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Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Erratum Notice

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Summary

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Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Abstract

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Os materiais baseados em citoesqueleto de actina são amplamente investigados como materiais celulares modelo para elucidar mecanismos físicos da mecânica celular, como regulação da forma e produção de força, bem como materiais poliméricos macios intrigantes. Neste método, detalhamos a criação de montagens à base de actina in vitro usando proteína purificada para estudos de microscopia de fluorescência. Polimerizamos longos filamentos de actina em uma câmara de amostra e usamos um polímero esgotado para aglomerar os filamentos em uma rede bidimensional (2D) emaranhada contra uma superfície passivada com uma camada de surfactante. A adição de filamentos de miosina II do músculo esquelético na presença de trifosfato de adenosina (ATP) induz a contração da rede de actina. Ao agrupar filamentos de actina com um reticulador, ajustamos a contratilidade do conjunto, passando de um material que se dobra para um material que desliza em microescala. Ao reduzir o comprimento dos filamentos de actina por meio da copolimerização da actina na presença de proteína de capeamento, ajustamos o material de uma rede 2D para um cristal líquido. A reticulação de filamentos de actina curtos dispersos resulta na formação de gotículas de cristal líquido tridimensional (3D).

Introduction

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Os materiais biológicos ativos estão subjacentes aos processos mecânicos em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo transporte intracelular, migração celular, regulação da forma celular e geração de força biológica 1,2,3. Montagens in vitro de sistemas citoesqueléticos, construídos a partir de componentes proteicos purificados e projetados auto-montados em tampão, são uma ferramenta estabelecida para caracterizar processos biofísicos e bioquímicos fundamentais 4,5,6,7. Esses sistemas de modelo simplificados permitem que as proteínas sejam estudadas sem a complexidade dos ambientes celulares, permitindo que os papéis de componentes individuais sejam identificados. Além de apoiar estudos biológicos fundamentais, os conjuntos de citoesqueletos in vitro também são amplamente desenvolvidos como sistemas experimentais para investigar materiais cristalinos líquidos e ativos ou fora de equilíbrio 8,9,10,11,12,13,14,15.

A actina é um biopolímero chave nas montagens do citoesqueleto, regulando a mecânica e a dinâmica celular por meio de forças motoras e impulsionadas pela polimerização 3,16. Experimentos de microscopia de fluorescência permitem a visualização de mudanças estruturais na rede de actina durante processos como contração motora e agrupamento de actina por proteínas de reticulação. A imagem de redes tridimensionais de actina à medida que são remodeladas por proteínas motoras incorporadas iluminou o papel dos reticuladores de actina para a contração da rede e a formação de padrões12 , 17 , 18 , 19 . No entanto, as redes de actina quase bidimensionais superam os desafios na imagem com resolução espaço-temporal suficiente para capturar as mudanças estruturais da rede. Além disso, estruturas de actina de alta densidade e quase bidimensionais são uma imitação mais próxima de conjuntos celulares, como o denso córtex de actina de uma célula20. As estratégias para produzir estruturas de actina quase bidimensionais incluíram a ligação de proteínas nucleadoras de actina a uma lamínula21,22, acoplamento de actina a uma superfície por meio de moléculas ligantes 10,23,24, formação de feixes densos de actina ligados a grânulos em uma superfície de lamínula 25,26 e concentração de filamentos de actina em uma superfície de lamínula com agentes de aglomeração molecular10,27.

Aqui, detalhamos um método para criar montagens baseadas em actina de modelo reproduzível e como modificá-lo para preparar variações de redes ativas para cristais líquidos quase 2D e gotículas nemáticas. Anteriormente, usamos métodos semelhantes para estudar a formação de gotículas cristalinas líquidas separadas por fase de filamentos curtos de actina com adição de reticulador11, mudanças nos modos de deformação da rede de actina gerados por miosina II (por exemplo, flambagem do filamento ou deslizamento relativo) com reticulação e conectividade do filamento28, diferenças nas forças geradas pela miosina II em feixes de actina com espaçamento e complacência variados29, e transporte de miosina II30. O uso de proteínas de reticulação e proteínas de capeamento de actina permite a variação sistemática do comprimento do filamento de actina e da arquitetura de montagem.

