Um novo método de fixação para tratamento de acupuntura em ratos

Resumo

Aqui, descrevemos um novo método de fixação de ratos que facilita a acupuntura e a moxabustão nas costas dos ratos.

Resumo

Os pesquisadores sempre encontram o problema de que os animais são difíceis de controlar em experimentos com animais relacionados à acupuntura. Já existem alguns métodos para evitar que os animais escapem dos locais de tratamento. No entanto, o efeito desses métodos de fixação é diferente do estado de tratamento humano. Portanto, inventamos um novo método de fixação para manter os ratos propensos, quietos e acordados durante o tratamento.

O equipamento consiste em uma plataforma de contenção de plástico poroso, um pano quadrado de algodão e várias tiras de contenção para fixação de ratos. Primeiro, rosqueie as correias de retenção na plataforma de retenção. Para cada alça, passe-a por dois orifícios na mesma fileira, deixando dois orifícios entre eles. Depois de posicionar a primeira alça, insira a outra alça na plataforma da mesma maneira, garantindo um espaço de quatro fileiras entre as duas alças. Em segundo lugar, agarre a cauda do rato e guie-o para o canal formado por duas tiras de contenção. Cubra a cabeça do rato com um pano quadrado de algodão. Terceiro, aperte a alça de contenção no pescoço para fixar a cabeça e os membros anteriores. Em seguida, segure os membros posteriores do rato e aperte a outra alça para fixar a cintura e os membros posteriores.

Este método não requer anestesia. O dispositivo é simples e fácil de operar. Para avaliar sua eficácia e segurança, administramos o procedimento em 60 ratos. Todos eles completaram o tratamento de acupuntura sem complicações. Enquanto 14 ratos exibiram breves períodos de luta durante o procedimento, nenhum efeito adverso foi observado. Os resultados demonstram que o método é eficaz e seguro para uso.

Introdução

Tanto a modelagem cirúrgica quanto a intervenção in vitro requerem métodos adequados de fixação animal. Isso garante que os animais estejam na posição mais manobrável e relativamente confortável. Nós nos concentramos no método de fixação animal para intervenção de acupuntura. A acupuntura é eficaz no tratamento de muitas doenças ^1,2. O estudo do mecanismo de acupuntura tem recebido muita atenção. Atualmente, a acupuntura e a moxabustão são tópicos de pesquisa importantes no país e no exterior. O mecanismo patológico do tratamento com acupuntura precisa ser mais explorado e, além de experimentos clínicos, também é necessário o apoio básico^{à pesquisa 3,4}. Na pesquisa básica sobre acupuntura e moxabustão, a fixação animal é um passo técnico importante.

Atualmente, os métodos de fixação comumente usados incluem bondage, anestesia, balanço, plataforma alta e outros métodos de fixação. As vantagens e desvantagens desses métodos são descritas abaixo.

