Uma tarefa motora fina para estudar a cinemática articular em um modelo pré-clínico de doença neurodegenerativa

Resumo

O presente estudo descreve um teste de comportamento motor fino para examinar déficits motores em modelos de roedores, incluindo o rato TgF344-AD, usando aprendizado de máquina.

Resumo

A disfunção motora é um componente crítico, mas muitas vezes subestimado, de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA) e demências relacionadas. Novas pesquisas mostraram que tarefas que envolvem comportamento motor fino, capacidade visuoespacial e função executiva em humanos podem ter potencial na detecção precoce de doenças. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos exatos pelos quais essas tarefas predizem o declínio cognitivo e funcional associado à DA. No método atual, uma tarefa motora fina, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), foi criada para examinar as mudanças na capacidade motora ao longo da progressão da doença em modelos pré-clínicos de DA em relação a outras doenças neurodegenerativas e envelhecimento normal usando software de aprendizado de máquina gratuito e de código aberto. Aqui, a prova de conceito foi estabelecida com o projeto, teste e implementação da tarefa motora fina em um estudo piloto de ratos Fisher 344 CDF com e sem deficiências motoras induzidas por harmalina A validação adicional, com um modelo de rato com doença de Alzheimer (TgF344-AD), demonstrou ainda mais a viabilidade do modelo e a sensibilidade à tarefa. Os ratos foram treinados para alcançar através de uma pequena fenda na frente da câmara para recuperar uma pelota de açúcar de uma das três tigelas com dificuldade variável. A recuperação do pellet foi pontuada usando uma das três classificações: sucesso (agarrar e comer com sucesso o pellet de açúcar), drop (agarra, mas deixa cair a guloseima ao agarrar) ou falha (alcance em que nenhum pellet é obtido ou pellets são derrubados da tigela ao tentar agarrar). Diferenças significativas na capacidade motora foram observadas entre ratos controle e tratados com harmalina, demonstradas pela redução dos alcances totais e aumento da variabilidade da postura da pata. Os ratos TgF344-AD também apresentaram alcances totais reduzidos, bem como sucessos reduzidos em todas as tigelas. Ao validar isso como uma tarefa motora fina em roedores, tem potencial futuro para estudar o envelhecimento normal e modelos pré-clínicos de doenças neurodegenerativas, incluindo DA, à medida que a patologia e os sintomas surgem com o tempo.

Introdução

A função motora demonstrou ser prejudicada em pessoas com demência decorrente da doença de Alzheimer (DA) ou de outros subtipos (por exemplo, demência com corpos de Lewy). A força de preensão e a velocidade da marcha podem distinguir^{entre idosos com} deficiência cognitiva e não prejudicados1,2, mas não podem necessariamente diferenciar entre diferentes subtipos de demências (ou seja, baixa especificidade)^1,2. Assim, continua a haver necessidade de novas ferramentas de diagnóstico para demência precoce, possivelmente combinadas com aprendizado de máquina, para avaliar padrões complexos e relações entre comportamento e estado de doença ^3,4. Os modelos animais são valiosos para investigar a progressão de doenças neurodegenerativas para oferecer insights sobre o início precoce da doença, correlatos comportamentais e integração de aprendizado de máquina em pipelines de análise para distinguir entre gravidade e apresentação ^5,6,7.