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Protocol

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NOTA: Proteínas e rotulagem: Para os fins deste protocolo, presume-se que o pesquisador comece com estoques de proteínas purificadas, que são marcadas com fluorescência quando apropriadas para investigação de microscopia de fluorescência. Essas proteínas podem ser compradas ou purificadas e marcadas com fluorescência no laboratório 31,32,33,34,35,36,37. Neste protocolo, foram utilizados estoques de proteínas que foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. As proteínas normalmente podem ser rotuladas por meio de métodos semelhantes. A proteína pode ser rotulada como uma etapa de purificação ou de um estoque congelado. Descongele os estoques de proteína congelada no gelo antes de prosseguir com a rotulagem. O seguinte é um método para marcar fluorescentemente a miosina II do músculo esquelético (miosina) com um fluoróforo funcionalizado por maleimida (adaptado de38).

1. Prepare miosina marcada com fluorescência

  1. Comece com ~ 2 mL de miosina a uma concentração de 5-10 mg / mL.
    NOTA: Neste protocolo, foi utilizada miosina II do músculo esquelético purificada do músculo de galinha usando métodos publicados35 . A miosina é armazenada em tampão de armazenamento de miosina (25 mM KPO4, 0,6 M KCl, 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM de ditiotreitol (DTT), pH 6,6), diretamente após a purificação ou de estoque congelado. É importante manter a miosina fria o tempo todo para evitar a perda de atividade motora.
  2. Adicionar TDT à solução de miosina descongelada até uma concentração final de 10 mM. Use uma solução de estoque 1 M DTT para limitar o volume.
    NOTA: A TDT reduz o grupo tiol nas cisteínas na proteína miosina, preparando-as para reagir com a maleimida para marcação.
  3. Para evitar interferência na reação de marcação, remova o TDT dialisando durante a noite em HEPES 50 mM, KCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,6, a 4 ° C.
  4. Após a diálise, centrifugue a solução de miosina a 100.000 x g a 4 °C por 15 min para peletizar quaisquer agregados. Colete o sobrenadante.
  5. Determinar a concentração de miosina no sobrenadante utilizando um espectrofotómetro. Estime a concentração de miosina usando um coeficiente de extinção a 280 nm de ~ 148.000 M-1 cm-1 para miosina do músculo esquelético38. Esse coeficiente de extinção pressupõe que um "monômero" consista em uma cadeia pesada, uma cadeia leve essencial e uma cadeia leve regulatória.
  6. Prepare o fluoróforo para a reação de marcação ressuspendendo o fluoróforo em pó em dimetilsulfóxido seco (DMSO) a uma concentração de 5 mM de fluoróforo.
    NOTA: Qualquer fluoróforo com um grupo reativo à maleimida deve funcionar. Alexa 647 maleimida foi usada. O DMSO é higroscópico e acumula água. DMSO "seco" refere-se ao DMSO que foi armazenado em um ambiente para evitar o acúmulo de água. Para garantir que o solvente esteja seco com DMSO, uma ampola recém-aberta de DMSO foi usada para esta etapa. Não coloque soluções DMSO no gelo. O DMSO tem um ponto de fusão de 19 °C, portanto, deve estar em temperatura ambiente (ou um pouco mais quente) para pipetar39.
    CUIDADO: O DMSO pode penetrar nas luvas, por isso é uma boa prática usar luvas duplas de nitrilo e tomar cuidado para evitar derramamentos.
  7. Para preparar a miosina para adicionar fluoróforo, retire brevemente a solução de miosina do gelo e deixe-a aquecer até a temperatura ambiente (TR).
    NOTA: Não deixe a miosina em RT por mais tempo do que o necessário. Execute esta etapa depois que o fluoróforo estiver suspenso no DMSO.
  8. Assim que a solução de miosina estiver próxima de RT, adicione a solução de fluoróforo à miosina e misture rapidamente de modo que haja uma proporção molar de 5: 1 de fluoróforo: miosina. Coloque a solução de miosina no gelo assim que for misturada com o fluoróforo.
  9. Incubar em gelo durante 1 h, protegido da luz, e depois parar a reação adicionando TDT a uma concentração de 1 mM. Use um estoque de 1 M TDT para minimizar o volume adicionado.
  10. Remova os fluoróforos que não reagiram. Use um dos dois métodos descritos abaixo:
    1. Opção 1:
      1. Polimerizar a miosina diluindo-a lentamente em um tampão F (10 mM de Imidazol, 50 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de EGTA, 4 mM de ATP, pH 7,5). Isso é aproximadamente uma diluição de 10x, dependendo do volume de corante adicionado na etapa 1.8.
      2. Incubar no gelo por 20 min. Gire a 8.000 x g em uma centrífuga refrigerada a 4 ° C por 10 min para granular.
      3. Descarte o sobrenadante contendo corante livre e ressuspenda/despolimerize a miosina com tampão de armazenamento de miosina (da Etapa 1). Para remover qualquer corante restante, dialise em 5 mM de ácido 2-[4-(2-sulfoetil)piperazin-1-il]etanossulfônico (PIPES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (excesso de volume de >100 vezes) três vezes por 15 min cada usando um copo de diálise de corte de 10 kD.
    2. Opção 2:
      1. Use uma coluna de dessalinização para troca de tampão em PIPES de 5 mM, KCl de 0,45 M, pH 7,0, com o protocolo padrão do fabricante da coluna.
  11. Estimar a relação fluoróforo/proteína medindo a concentração de miosina e de fluoróforo com um espectrofotómetro, utilizando coeficientes de extinção para a miosina a 280 nm e para o fluoróforo comunicados pelo fabricante. Uma proporção de 2-4 é típica.
    NOTA: A miosina marcada está agora pronta para alíquotas de congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. As alíquotas são armazenadas a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

