçados e interagem uns com os outros, conduzindo conjuntamente o início e a progressão da psoríase9.

Na pesquisa atual da psoríase, uma variedade de modelos animais é empregada, incluindo modelos espontâneos, modelos de transplante alogênico, modelos transgênicos ou nocaute gênico e modelos quimicamente induzidos, entre outros10. Esses modelos animais desempenham um papel essencial no estudo da psoríase, com os cientistas utilizando várias espécies, como camundongos, porquinhos-da-índia e peixes-zebra, para construir modelos de psoríase 11,12,13. No entanto, todos esses modelos têm certas limitações, incluindo complexidade genética, diferenças de espécies, preocupações éticas e considerações de custo14.

O imiquimode (IMQ), como agonista dos receptores do tipo Toll (TLRs), pode desencadear inflamação da pele e infiltração de células imunes, além de promover a proliferação de queratinócitos e o aumento dos vasos sanguíneos dérmicos13. Um estudo relatou que a aplicação tópica de IMQ em humanos pode induzir psoríase15. Observações clínicas também revelaram que o IMQ exacerba os sintomas da psoríase em pacientes7. Em modelos de psoríase em camundongos, a administração contínua de uma concentração de 5% de IMQ pode reproduzir as manifestações cutâneas da psoríase humana, como eritema e escamas. Além disso, outros sintomas imitam de perto os da psoríase em placas humanas, incluindo alterações epidérmicas como acantose e paraceratose, neoangiogênese e assim por diante. Os modelos de camundongos com psoríase induzidos por IMQ também são capazes de simular prurido crônico4. Há também uma infiltração de células inflamatórias consistindo de células T, neutrófilos e células dendríticas em modelos de camundongos com psoríase 2,16. As lesões cutâneas induzidas por IMQ dependem principalmente do eixo TNF-α-IL-23 / IL-17, indicando que modelos de camundongos com psoríase baseados em IMQ podem ser utilizados para investigar melhor a psoríase humana9.

O modelo de camundongo com psoríase induzida por IMQ empregado neste estudo é adequado para cepas de camundongos como C57BL / 6 e BALB / c, que têm tendências Th1 e Th2, respectivamente7. Este modelo é estável e altamente eficiente, com as vantagens de baixo custo, curta duração experimental, operação simples, sintomas distintos e alta taxa de sucesso. No experimento, fornecemos um relato detalhado de vários métodos empregados para monitorar a progressão da psoríase. Esses métodos abrangeram pontuação cutânea e testes comportamentais. Além disso, validamos ainda mais os achados experimentais por meio da utilização de análise histopatológica, ensaio imunoenzimático (ELISA) e reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR). Este modelo não é apenas adequado para explorar a patogênese da psoríase, mas também para avaliação pré-clínica de novas abordagens terapêuticas, tornando-o uma ferramenta valiosa na pesquisa.

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Protocolo

O protocolo de uso de animais listado abaixo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Bem-Estar e Ética da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi (DW20191220-153). O certificado animal dos camundongos comprados foi SCXK (Xiang) 2024-0009. Neste estudo, camundongos fêmeas C57BL / 6J de 8 semanas de idade, grau SPF, foram divididos aleatoriamente em grupos, cada grupo contendo 6 camundongos. A gaiola é colocada em uma sala com temperatura controlada (23 ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso a alimentos e água. O fluxograma do experimento é mostrado na Figura 1. Exceto por não serem induzidos com creme IMQ, os camundongos do grupo controle receberam os mesmos tratamentos que os do grupo IMQ em todos os outros aspectos.

1. Preparação animal

  1. Comece a modelar depois de adaptar o animal ao ambiente por uma semana. Antes de iniciar o experimento, desinfete meticulosamente a mesa experimental usando uma solução de etanol a 75%.
  2. Usando uma caneta marcadora, marque claramente as caudas dos ratos, garantindo sua identificação individual.
  3. Use o barbeador para raspar os pelos do pescoço e das costas de todos os ratos em uma área de cerca de 4 cm x 3 cm (dia 0; Figura 2A). Use um cotonete para aplicar uma quantidade adequada de creme depilatório na pele depilada e espalhe-o uniformemente (Figura 2B).
  4. Após a aplicação do creme depilatório, aguarde cerca de 15 s. Deixe o creme depilatório na superfície da pele do camundongo por 15-20 s ideais. Limpe com cuidado e rapidez.
  5. Use um novo cotonete para mergulhá-lo em água e limpe repetidamente na direção da cauda do rato até a cabeça para limpar o cabelo. Seque suavemente a pele local com papel absorvente médico.
  6. Examine a condição da pele dos camundongos 24 horas após a depilação e exclua aqueles com áreas de depilação danificadas.