O primeiro passo para realizar o método de fixação anestésica é anestesiar os ratos. Ao usar esse método, os pesquisadores correm o risco de que os ratos morram. Também é possível operar diretamente sem restrições após a anestesia⁵. Ao usar o método de fixação da plataforma meia-coelho, os pesquisadores inserem a cabeça do rato em uma meia aparada, estendem seus membros anteriores pelos orifícios e prendem as pernas à plataforma do coelho com elásticos. Este método facilita a seleção do ponto de acupuntura nos membros. Os pesquisadores devem aparar a meia de acordo com o local da acupuntura, mas o procedimento é um tanto complexo⁶. Alguns pesquisadores desenvolveram um dispositivo de fixação de moxabustão composto por três partes: assento de fixação, clipe de fixação e suporte de moxa-stick. Este dispositivo permite que os pesquisadores realizem moxabustão em vários pontos de acupuntura simultaneamente, mantendo uma temperatura relativamente constante. No entanto, o estado fixo desse método difere significativamente do tratamento clínico em humanos⁷. Envolver os ratos com um pano e suspendê-los com grampos pode reduzir significativamente a influência da contenção. No entanto, o pano suspenso precisa ser cortado com antecedência para expor os pontos de acupuntura, o que torna inconveniente a exposição do local de tratamento⁸. Alguns pesquisadores usam tiras, cordas e uma pequena jaqueta com uma tira de Velcro autotravante para prender os ratos em uma cobertura de gaiola semelhante a uma malha. O dispositivo oferece baixos custos de produção, alta praticidade e operação simples. Mas é necessária mais de uma pessoa para concluir o processo de contenção⁹. Alguns pesquisadores constroem um cilindro de sustentação do corpo com tela de arame, prendem as pernas dos ratos com grampos de retenção e fixam seus pescoços usando uma vara de sustentação. Este método fornece uma restrição firme. Usando esse método, os pesquisadores podem operar melhor em ratos porque os pontos de acupuntura em todo o corpo estão expostos. O problema é que o cilindro pode ser incompatível com o tamanho do rato. Além disso, esse método aplica mais estresse em comparação com outras técnicas, de modo que os ratos podem ser mais suscetíveis à asfixia¹⁰. O método de fixação de alta plataforma aproveita o medo de altura dos ratos. Os pesquisadores colocam ratos no pedal da plataforma alta a 50 cm acima do solo. Os ratos permanecem em uma posição prona natural sem a necessidade de restrições adicionais. Este método permite agulhar a cabeça e as costas dos ratos. Este método simula autenticamente o ambiente de tratamento, de modo que os resultados experimentais têm bom valor de referência. Como os ratos temem altura, seu estado mental se torna anormal quando colocados em tais altitudes. Isso torna o método inadequado para pesquisas sobre doenças mentais e pode influenciar os resultados experimentais¹¹. Alguns pesquisadores usam uma plataforma de contenção ajustável e tiras para fixar ratos, expondo uma grande área de tratamento. No entanto, replicar o cenário clínico permanece desafiador¹².

Há uma necessidade urgente de abordar a questão de que os métodos de fixação não podem simular com precisão as condições de tratamento clínico. Fizemos todos os esforços para replicar as condições do tratamento clínico humano. O método descrito neste artigo se enquadra na categoria de método de bondage. O equipamento utilizado neste método inclui uma plataforma de contenção e correias de contenção, juntamente com um pano de algodão para auxiliar no procedimento. O equipamento é relativamente simples de operar. Comparado com outros métodos, este método expõe melhor os pontos de acupuntura nas costas dos ratos e aumenta a eficiência do tratamento.

Para testar a confiabilidade do dispositivo, um total de 60 ratos foram usados para o experimento. Todos os 60 ratos foram divididos em dois grupos, cada um contendo 30 ratos: o grupo de eletroacupuntura e o grupo de acupuntura quente. Os ratos permaneceram calmos durante o processo de tratamento e seu movimento teve impacto mínimo no procedimento. No grupo de eletroacupuntura, 22 ratos completaram o tratamento com calma, sem esforço. Um total de 8 ratos lutaram durante a operação e 6 desalojaram as agulhas. Um total de 24 ratos no grupo de acupuntura quente permaneceram calmos durante o tratamento. Os outros 6 ratos exibiram comportamento de luta, mas nenhum desalojou as bolas de moxa. Esses ratos que lutaram também puderam se acalmar depois de serem cobertos e confortados. Por fim, todos os ratos completaram o tratamento com sucesso.

Protocolo

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82205287). Os protocolos experimentais utilizados neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética para Experimentação e Uso Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (No BUCM-2024052704-2223) antes da realização dos experimentos. Todos os procedimentos demonstrados devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

Os detalhes do equipamento usado no estudo estão listados na Tabela de Materiais. O protocolo pode ser dividido em quatro seções: preparação do experimento, processo de fixação, operação de tratamento e desmontagem do equipamento.