2. Opcional: Procedimento para remover a miosina inativa

NOTA: A miosina pode ser usada diretamente de uma alíquota descongelada em experimentos, mas alguma fração da miosina ficará inativa. O procedimento a seguir descreve como remover a miosina inativa. Esta é uma etapa opcional, mas pode ser crucial para a reprodutibilidade. As alíquotas de miosina são utilizadas durante cerca de 3 dias após a descongelação, conservadas a 4 °C ou em gelo.

  1. Polimerizar actina estabilizada com faloidina não marcada:
    1. Misture 10 μL de tampão F 10x, 1 μL de ATP 100 mM e ddH2O de modo que o volume final (incluindo actina na etapa 2.1.2) seja de 100 μL em um tubo de microcentrífuga.
    2. Adicione monômero de actina a uma concentração final de 20 μM e misture a pipeta.
    3. Para estabilizar os filamentos de actina, adicione faloidina a uma concentração final de 6,7 μM usando um estoque de 100 μM de faloidina em mistura de metanol e pipeta.
      CUIDADO: A faloidina é uma toxina40. Evite derramamentos e contaminação.
    4. Incube no gelo por 20 min para permitir que a actina polimerize. Após a polimerização, conservar a actina a 4 °C para futuras centrifugações.
  2. A pipeta mistura 10 μL de actina estabilizada com faloidina, 3 μL de tampão F 10x, 0,3 μL de ATP 100 mM, 6 μL de KCl 2 M e ddH2O para um volume final de 30 μL (incluindo o volume associado à adição de miosina na próxima etapa) em um tubo de microcentrífuga em gelo.
  3. Adicione miosina marcada dimérica do estoque preparado à concentração desejada, mantendo uma proporção molar de miosina para actina de ≤ 1: 6.
  4. Centrifugue a solução resultante a frio (4 °C) a 100.000 x g durante 30 min. A miosina inativa se ligará aos filamentos de actina e permanecerá ligada. Os filamentos inativos de miosina e actina formarão um pellet durante a centrifugação.
  5. Remover o sobrenadante (contendo miosina activa) e conservá-lo a 4 °C para utilização em experiências.
  6. Estime a concentração de miosina usando o mesmo método espectrofotométrico para medir a concentração de miosina após a marcação.
    NOTA: Nas concentrações de proteína e ATP que permanecem no sobrenadante, o pico de absorbância de 280 nm é obscurecido pelo pico de absorbância de ATP de 260 nm, portanto, medir a concentração através da absorbância associada ao fluoróforo ou uma medição de fluorescência relativa é mais preciso.