2. Modelo de camundongo com psoríase induzida por IMQ

  1. Certifique-se de que os pequenos danos à pele causados pelo barbear ou depilação sejam totalmente recuperados.
  2. A partir do2º dia, aplique o creme IMQ 5% na dosagem de 62,5 mg7. Para fazer isso, pré-encha toda a seringa de 1 mL com creme IMQ com antecedência e administre o medicamento ao camundongo de acordo com o volume correspondente a 62,5 mg de IMQ por dia na pele depilada do camundongo usando uma colher de cabo chato ( Figura 2C ). Durante a aplicação, certifique-se de que o creme IMQ seja espalhado o mais uniformemente possível sobre a área depilada e que a área de aplicação seja menor que a área depilada.
  3. Depois de espalhar a droga, coloque o camundongo em uma gaiola vazia e aguarde 15 min. Coloque o camundongo de volta na gaiola de alimentação depois que a droga for completamente absorvida. Realize a aplicação do medicamento continuamente por 7 dias.

3. Análise do peso corporal de camundongos com psoríase

  1. Coloque um copo limpo em uma balança eletrônica e tara. Em seguida, coloque suavemente o mouse dentro e observe as leituras estáveis exibidas na balança.
  2. A partir do dia 1 (o dia anterior à aplicação inicial do IMQ), pesar os camundongos diariamente até o dia 8. Compare o peso de cada mouse com seu peso correspondente no dia 1.

4. Caracterização cutânea de camundongos com psoríase

  1. Coloque os ratos em um fundo branco com uma régua. Mantenha os corpos dos camundongos retos sem encolher a cabeça ou fazer grandes balanços (Figura 3).
  2. Desde o dia 1, tire uma fotografia de alta resolução do local de administração dos camundongos sob a mesma intensidade de iluminação todos os dias e registre a caracterização da pele dos camundongos.
  3. Durante cada sessão de fotografia, mantenha a distância entre a câmera e os mouses consistente, bem como a ampliação da câmera, e posicione a régua perpendicularmente à câmera.

5. Pontuação de pele

  1. Pontue a gravidade da dermatite da psoríase em camundongos usando o Índice de Área e Gravidade da Psoríase modificado (PASI) 17 todos os dias do dia 1 ao dia 8. Empregue três pesquisadores usando um método duplo-cego para pontuar independentemente o eritema, as escamas e a espessura da pele em uma escala de 0 a 4, tomando a média aritmética dos três. Para regras de pontuação PASI, verifique a Tabela 1.
    Escore PASI = eritema + escala + espessura

6. Observação comportamental de camundongos

  1. No mesmo ambiente silencioso e normalmente iluminado em temperatura ambiente (como na etapa 4), coloque cada mouse em uma caixa de acrílico individual (10 cm x 10 cm) com uma pequena quantidade de acolchoamento de espiga de milho na parte inferior.
  2. Use divisórias pretas para separar cada caixa e bloquear a linha de visão. Após um período de adaptação de 15 min, gravar em vídeo o comportamento dos animais por 1 h.
  3. Grave vídeos comportamentais em um horário fixo todos os dias, do dia 1 ao dia 8. Posicione a lente da câmera perpendicularmente à caixa de acrílico e certifique-se de que ela capture totalmente as atividades do mouse no interior.
  4. Registre casos em que o rato levanta a pata traseira para coçar o pescoço e as costas e depois a abaixa como um comportamento de coceira.

7. Coleta de sangue e medição dos níveis de citocinas no soro por ELISA

  1. Remova os globos oculares dos camundongos rapidamente com uma pinça e colete o sangue no dia 9.
  2. Deixe o sangue repousar a 4 °C durante 4 h. Separe o sangue usando uma centrífuga de baixa temperatura a 3000 x g por 30 min a 4 °C. Colete o soro e guarde-o a -80 °C para uso futuro.
  3. Quantificar os níveis séricos de TNF-α, IL-17A e IL-23 usando o kit ELISA relevante de acordo com o protocolo do fabricante18.

8. Amostragem da pele e do baço

  1. De acordo com os regulamentos do comitê de ética de experimentos com animais relevante, deslocar as vértebras cervicais de camundongos para eutanásia após a coleta de sangue no dia 9.
  2. Após a eutanásia, corte as lesões cutâneas nas costas dos camundongos em duas porções. Mergulhe uma porção em um tubo de centrífuga de 5 mL com uma solução de paraformaldeído a 4% para fixação e preservação. Separe e embale a outra parte dos tecidos da pele e armazene-os a -80 °C para uso futuro.
  3. Use uma tesoura esterilizada para cortar a pele ao longo da linha média do abdômen do camundongo, expor a cavidade abdominal e encontrar e remover completamente o baço. Lave as amostras com solução salina normal estéril, coloque-as em solução salina normal, pese-as e registre os dados.