Novos métodos comportamentais em humanos identificaram tarefas que envolvem habilidades motoras finas juntamente com o processamento cognitivo, como capacidade visuoespacial e função executiva ^8,9,10. Por exemplo, uma tarefa funcional da extremidade superior pode rastrear padrões de neurodegeneração e pode distinguir comprometimento cognitivo leve (MCI) de DA. Nesta tarefa, os humanos movem feijão cru (dois de cada vez) de um copo doméstico central para um copo alvo usando uma colher. A fase da tarefa em que os feijões são adquiridos com a colher mostra associações mais fortes com a cognição (especificamente, memória visuoespacial) do que a fase em que os feijões são transportados para o copo alvo^11,12. À medida que a colher entra no copo, ela pode perturbar os grãos no copo, o que significa que os movimentos do participante podem dificultar a tarefa. Além disso, à medida que o teste avança e o número de grãos no copo caseiro diminui, a tarefa se torna mais difícil (ou seja, o tempo para adquirir os grãos com a colher aumenta)¹³. Foi demonstrado que essa tarefa se correlaciona com patologia específica da DA (amilóide)^9,14 e neurodegeneração (atrofia do hipocampo)^10,15, sugerindo que seu desempenho pode depender de circuitos neurais e processos comportamentais que são afetados no início do processo da doença. Sabe-se que a iniciação, o planejamento, a execução e a correção do movimento são controlados por uma rede diversificada que atravessa o cérebro, incluindo o córtex motor, com corpos celulares de neurônios motores superiores localizados no córtex cerebral fazendo sinapses em neurônios motores inferiores na medula espinhal¹⁶. Esses neurônios motores inferiores se comunicam diretamente com os músculos para controlar o movimento na junção neuromuscular. Os tratos ascendentes carregam informações sensoriais da periferia para a medula espinhal, enquanto os tratos descendentes dentro do cérebro comunicam informações direcionais sobre como e onde voltar aos músculos^17,18. Compreender como essas vias são afetadas seletivamente pela patologia da DA é fundamental para entender a progressão da doença, principalmente porque modelos animais genéticos, incluindo o camundongo 3xTg-AD e o rato TgF344-AD, foram usados anteriormente para estudar como os genes da DA afetam a locomoção, coordenação e outras deficiências motoras 19,20,21. Normalmente, essas tarefas se concentram em deficiências motoras grossas relacionadas ao movimento de todo o corpo, mas os déficits motores em humanos são muito mais variáveis, o que pode ser difícil de identificar em roedores²². Novas tarefas são, portanto, necessárias para preencher a lacuna entre os modelos humanos e animais para capturar essa variabilidade.

Uma região do cérebro comumente implicada em deficiências motoras e tremores é o cerebelo²³. O cerebelo é um regulador significativo de movimentos precisos e coordenados e atua como um processador de informações sensoriais para fornecer feedback por meio de vias descendentes para corrigir e adaptar esse movimento voluntário^24,25. É importante notar que a atrofia cerebelar tem sido reconhecida em indivíduos com DA, mas, ao contrário de outras regiões como o hipocampo, o aumento da deposição de amiloide no cerebelo não se correlaciona com o aumento da atrofia²⁶. Embora a progressão da patologia da DA seja diferente no cerebelo, existem conexões bidirecionais multissinápticas entre o cerebelo e o hipocampo que provavelmente são interrompidas na AD 27,28,29. Notavelmente, existem conexões funcionais entre o cerebelo e o hipocampo, pois os déficits de memória foram documentados após a ressecção do tumor cerebelar^{30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37} . Em roedores, as células do hipocampo são interrompidas com uma perturbação cerebelar³⁸. Esses déficits sobrepostos na memória, sociabilidade e controle motor destacam a importância de descobrir possíveis mudanças precoces nas vias motoras que ocorrem antes do declínio cognitivo 30,31,38,39. Com a implementação de tarefas motoras finas na pesquisa inicial da DA, podemos começar a reformular a compreensão tradicional da DA como simplesmente um distúrbio cognitivo e redirecionar os esforços diagnósticos para alterações motoras precoces que podem prever a progressão da doença e podem ser mais distinguíveis entre indivíduos com deficiência cognitiva e idosos não prejudicados.

Para entender como o comportamento motor fino pode ser indicativo de mudanças na estrutura do cérebro, uma versão de roedores da tarefa humana descrita acima foi criada e testada. Esta tarefa de roedores foi denominada KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task) e se desvia de tarefas anteriores que exigem a recuperação de um único pellet de um pedestal ou escada e a pontuação mais simplista como resultado da colocação consistente de pellets em todos os estágios da tarefa 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}. Esta tarefa de alcance do motor fino inclui novos métodos de pontuação, tigelas com várias dificuldades e recursos auto-perturbadores para imitar a contraparte humana, com movimento de pelotas e ajustes subsequentes da estratégia do participante centrais para o projeto. Esta tarefa emprega as ferramentas de aprendizado de máquina, Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) e keypoint-MoSeq^49,50, permitindo uma medição imparcial e quantitativa da capacidade motora fina e dos comportamentos de alcance. Enquanto outros modelos computacionais notáveis foram desenvolvidos para tarefas de alcance habilidosas em roedores^44,45,51, o keypoint-MoSeq elimina o ruído para permitir a quantificação precisa do movimento e das poses de preensão⁵⁰. O desempenho da tarefa e a estratégia de aprendizado motor foram reconstruídos usando uma câmera de visão de máquina de alto desempenho em ratos típicos e com perturbação motora usando Harmaline⁵². A harmalina hiperativa o núcleo olivar inferior e interrompe a função cerebelar por meio de fibras trepadeiras glutamatérgicas^53,54. Além disso, a capacidade motora fina foi examinada em um subconjunto de ratos TgF344-AD. Assim, esperava-se que a tarefa motora fina encontrasse deficiências mensuráveis em ratos tratados com harmalina e TgF344-AD em relação às suas contrapartes típicas como uma prova de conceito. Este protocolo descreve a construção da tarefa motora fina, treinando e testando animais e quantificando o comportamento de alcance usando SLEAP e keypoint-MoSeq.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Arizona State University.