3. Prepare a solução surfactante

NOTA: A solução de surfactante também pode ser adquirida pré-misturada e pronta para uso.

  1. Comece com um frasco de vidro limpo. Enxágue o frasco em água e etanol para remover possíveis contaminantes no óleo, que é um solvente para o surfactante. Use frascos de vidro borossilicato com uma tampa revestida de politetrafluoretileno (PTFE).
  2. Pegue 5-20 mg de fluorosurfactante usando uma ponta de pipeta e deposite perto do fundo de um frasco de vidro. Meça a quantidade de surfactante por peso usando uma balança com precisão de submiligramas.
  3. Pipetar o volume apropriado de óleo fluorado para fazer uma solução de 2% em peso e feche o frasco.
    NOTA: O óleo é volátil, portanto, feche o frasco imediatamente após a medição.
  4. Vórtice em baixa velocidade para misturar.
    NOTA: A solução pode agora ser conservada a 4 °C durante algumas semanas. A idade e a qualidade do surfactante podem influenciar tanto o apinhamento quanto a aparência da actina. A actina que parece salpicada, aderida à superfície ou não se aglomera na superfície pode indicar que uma solução surfactante nova é necessária. O armazenamento sob gás nitrogênio pode melhorar a vida útil.

4. Prepare a câmara de amostra (três opções)

NOTA: Esta seção fornece um procedimento para construir três câmaras de amostra padrão usadas para preparar amostras para microscopia. As duas seções a seguir cobrem a preparação da amostra real e a passivação da câmara de amostra para carregamento da amostra.

  1. Opção 1: Flowcell
    NOTA: Uma célula de fluxo simples é uma maneira padrão de fazer amostras de microscópio em muitos laboratórios. Para este protocolo, é particularmente adequado para as amostras envoltas em gotas de emulsão. Pode ser difícil obter campos de visão grandes e planos com o revestimento de superfície do surfactante descrito neste protocolo, portanto, para amostras 2D, as opções 2 e 3 geralmente são mais reprodutíveis. A geometria do canal também pode causar mistura desigual de componentes adicionados posteriormente, como a miosina.
    1. Coloque 2 pedaços de fita dupla face paralelos um ao outro na largura da lâmina do microscópio para formar os limites do canal da célula de fluxo. O canal formado entre os dois pedaços de fita deve ter aproximadamente 2 mm de largura.
      NOTA: Canais menores ajudam a evitar que as emulsões fiquem presas na parte inicial do canal. Para fazer uma boa vedação, use pedaços de fita adesiva um pouco maiores que a largura da lâmina de vidro e apare depois de construir a célula de fluxo.
    2. Coloque a lamínula sobre o canal da fita. Certifique-se de que a lamínula esteja perpendicular à lâmina do microscópio. Use uma lamínula de 30 mm x 40 mm para essa finalidade, pois ela fornece uma pequena saliência quando colocada em um slide.
    3. Para criar uma boa vedação e eliminar bolsas de ar entre a fita e a lamínula, pressione a área da lamínula que está em contato com a fita dupla-face.
      NOTA: Tenha cuidado para não quebrar a lamínula enquanto pressiona nas bordas. Esfregar a área com um objeto arredondado, como a ponta de um marcador com tampa, funciona bem para pressionar a fita.