1. Preparação do experimento (Figura 1)

1. Prepare a plataforma de retenção de plástico poroso. A plataforma de retenção tem 500 mm de comprimento, 300 mm de largura e 5 mm de altura. O orifício tem 7 mm de comprimento e 3,2 mm de largura. A distância entre dois furos adjacentes é de 7 mm. Este equipamento serve como plataforma para fixação de ratos.
2. Prepare as correias de retenção. Cada cinta de retenção mede 300 mm de comprimento e 4,8 mm de largura. As correias de contenção são serrilhadas e possuem uma fivela na ponta, que pode ser travada após a inserção.
3. Mantenha um pano de algodão quadrado pronto. O pano de algodão quadrado mede 30 cm e 30 cm. Use isso para bloquear a visão dos animais experimentais.
4. Prepare o instrumento de eletroacupuntura. Empregue este dispositivo para realizar procedimentos de eletroacupuntura.
5. Prepare as agulhas de acupuntura (0,25 mm de diâmetro e 25 mm de comprimento).
6. Mantenha um par de luvas de látex de laboratório disponíveis. Essas luvas constituem a medida de proteção fundamental do experimento.
7. Mantenha um par de luvas anti-corte disponíveis, projetadas para proteger os pesquisadores de picadas de ratos durante o experimento.
8. Use moxa para criar bolas de moxa com um diâmetro de 5 mm, que são utilizadas para terapia de moxabustão subsequente.
9. Para evitar queimaduras dos ratos, corte alguns papéis quadrados medindo 2 cm 2 cm.
10. Mantenha a gaze estéril pronta para ser aplicada para envolver a cauda do rato, garantindo a condutividade elétrica durante o tratamento com eletroacupuntura.
11. Preparação antes da fixação: Antes de manusear os ratos, use luvas de látex de laboratório e luvas anti-corte para evitar ser mordido por ratos.

Figura 1: Dispositivos necessários para a operação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Processo de fixação

1. Passe duas tiras de retenção pela plataforma de retenção. Insira cada alça por meio de dois orifícios na mesma linha, espaçando dois orifícios, com as tiras separadas por quatro fileiras uma da outra. Esse espaçamento corresponde ao diâmetro corporal do rato, restringindo o movimento lateral durante o tratamento (Figura 2). Ajuste a distância com base na forma dos ratos e nos locais de tratamento, conforme necessário.
2. Segure a cauda do rato com uma mão. O rato se moverá instintivamente para frente (Figura 3A).
3. Posicione o rato na entrada do canal formado por duas tiras de contenção. O rato perfurará o canal sozinho (Figura 3B).
4. Cubra a cabeça do rato com um pano quadrado de algodão e use a mesma mão para segurar o pescoço do rato. Segure a cauda e os membros posteriores do rato com a outra mão. Este método garante que a postura do rato seja mantida (Figura 3C).
5. Use a mão segurando o lado da cabeça para pressionar suavemente a cabeça e o pescoço do rato. Use a outra mão para inserir a alça de retenção na fivela e aperte-a. Certifique-se de que a cinta de retenção esteja localizada no lado da cauda da cabeça e nos membros anteriores para restringir o movimento de sua cabeça (Figura 3D, E).
6. Segure a cauda do rato com uma mão. Certifique-se de que a cinta de contenção esteja localizada na frente dos membros posteriores do rato. Em seguida, aperte a fivela para restringir o movimento da cintura (Figura 3F). O rato contido é mostrado na Figura 3G.
7. Ao realizar acupuntura em ratos, este método de fixação garante estabilidade durante o tratamento. Se o rato ainda tiver dificuldades severas, cubra suavemente a cabeça com o pano. Proteger todo o seu campo de visão e mantê-lo em um ambiente escuro pode acalmar o rato.
   1. Escolha DU20, BL17 e BL23 como exemplos. A seleção dessa distância de fixação expõe melhor os pontos de acupuntura: DU20 está no meio de sua cabeça, BL17 está entre as duas tiras de contenção e BL23 está no lado da cauda da alça de contenção, apertando a cintura do rato.
   2. Gire a agulha nos pontos de acupuntura (Figura 4A). O rato que completa o tratamento com acupuntura é mostrado na Figura 4B, C.