1. Projeto e construção da câmara

1. Prepare os painéis de acrílico transparentes. Os esquemas da caixa estão localizados em https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Corte painéis de acrílico transparente nas seguintes dimensões (todos os painéis têm 1 cm de espessura):
   1. Recorte dois painéis laterais: 26 cm × 22 cm.
   2. Recorte um painel superior: 27 cm × 12 cm.
   3. Recorte o primeiro painel inferior: 26 cm x 10 cm
   4. Recorte o segundo painel inferior: 26 cm x 11 cm
   5. Corte de um painel frontal: 20 cm × 11 cm.
   6. Recorte um painel traseiro: 20 cm x 12 cm
   7. Corte um slot do painel frontal (140 mm x 12 mm). Posicione o slot centralmente, com a borda inferior alinhada com a parte inferior do painel.
   8. Corte uma ranhura interna: 1 cm. Nas bordas internas dos painéis laterais, crie um recuo ou ranhura para permitir que o painel frontal deslize para dentro e para fora com segurança.
      NOTA: Se o recurso deslizante não for necessário, o painel frontal pode ser colado permanentemente para simplificar a construção.
   9. Faça furos uniformemente espaçados (5 mm de diâmetro) no segundo painel inferior para permitir que os pellets caiam se caírem. Espace os orifícios separados por 1 cm em um padrão de grade.
2. Monte a câmara com adesivo (Figura 1A).
   NOTA: Use um adesivo forte e transparente projetado explicitamente para materiais acrílicos.
   1. Painéis laterais: aplique uma linha contínua de adesivo ao longo das bordas do painel inferior. Posicione os painéis laterais verticalmente e pressione com firmeza. Deixe o adesivo curar de acordo com as instruções de fabricação.
   2. Painel traseiro: Aplique adesivo nas bordas traseiras dos painéis laterais e inferiores. Posicione o painel traseiro e pressione-o no lugar.
   3. Painel superior: aplique adesivo nas bordas superiores dos painéis laterais e traseiros. Posicione o painel superior e pressione com firmeza.
   4. Painel frontal: Deslize cuidadosamente o painel frontal nas ranhuras dos painéis laterais, garantindo um ajuste confortável, mas suave, ou aplique adesivo ao longo das bordas do painel frontal e prenda-o nos painéis lateral, superior e inferior.
      1. Teste o movimento do painel e confirme se ele se alinha precisamente com o resto da câmara.
3. Iluminação de configuração
   1. Posicione a luz infravermelha (IR) na extremidade oposta da câmara de teste, apontando para a câmara. Coloque uma folha de cartolina branca em cima da câmara para refletir a luz para baixo.
      NOTA: A iluminação é fundamental para o rastreamento adequado e todas as gravações devem ser feitas sob luz infravermelha em uma sala escura.
4. Prepare a tigela de treinamento.
   1. Fabricar a tigela de treino com um raio de 31 mm e uma extensão de 32 mm utilizando uma impressora 3D. STL disponível no https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Figura 1B: topo)
   2. Prenda a tigela de treinamento na parte inferior da câmara diretamente na frente do slot. Posicione a tigela de forma que sua borda superior fique aproximadamente acima do nível dos olhos do rato dentro da câmara, usando um suporte de apoio, como um bloco de madeira.
5. Prepare as tigelas de teste (Figura 1B: meio e fundo).
   1. Imprima as tigelas usando os arquivos STL fornecidos. Dois designs distintos de tigela são fornecidos: "Plain-Less" e "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Inspecione a precisão dimensional e a durabilidade (dimensões: 50 mm de profundidade x 40 mm de largura).