    4. Usando uma lâmina de barbear, corte o excesso de fita da lâmina do microscópio e da lamínula, de modo que a única fita visível fique dentro do canal de amostra.
      NOTA: Tenha cuidado ao concluir esta etapa, pois é fácil quebrar acidentalmente a lamínula ao tentar remover a fita.
  2. Opção 2: Cilindro em uma lamínula não tratada
    NOTA: Esta opção é adequada para amostras planares 2D. É conveniente para adicionar componentes em momentos diferentes durante experimentos de microscopia. Esta câmara de amostra não deve ser usada para emulsões, que cremem em vez de sedimentos, dificultando a imagem.
    1. Enxágue a lamínula e o cilindro de clonagem de vidro com água, etanol e água. Secar ao ar.
    2. Usando uma fina camada de epóxi de 5 minutos, cole o cilindro de clonagem de vidro na lamínula.
      NOTA: É útil aplicar força ao cilindro enquanto o epóxi seca, colocando um objeto limpo em cima do cilindro. Uma pequena tampa de placa de Petri ou a caixa de lamínula podem funcionar bem.
  3. Opção 3: Cilindro em uma lamínula revestida com silano
    NOTA: Esta opção resulta de forma reprodutível em uma região plana grande no centro da câmara e reduz o fluxo em massa da amostra. Para conseguir isso, foi criada uma região hidrofóbica que é cercada por uma região hidrofílica na lamínula, o que resulta em uma amostra final que possui uma rede de actina em uma região passivada e confinada onde a actina está ancorada nas regiões hidrofílicas na borda da câmara. Esta câmara de amostra não deve ser usada para emulsões, que cremes em vez de sedimentos no tampão, dificultando a imagem.
    1. Prepare lamínulas com um revestimento de silano para torná-las hidrofóbicas.
      1. Coloque lamínulas de vidro limpas em um rack de aço inoxidável. Pré-limpe o vidro por sonicação em detergente ou etanol, se desejar.
      2. Em uma mancha de vidro, dilua o trimetoxi (octil) silano para uma solução a 2% em isopropanol.
      3. Mergulhe as lamínulas na solução por 10 min.
      4. Para enxaguar, substitua a solução por água. Levante e mergulhe novamente os suportes de lamínula seis vezes. Repita o processo mais quatro vezes com trocas de água entre elas.
      5. Cubra as prateleiras com papel alumínio para proteger as lamínulas da poeira e seque-as a 25-30 °C.
    2. Coloque uma lamínula tratada com octil-silano no fundo de uma placa de Petri de vidro ou qualquer outro recipiente de vidro aberto que caiba no limpador de ozônio ultravioleta (UV).
    3. Usando uma pinça, coloque um quadrado de PTFE de 2 mm x 2 mm (cortado de uma folha) na lamínula que funcionará como uma máscara para o tratamento de ozônio UV seguinte.
    4. Trate a lamínula com UV-ozônio por 10 min. Este processo torna o vidro hidrofílico nas regiões expostas que não são cobertas pela máscara de PTFE.
    5. Remova cuidadosamente o prato sem perturbar a lamínula ou o quadrado de PTFE. Cole um cilindro de clonagem de vidro na lamínula usando epóxi de 5 minutos. Certifique-se de que o cilindro circunda o quadrado de PTFE, que pode ser removido com uma pinça após a secagem do epóxi.
      NOTA: O quadrado de PTFE pode ser reutilizado em experimentos futuros.