Figura 2: Montagem da plataforma de retenção e da cinta de retenção. A plataforma de retenção com as correias de retenção inseridas é mostrada na figura. Cada cinta é inserida através de dois orifícios na mesma fileira, espaçando dois orifícios, com as tiras separadas por quatro fileiras uma da outra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O processo de fixação de um rato. (A) Segure a cauda do rato. (B) Deixe o rato fugir para o canal. (C) Cubra a cabeça do rato com um pano de algodão. Pressione seu pescoço e agarre sua cauda e membros posteriores. (D, E) Aperte a alça nas costas. (F, G) Aperte a alça em sua cintura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Operação de acupuntura em um rato. DU20, BL17 e BL23 foram escolhidos como pontos de acupuntura para este procedimento de acupuntura. (A) Gire a agulha nos pontos de acupuntura. (B, C) O rato que completa o tratamento é mostrado aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Tratamento de eletroacupuntura

1. Conecte o instrumento de eletroacupuntura após concluir a acupuntura. Ligue o dispositivo de eletroacupuntura, pressione o botão de onda contínua para selecionar a forma de estimulação elétrica e gire o botão para ajustar a intensidade da corrente para 1 mA e a frequência para 2 Hz (Figura 5A).
2. Tomando DU20, BL17 e BL23 como exemplo, conecte três pares de eletrodos conforme mostrado na Figura 5. Especificamente, conecte BL17 e BL23 no mesmo lado de um par (Figura 5B, C). Conecte a cauda, envolta em gaze embebida em solução salina, ao DU20 na cabeça (Figura 5D, E). A direção do fluxo de corrente é consistente entre os três pares de eletrodos.
3. Gire o botão de ajuste de tempo para definir a duração do tratamento para 15 min.

Figura 5: Operação de eletroacupuntura em um rato. (A) Defina o parâmetro para onda contínua e ajuste a intensidade da corrente e a frequência. (B, C) Emparelhe BL17 e BL23 do mesmo lado. (D, E) Enrole a cauda com gaze embebida em solução salina e conecte-a ao DU20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Tratamento quente da acupuntura

1. Prepare estes itens se for necessário tratamento de acupuntura quente: moxa, agulha de acupuntura (0,25 mm × 25 mm, igual à usada anteriormente) e várias folhas quadradas de papel. Além disso, prepare algumas bolas de moxa com antecedência antes do início do tratamento (Figura 1).
2. Pegue um pedaço de papel quadrado e use cuidadosamente uma agulha para perfurar o ponto central do papel (Figura 6A). Em seguida, insira a agulha no ponto de acupuntura designado (Figura 6B).
   NOTA: Para fins ilustrativos, este estudo selecionou o ponto de acupuntura BL23.
3. Coloque cuidadosamente as bolas de moxa na agulha e acenda-as (Figura 6C-E).

Figura 6: Operação de acupuntura quente em um rato. (A) Pegue um papel quadrado e perfure seu centro com uma agulha. (B) Insira agulhas nos pontos de acupuntura. (C) Coloque as bolas de moxa nas agulhas. (D, E) O rato que completa o tratamento é mostrado aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Desmontagem do equipamento

1. Desmontagem do equipamento de eletroacupuntura
   1. Após a conclusão do tratamento de eletroacupuntura, desligue o instrumento de eletroacupuntura. Em seguida, solte cuidadosamente o clipe do eletrodo das agulhas de acupuntura. Finalmente, retire suavemente as agulhas de acupuntura da área de tratamento.
2. Desmontagem do equipamento de acupuntura quente
   1. Após o tratamento de acupuntura quente, remova cuidadosamente as cinzas das bolas de moxa e descarte-as colocando-as na água. Em seguida, retire as agulhas com cuidado e remova todos os papéis anexados.
3. Desmontagem do equipamento de fixação
   1. Cubra a cabeça do rato com um pano quadrado de algodão enquanto relaxa simultaneamente as tiras de contenção. Afrouxe a cinta de contenção, apertando a cintura do rato primeiro. Em seguida, segure firmemente os membros posteriores e a área do quadril do rato com uma mão.
   2. Solte a alça apertando o pescoço do rato com a outra mão e, em seguida, puxe suavemente o rato para fora da alça de contenção segurando sua cauda.