9. Análise histológica de cortes de pele

  1. Remova o tecido da pele do paraformaldeído e coloque-o na caixa de incorporação.
  2. Execute os seguintes passos na pele: Use álcool gradiente de 75% a 100% (de baixa a alta concentração), com três tanques de álcool 100%. Deixe em cada tanque por 30 min em temperatura ambiente. Use dois tanques de xileno. Deixe em cada tanque por 30 min em temperatura ambiente. Use três tanques de cera de parafina com um ponto de fusão de 56-58 °C. Deixe em cada tanque por 1 h em temperatura ambiente.
  3. Incorpore o tecido da pele tratada: Coloque o tecido da pele impregnado de cera na posição vertical em um molde de parafina. Despeje a parafina derretida no molde quando a temperatura da parafina de incorporação for 5-7 °C mais alta que o ponto de fusão da parafina. Mova-o rapidamente para a mesa de congelamento para esfriar e solidificar o bloco de cera rapidamente.
  4. Congele o bloco de cera a 0 °C, retire-o da caixa de embutir, fixe-o na mesa de fixação do fatiador e corte-o com uma espessura de 3 μm.
  5. Use uma pinça para pegar as fatias e escalde-as em água morna a 45 °C. Prenda a seção no centro da parte lisa da lâmina e marque o número patológico na área fosca com um lápis. Incline a lâmina a 45° por um momento para permitir que a umidade escorra, depois coloque-a no forno a 62 °C e leve ao forno por 30 min.
  6. Coloração HE: Coloque as fatias em xileno por 5 min, depois em outro tanque de xileno por 5 min, em etanol anidro por 1 min, em etanol 95% por 1 min, em etanol 85% por 1 min e em etanol 75% por 1 min. Enxágue com água da torneira por 1 min, mante com solução de hematoxilina por 5 min e lave a solução de hematoxilina em água corrente por 1 min.
  7. Mergulhe em etanol de ácido clorídrico a 1% por 3 s, lave com água por 20 s, use água morna para retorno azul por 5 min, enxágue com água corrente por 2 min, manche com 0,5% de eosina por 1 min, mergulhe em etanol a 95% por 2 s, depois em etanol a 95% por 2 min, em etanol anidro por 4 min, em outro tanque de etanol anidro por 4 min, em xileno por 4 min, em outro tanque de xileno por 4 min e no último tanque de xileno por 4 min. Após a secagem ao ar, sele-o com goma neutra.
  8. Observe as seções ao microscópio e tire fotos aleatoriamente em três posições com uma ampliação de 400. Para cada imagem, meça aleatoriamente a espessura epidérmica em cinco locais usando o software Image J. Registre e analise os dados.

10. Medição dos níveis de mRNA de IL-17A, IL-17F, IL-23 e IFN-γ na pele por RT-qPCR

  1. Pegue o tecido cutâneo armazenado em geladeira a -80 °C, com peso de aproximadamente 100 mg, e extraia o RNA pelo método Trizol.
  2. Transcrição reversa em cDNA de acordo com o kit de transcrição reversa (VAZYME, China).
  3. Configure o sistema de reação de PCR de acordo com o manual e conduza a PCR em tempo real usando um instrumento de PCR quantitativo de fluorescência sob o procedimento de reação especificado (Tabela 2) e sequência de primer (Tabela 3).
  4. Colete dados quantitativos de PCR de fluorescência em tempo real, calcule e analise os resultados usando o algoritmo qPCR (método 2-ΔΔCt).

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Resultados

Após a administração contínua de IMQ, os camundongos do grupo IMQ apresentaram sintomas clínicos de pele nas costas que lembram psoríase (Figura 4), com a área induzida por IMQ apresentando os sintomas típicos de eritema, escamas e espessura (Figura 5). Em contraste, o grupo controle não apresentou nenhum sintoma semelhante aos do grupo IMQ. Em comparação com o grupo controle, eritema e escamas menores começaram a surgir no grupo IMQ a partir do dia 3 (

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Discussão

Nossa pesquisa utiliza o IMQ para induzir lesões cutâneas semelhantes à psoríase, construindo assim um modelo de psoríase. Este modelo pode ser usado para estudar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da psoríase e fornecer informações para o desenvolvimento de tratamentos para a doença. No estudo de van der Fits7, ao administrar inicialmente a indução do IMQ, o tempo de indução foi fixado em 5 ou 6 dias. No entanto, Jabeen et al. sugeriram que a gravidade ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da China (NSFC) para Guanyi Wu (82060768), Fundação de Ciências Naturais da Região Autônoma de Guangxi Zhuang para Região Autônoma de Guanyi Wu (2020GXNSFAA297244); Projeto de Financiamento de Talentos de Alto Nível da Medicina Tradicional Chinesa de Guipai da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi; o Segundo Lote do Projeto de Cultivo de Equipe de Talentos de Alto Nível "Projeto Qihuang" da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guangxi (2024002).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5% Imiquimod CremeSichuan Medshine Pharmaceutical Co.
75% EtanolXUE HUAN20240401
Balança AnalíticasartoriusSQP
Creme DepilatórioReckitt Benckiser20240612 08X
Balança EletrônicaYingheng Technology7915
Papel de Seda MédicoJD20221208
BarbeadorHORD shenjianAUX-C6S
Cotonete de algodão esterilizadoBeilun River20230728
40220602

Referências

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