5. Montagem da rede de actina

NOTA: O seguinte é para a preparação de uma amostra de 50 μL. Para amostras de cilindro, um volume maior pode reduzir os efeitos do menisco e aumentar a estabilidade da amostra.

  1. A um tubo de microcentrífuga, adicione 5 μL de tampão 10x F, ddH2O necessário para elevar o volume final a 50 μL, 1 μL de beta-mercaptoetanol 25% vol, 1 μL de 225 mg/mL de glicose, 1 μL de uma mistura de glicose oxidase (135 mg/mL) e catalase (85.000 unidades/mL), 1 μL de 25 mM ATP, e 10 μL de metilcelulose 2% em peso de 15 centipoise. Pipeta misture bem.
    NOTA: O beta mercaptoetanol é uma toxina. Evite derramamentos e contaminação. Os reagentes glicose oxidase, catalase, glicose e beta-mercaptoetanol estão na amostra para criar um sistema de eliminação de oxigênio. A solução-mãe de metilcelulose é preparada agitando a 4 °C e pode ser conservada a 4 °C durante várias semanas. A metilcelulose pode precipitar da solução e deve ser repreparada se houver precipitado visível ou se a aglomeração de actina for fraca.
  2. Opcional: Adicione proteína de reticulação (0,1-1 proteína reticuladora para cada 1 monômero de actina). Mistura de pipeta.
    NOTA: A(s) proteína(s) de reticulação também pode(m) ser adicionada(s) após a polimerização da actina e deixada se ligar por 10-20 min antes de adicionar miosina. Isso é preferível para concentrações de reticulador altas o suficiente para agrupar filamentos de actina - os feixes são distribuídos de maneira mais uniforme e reprodutível na interface surfactante-água. A câmara de amostra do cilindro é passível de adicionar um reticulador após a polimerização da actina.
  3. Adicione faloidina (1 faloidina para cada 1-3 monômeros de actina), se desejar. Mistura de pipeta.
  4. Em um tubo separado, misture actina não marcada e rotulada de modo que, quando a mistura de actina for adicionada à amostra de 50 μL, a concentração total seja de 2,64 μM. Use uma proporção de 1 monômero de actina marcado para cada 9 monômeros de actina não marcados. Mistura de pipeta.
    NOTA: Os monômeros de actina começarão a polimerizar após a adição à solução da amostra. Adicionar a actina marcada e a actina não marcada separadamente pode resultar em actina que aparece salpicada de regiões escuras e fluorescentes ao longo do contorno de um único filamento. Os estoques de monômero de actina são misturados para garantir filamentos de actina uniformemente marcados. A purificação e a rotulagem da actina são descritas em31.
  5. Opcional: Para fazer cristais líquidos ou outros experimentos usando filamentos curtos de actina, adicione proteína de cobertura à mistura de actina da etapa 5.4. A quantidade exata de proteína de capeamento depende da fração ativa da proteína e do comprimento dos filamentos de actina visados, mas normalmente, cerca de 1-10 mol% de proteína de capeamento (em relação à actina) é suficiente para criar filamentos curtos para experimentos de cristal líquido. A purificação de proteínas de capeamento é descrita em36.
  6. Para começar a polimerizar a actina, adicione a mistura de actina à solução de tampão F e à mistura de pipetas.
  7. Deixe a actina polimerizar no tubo de microcentrífuga em RT e, em seguida, adicione-a à célula de amostra após 10-30 min.
  8. Opcional: Se estiver preparando uma amostra de cilindro, coloque toda a solução em uma ponta de pipeta para que esteja pronta para pipetar na etapa 7.4 de carregamento da câmara de amostra do cilindro.

6. Opcional: Prepare emulsões

NOTA: Às vezes é conveniente preparar essas amostras em emulsões, que fornecem uma câmara de amostra confinada. As emulsões são preparadas usando reagentes semelhantes aos de Chowdhury et al., o que resulta em uma fase contínua de óleo que possui gotas de emulsão aquosa mediadas por surfactante41. Na presença de um agente de depleção, como a metilcelulose, usado neste protocolo, as amostras de actina irão aglomerar-se na interface aquosa desta emulsão. Para amostras nas quais este protocolo se baseia, não é observada diferença entre polimerizar a actina antes ou depois de adicioná-la às emulsões; no entanto, foi relatado que a etapa de polimerização é importante a ser considerada em alguns experimentos de encapsulamento42.

  1. Adicione 3,5 μL de surfactante de óleo a um tubo de microcentrífuga. Use um tubo de microcentrífuga transparente, de cor clara ou transparente para esta etapa.
  2. Sem misturar, adicione 5 μL da solução de actina no topo da camada de óleo surfactante. Feche o tubo da microcentrífuga.
  3. Enquanto segura a parte superior do tubo da microcentrífuga, mova a borda inferior do tubo para criar uma espuma com emulsões visíveis inicialmente. Continue a sacudir o tubo até que a espuma não apresente características distinguíveis quando iluminada por trás, indicando microemulsões.
    NOTA: Ao preparar uma amostra em emulsões, uma célula de fluxo ou outra câmara de amostra deve estar pronta antes de fazer a amostra de actina. A câmara de amostra do cilindro de vidro não funciona bem para emulsões, pois elas irão creme para a interface de ar em vez de sedimentos para a superfície da lamínula.

7. Carregue a câmara de amostra (câmaras do cilindro)

  1. Pipetar 5 μL de solução de surfactante de óleo no fundo da câmara do cilindro de vidro
    NOTA: Alternativamente, as amostras podem ser feitas passivando a superfície com uma bicamada lipídica suportada 11,29,30.
  2. Incline a lamínula e gire lentamente para que a superfície da lamínula e o cilindro inferior sejam revestidos com a solução surfactante.
  3. Remova o excesso de solução de surfactante de óleo com uma pipeta para obter uma camada de óleo o mais fina possível, sem permitir que o óleo, que é volátil, evapore completamente.
  4. Adicione imediatamente a solução de amostra da etapa 5.7 à câmara.
  5. Cubra a câmara com um pequeno pedaço de fita de PTFE para evitar a evaporação e o fluxo.