Resultados

Para avaliar a eficácia do método de fixação, realizamos um estudo em um total de 60 ratos, que foram divididos em dois grupos: 30 ratos no grupo de eletroacupuntura e 30 ratos no grupo de acupuntura quente. As operações de tratamento incluíram eletroacupuntura e acupuntura quente, respectivamente.

Depois de inserir agulhas nos pontos de acupuntura, o acupunturista realizou manipulações de levantamento, impulso e rotação em cada agulha para atingir o deqi. Dur...

Discussão

Os ratos tendem a habitar ambientes escuros. Eles se sentem seguros quando abrigados e respondem com calma aos estímulos, exibindo níveis mais baixos de estresse. O método descrito aqui aproveita essas características do rato. As vantagens deste método de fixação podem ser resumidas da seguinte forma: (i) Este método pode minimizar a resposta ao estresse e a dor experimentada por animais experimentais. Ele se alinha com os princípios 3R da ética animal, ou seja, Redução, Refinamento e Su...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulhas de acupuntura	Beijing ZhongYan TaiHe Medical Instrument Co., Ltd.	20222200133	As especificações das agulhas de acupuntura são de 0,25 mm de diâmetro e 25 mm de comprimento.
Luvas anti-corte	Lvdazhou Fábrica de Produtos de Proteção do Trabalho no distrito de Lanshan, cidade de Linyi	H0315103941	Projetado para proteger os pesquisadores de mordidas de ratos durante o experimento.
Instrumento de eletroacupuntura	Suzhou Medical Appliance Factory Ltd.	20172200675	Este dispositivo é empregado para realizar procedimentos de eletroacupuntura.
Luvas de látex de grau laboratorial	Zhonghong Pulin Medical Products Co., Ltd.	268237719221	Estas luvas constituem a medida de protecção fundamental da experiência.
Moxa	Beijing Tongrentang Xing'an Health Technology Co., Ltd.	152200000000613	Moxa serve como material para a fabricação de bolas de moxa com diâmetro de 5 mm, que são utilizadas para terapia de moxabustão subsequente.
Plataforma de contenção de plástico poroso	Chuzhou Huaxin VinyIIndustry Co., Ltd.	341124000005877	A plataforma de retenção tem 500 mm de comprimento, 300 mm de largura e 5 mm de altura. O orifício tem 7 mm de comprimento e 3,2 mm de largura. A distância entre dois furos adjacentes é de 7 mm. Este equipamento serve como plataforma para fixação de ratos.
Correias de contenção	Zhejiang Litai Plastic Co., Ltd.	331003000001553	Cada cinta de retenção mede 300 mm de comprimento e 4,8 mm de largura. A cinta de contenção é serrilhada e possui uma fivela na ponta, que pode ser travada após a inserção.
Pano de algodão quadrado	MUJI (SHANGHAI) Company Limited	WYLP20241105_1	O pano de algodão quadrado mede 30 cm & 30 cm. É usado para bloquear a visão dos animais experimentais.
Papéis quadrados	DELI Group Co., Ltd.	7752-1114	Para evitar a escaldagem dos ratos, os pesquisadores cortaram alguns papéis quadrados com especificação medindo 2 cm e 2 cm.
Gaze estéril	Jiangxi Zhonggan Medical Devices Co., Ltd.	20172140084	A gaze estéril é aplicada para envolver a cauda do rato, garantindo a condutividade elétrica durante o tratamento com eletroacupuntura.