2. Hardware do computador e da câmera

1. Use um tripé para montar a câmera com segurança.
2. Posicione a câmera a aproximadamente 15-20 cm do painel frontal da câmara.
   1. Ajuste a altura e o ângulo do tripé para que a câmera capture uma visão isométrica de 45° do slot e da tigela.
      NOTA: Certifique-se de que o campo de visão da câmera englobe a pata do rato e o alcance completo, o slot e a tigela de treinamento ou teste. Teste diferentes ângulos e distâncias, se necessário, para obter a visibilidade ideal.
3. Baixe o software para emparelhar com a câmera para gravações comportamentais (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) e abra o software para usar a câmera para registrar o comportamento.
   1. Use as seguintes configurações da câmera: modo de aquisição: contínuo, taxa de quadros: 216 Hz, modo de exposição: temporizado, exposição automática: desligado, tempo de exposição: 4430 μs, ganho automático: desligado, ganho: 16,85 dB, gama: 0,8.
   2. As configurações de gravação são as seguintes: tipo de arquivo H264, taxa de bits de 5 milhões (5.000.000).
   3. Para gravar por 10 minutos, insira 130.000 quadros e use o modo de streaming para salvar.
      NOTA: Recomenda-se o uso de uma máquina dedicada com um mínimo de 16 GB de RAM e um disco rígido de estado sólido interno de 1 TB para armazenamento de dados.

Figura 1: Esquema da tarefa motora fina. (A) Representação em desenho animado da tarefa motora fina pela qual um rato alcança através de uma fenda para obter uma pelota de açúcar. Os trechos são registrados para análise de aprendizado de máquina. Existem três tigelas separadas usadas: uma tigela de treinamento (canto inferior esquerdo), (canto inferior central) Tigela Simples/Menos e a tigela Plinko (canto inferior direito) com obstruções circuladas em vermelho. (B) Esquemas de cada design de tigela, incluindo tigela de treinamento (superior), tigela lisa / menos (do meio) e tigela Plinko (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação do animal

1. Emparelhe (no mínimo) ratos Fisher 344 CDF (machos e fêmeas, >3 meses de idade) em um ciclo reverso de luz / escuridão para permitir o teste quando os animais estão mais ativos.
2. Pese todos os roedores 1 semana antes do início da habituação e forneça ~ 30 g de alimento para um roedor com peso superior a 300 g e ~ 15 g para um roedor 100-300 g para manter os animais com 90% do peso corporal.
   1. Pese diariamente os ratos e ajuste a comida de acordo, reduzindo a quantidade de comida fornecida em 1-2 g por dia até que o roedor atinja 90% do peso corporal. O manejo diário também ajudará a habituar os animais ao experimentador.
   2. Durante a habituação e o teste, continue este procedimento, ajustando os alimentos em +/- 0,5 g quando o peso cair abaixo ou exceder o limite.
   3. Durante o teste, pesar os animais antes do início da tarefa e, em seguida, fornecer os alimentos alocados imediatamente após o retorno à gaiola após a conclusão da tarefa.
      NOTA: Qualquer perda repentina de peso (>15%) ao longo de 1-2 dias pode sinalizar um problema subjacente, e um veterinário deve ser consultado.

4. Habituação (2 dias)

1. Ligue a luz infravermelha, a câmera e o computador.
2. Coloque a tigela de treinamento com pellets na ranhura de abertura, certificando-se de que a ponta da tigela se estenda ligeiramente para dentro do aparelho (aproximadamente 2 cm inicialmente).
3. Transfira as gaiolas para a sala de testes e deixe os ratos se aclimatarem por 5 min.
4. Dia 1: Adicione ratos alojados em pares à câmara e deixe-os explorar por 20 minutos. Coloque 3-5 pellets de açúcar na gaiola doméstica após o teste para permitir que os ratos se familiarizem com os pellets.
   NOTA: O tamanho do pellet de 45 mg permite uma única recuperação do pellet.
5. Limpe a câmara com um pano desinfetante entre os ratos. No final do dia, borrife com etanol para desinfetar.
6. Dia 2: Habituar os roedores individualmente ao aparelho usando o mesmo procedimento (20 min). Se os roedores parecerem temerosos ou estiverem evitando a frente do aparelho e da tigela, continue se habituando até que esse comportamento se resolva. Continue a dar pellets como guloseimas na gaiola doméstica (3-5 pellets).
   1. Para incentivar a familiaridade e a aproximação da tigela, mova o tubo alongado mais para dentro do obturador do aparelho progressivamente durante a habituação, movendo a ponta 0,5 cm de cada vez para mais perto do roedor para facilitar o alcance.
      NOTA: A habituação, o teste e o treinamento devem ser realizados no mesmo local sob iluminação vermelha para eliminar o impacto de novos ambientes.