8. Alternativa: Carregue a câmara de amostra (célula de fluxo)

  1. Para se preparar para carregar a célula de fluxo, misture uma pequena quantidade de epóxi de 5 min. Uma gota com uma área inferior a 0,5 cm2 é normalmente suficiente.
  2. Para colocar a amostra na célula de fluxo, primeiro pipete 1-3 μL de solução de surfactante de óleo no canal de amostra da célula de fluxo para criar um pequeno tampão de solução que molha o canal.
  3. Pipetar imediatamente um volume de solução de amostra ou suspensão de emulsão lentamente na entrada da célula de fluxo para encher o canal. Normalmente, para um canal com cerca de 2 mm, o volume é de cerca de 8 μL. A entrada é o lado ao qual a solução de óleo-surfactante foi adicionada.
    1. Se o volume da amostra exceder o volume da célula de fluxo, passe a amostra através da célula de fluxo colocando um pano sem fiapos ou papel de filtro na outra extremidade do canal.
    2. Se o menisco da solução de óleo surfactante recuar, resultando em um entreferro, primeiro incline a célula de fluxo para remover o entreferro na entrada antes de adicionar a amostra.
  4. Se necessário, adicionar uma solução adicional de óleo e tensoactivo até que o ar deixe de ser visível no canal ou empurrar a amostra (especialmente para emulsões) mais para dentro do canal.
  5. Sele cada lado do canal com epóxi de 5 minutos (misturado logo antes de carregar a célula de fluxo).

9. Imagem e adicione miosina

  1. Monte a amostra no microscópio e inicie a imagem de lapso de tempo da actina usando uma objetiva de 20x, 40x, 60x ou 100x com imersão em óleo ou água para fornecer uma abertura numérica grande o suficiente para imagens de alta resolução. Se polimerizar na câmara de amostra, permita a polimerização por ~ 30 min ou até que não haja mais alongamento ou movimento visível do filamento.
  2. Opcional: Adicione reticulador.
  3. Adicione miosina através das opções 1 ou 2 abaixo.
    1. Adicione miosina como um dímero pipetado no topo da amostra (nenhuma mistura é necessária porque o dímero de miosina se difundirá).
    2. Adicione miosina como filamentos pré-polimerizados. A pipeta mistura aproximadamente metade do volume total muito lentamente para evitar perturbar a actina aglomerada.
      NOTA: O método ideal para a adição de miosina para obter a densidade ou tamanho desejado do filamento na superfície da lamínula pode variar para diferentes arquiteturas de actina e precisa ser determinado experimentalmente.
  4. Inicie a imagem de lapso de tempo.

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Results

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Uma ampla gama de conjuntos de actina pode ser formada em sistemas modelo usando proteínas purificadas, seguindo a estratégia geral descrita nesses métodos, onde a actina é polimerizada em filamentos na presença de proteínas acessórias que modificam a arquitetura do conjunto (Figura 1). Quando a actina é polimerizada em filamentos sem reticuladores ou proteína de capeamento, ela forma redes de filamentos emaranhados (Figura 1A). A adição de reticulador às redes ...

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Discussion

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Há muitas considerações para produzir conjuntos de actina reprodutíveis. Um dos mais críticos para a produção de dados reprodutíveis e analisáveis é a superfície da lamínula da câmara de amostra. As proteínas em amostras de actina in vitro, particularmente a miosina, são extremamente pegajosas e aderem a superfícies de vidro não tratadas ou mal tratadas, tornando uma amostra inutilizável (Figura 5A). Discutimos uma maneira padrão de preparar a super...

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos a divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall e outros membros dos laboratórios Gardel e Kovar (Universidade de Chicago) pelas discussões úteis durante o desenvolvimento dos métodos. M.A.C. e S.R. foram parcialmente apoiados pelas Bolsas de Oportunidade de Pesquisa de Graduação da Faculdade de Engenharia de Computação e Ciências Aplicadas da Clemson University, e V.J.A. foi apoiado pela Clemson Biophysics REU sob o NSF Award #2349368 com financiamento dos programas DBI e EPSCoR. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo Programa EPSCoR da National Science Foundation sob o Prêmio NSF #OIA-1655740, em parte e em parte pelo programa Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo de microcentrífuga de 0,6 mLFisher Scientific05-408-123
008-FluorosurfactanteRAN Biotechnologies00115081361-6525Alternativa à solução pré-misturada
008-FluoroSurfactant em HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50GSolução pré-misturada
2-mercaptoetanol (β-mercaptoetanol)Sigma Aldrich63689Número CAS: 60-24-2
Solução de estoque: 25 mM em água MilliQ, armazenada a 4 > C
4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etano-ácido sulfônico (HEPES)Sigma AldrichH3375Número CAS: 7365-45-9
5 min EpóxiDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% puro músculo esquelético de coelho
(alternativo à purificação)
Actina (marcada com rodamina)Citoesqueleto, Inc.AR05-AMúsculo esquelético de coelho
(Alternativo à purificação)
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)Sigma AldrichA6419Número CAS: 34369-07-8
Solução de estoque: 25 mM em água MilliQ, armazenar a -20 > C
Manter congelado para evitar hidrólise
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma AldrichC5670Número CAS: 10043-52-4
Proteína de capeamento (Mouse)Purificado da superexpressão em E.coli com um HisTag
Solução de estoque: 20 mM em tampão de proteína de capeamento a -80 ° C
Catalase de fígado bovinoSigma AldrichC9322Número CAS: 9001-05-2
Solução de estoque: 85 ku/mL, armazenar aliquotado com glicose oxidase a -20° C
Vidro de CoberturaFisherbrand12544CBorosilicato, #1.5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand não Fisher
Finest D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270Número CAS: 50-99-7
Solução estoque: 225 mg/mL em água MilliQ, armazenar a -20 &graus; C
Ditiotreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNúmero CAS: 3483-12-3
Solução de estoque: 1 M em água MilliQ, armazenar a -20 &graus; C
Fita dupla face3M3136
Ethyl alchohol 200 ProofPHARMCO111000200Número CAS: 64-17-5
200 proof
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-ácido tetracético (EGTA)Sigma AldrichE3889Número CAS: 67-42-5
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma AldrichE9884Número CAS: 60-00-4
Glicose OxidaseSigma Aldrich345386Número CAS: 9001-37-0
Solução de estoque: 135 mg/mL em água MilliQ, armazene aliquotado com catalase a -20 ° C
GlicerolSigma Aldrich356352MNúmero CAS: 56-81-5
ImidazoleFisher Bioreagents BP305-50Número CAS: 288-32-4
Cloreto de Magnésio (MgCl2)Fisher Bioreagents BP214Número CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
MetilceluloseSigma AldrichM0512Número CAS: 9004-67-5
15 centipoise
Lâminas de Microscópio PlainMicroscopia Eletrônica Ciências/Selo Dourado63710-05  3"x1", 1 mm de espessura
MilliQ águaMilliporeCUFBI001Água ultrapura
Novec-7500 Fluido de engenharia3M7100134816Alterne para solução pré-misturada
Cloreto de potássio (KCl)Sigma AldrichP3911Número CAS: 7447-40-7
Fosfato de potássio (KPO4)Sigma AldrichP3786Número CAS: 7758-11-4
Pó de acetona para músculo esquelético de coelhoPel-Freez Biologicals41995-1Usado na purificação de actina (alternativa à compra)
Armazene cerca de 30 mM em tampão de actina G a -80 ° C
Azida de SódioSigma Aldrich71289Número CAS: 26626-22-8
Tetrametilrodamina-C6-maleimidaAnaSpecAS-81445Número CAS: 174568-68-4 Usado na purificação de actina (alternativa à compra)
Armazene cerca de 30 mM em actina Tampão G a -80 °C. Usado na rotulagem de actina (alternativa à compra)
Ácido clorídrico Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Número CAS: 1185-53-1
Banho UltrassônicoEmerson Branson 
CPX2800H

References

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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