5. Modelagem (10 dias)

1. Ligue a luz infravermelha, a câmera e o computador.
2. Transfira as gaiolas para a sala e deixe os ratos se aclimatarem por 5 min.
3. Usando a tigela de treinamento, forneça de 1 a 5 pellets ao longo da extensão, com a extensão colocada totalmente dentro do aparelho no primeiro dia. Treine animais em sessões de 10 minutos. A gravação durante a modelagem é opcional.
   NOTA: Para familiarizar os roedores com os pellets, é importante fornecer alguns pellets de açúcar dentro do próprio aparelho para reduzir a aversão aos pellets na tigela. Os roedores provavelmente comerão os pellets dentro do aparelho porque são facilmente encontrados e reconhecerão esses pellets na tigela. É importante acostumá-los a ficar voltados para a direção correta do aparelho e se acostumar a tocar na tigela.
4. Nos dias subsequentes de treinamento, comece a retrair a extensão da tigela do aparelho. Isso exigirá que os roedores se aproximem da abertura do aparelho na frente e incentivem a interação com a extensão do lado de fora do aparelho.
   1. O design permite a colocação específica de pellets. Por exemplo, coloque os pellets na extremidade da tigela mais próxima do roedor e afaste-se gradualmente para incentivar o roedor a sair do aparelho.
5. À medida que os roedores se tornam mais confortáveis pegando pellets da borda das extensões, mesmo que apenas pela boca, comece a introduzir pellets através das pinças para incentivar o comportamento de alcance.
   1. Segure um pellet na pinça do lado de fora do aparelho, permitindo que os roedores simplesmente toquem na pinça. Recompense imediatamente esse comportamento para incentivar mais alcance.
   2. À medida que os roedores se sentirem mais confortáveis tocando as pinças, permita que eles se afastem um pouco mais do aparelho para tocar ou agarrar o pellet, segurando a pinça um pouco mais longe da abertura do aparelho.
      NOTA: Mantenha anotações sobre todos os comportamentos dos animais, principalmente se os animais tiverem medo da tigela ou não o alcançarem. Esses animais podem precisar de dias adicionais de modelagem.
6. Uma vez que os roedores alcancem de forma contínua e independente por um período mínimo de 3 dias (Figura 2A), faça a transição para a tigela lisa até que o comportamento de alcance seja estabelecido (alcance contínuo por 3 dias com pelo menos 10 alcances independentes por dia).
   1. Ao introduzir os roedores na tigela simples, certifique-se de que a tigela esteja cheia o máximo possível com pellets para que os roedores possam visualizar os pellets na lateral da tigela.
      NOTA: Incentivar os alcances usando pinças pode ser necessário nesta fase.
7. Limpe a câmara com um pano desinfetante entre os ratos. No final do dia, borrife com etanol para desinfetar.

6. Prepare-se para o teste:

1. O teste é concluído em 9 dias (Figura 2A), com cada roedor realizando 3 tentativas por tigela, com cada tentativa de 10 minutos ocorrendo em dias consecutivos.
   NOTA: O teste é melhor realizado pela manhã.
2. Em cada dia de teste, pese os ratos. Depois de concluídos, os ratos são deixados em gaiolas domésticas por 30 a 60 minutos antes do teste, pois a pesagem pode induzir estresse e inibir o comportamento de alcance.
3. Ligue o computador e configure a tigela. Conecte a câmera e a luz. Abra o software de gravação e ajuste as configurações da câmera conforme descrito na seção 2 do protocolo.
   NOTA: Recomenda-se gravar pelo menos 200 quadros por segundo (fps) para capturar todos os movimentos da pata.
4. Alinhe a tigela na moldura da câmera e visualize-a no software de gravação pressionando o botão play. Coloque a tigela nivelada com o aparelho e a câmera em um ângulo de 45° em relação à lateral da tigela.
   1. Mova a câmera para capturar o alcance diretamente de frente para estudar o movimento individual dos dedos e da palma da mão, bem como o movimento relacionado à altura da palma acima da tigela durante o alcance.
   2. Coloque a câmera diretamente perpendicular à tigela para capturar o movimento do braço e da mão de e para a tigela, mas não o posicionamento dos dígitos ou detalhes sobre o comportamento de preensão.
      NOTA: Embora um ângulo de 45° seja recomendado para capturar o movimento ao longo dos planos x, y e z, outras configurações podem capturar informações mais prontamente para o estudo desejado.

7. Teste (9 dias)

1. Coloque os ratos na sala para se habituar por 1 h.
2. Coloque a primeira tigela na plataforma da tigela, prendendo-a com cera dental. Certifique-se de que a frente da tigela esteja nivelada e centralizada com a abertura do aparelho.
3. Nomeie o arquivo de vídeo no Spinview com o número de identificação do rato, a data e a hora da gravação.
4. Coloque o rato no aparelho. Feche a tampa e coloque a cartolina branca por cima para desviar a luz.
5. Neste ponto, verifique novamente o ângulo da câmera para garantir que a cena apropriada seja capturada e ajuste a tigela se não estiver centralizada.
6. Despeje a quantidade correta de pellets na tigela e pressione Iniciar gravação.
   Dia 1-3 Tigela simples: ~ 100 pellets
   Dia 4-6 Menos tigela: ~50 pellets
   Dia 7-9 Tigela Plinko: ~50 pellets
7. Permaneça na sala durante o teste para monitorar continuamente o rato, fazer anotações sobre como alcançar o desempenho e o comportamento e adicionar pellets conforme necessário para manter a quantidade correta.
   1. Para a tigela simples, certifique-se de que os roedores possam ver pellets sobre a borda da tigela e que os pellets sempre possam ser obtidos (ou seja, enchendo a tigela durante todo o teste à medida que os pellets diminuem, os pellets são colocados em camadas).
   2. Para a tigela Less: verifique se os pellets não estão empilhados uns sobre os outros e se há algum espaço entre os pellets, permitindo que eles se espalhem quando o rato tentar alcançá-los.
   3. Para a tigela Plinko: certifique-se de que haja pellets suficientes para serem acessíveis entre as obstruções.
8. Devolva o animal à gaiola de origem e forneça a comida alocada. Limpe a câmara com um pano desinfetante entre os ratos.
9. No final do dia, borrife etanol para desinfetar toda a câmara e se preparar para o dia seguinte.
   NOTA: Se testar roedores machos e fêmeas, certifique-se de contrabalançar os sexos com algumas fêmeas e alguns machos testados no início da manhã e uma mistura semelhante testada mais tarde. Mantenha a ordem dos testadores durante todo o experimento.

Figura 2: Treinamento e teste de ratos realizando a tarefa motora fina. (A) Linha do tempo do experimento. Os ratos foram habituados ao aparelho por dois dias e depois submetidos a procedimentos de modelagem por 10 dias. Os animais foram testados quanto à capacidade motora fina em todas as três tigelas por três dias em cada tigela. Em seguida, os animais foram injetados com harmalina e testados novamente em cada tigela durante três dias. (B) Os ratos (n = 6) foram submetidos a duas tigelas diferentes (tigela de treinamento e Plain) durante os procedimentos de modelagem, e o tipo de tigela foi trocado no dia 5 para melhorar os alcances. Houve um aumento significativo na modelagem ao longo de 10 dias para atingir os critérios (F (9, 45) = 13,5, p < 0,001). A barra cinza designa a troca entre a tigela de treinamento de tubo alongada original e a atual. (C) Para testar todas as três tigelas, houve uma diferença significativa no total de alcances ao longo dos 9 dias de teste (F (8, 32) = 3,74, p = 0,003). Nota: O rato 2 foi removido após a modelagem. A tigela Plinko resultou em diferenças significativas entre a tigela Less (p = 0,001) e a tigela Plain (p = 0,027). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Modelagem de disrupção motora fina usando Harmaline

NOTA: Para identificar os efeitos dos distúrbios motores na capacidade motora fina e no desempenho na tarefa motora fina, os ratos foram injetados com Harmaline (10 mg / kg), um alcalóide β-carbolina que é um inibidor reversível da monoamina oxidase-A e tem como alvo a azeitona inferior 52,55,56,57. A harmalina em modelos de roedores afeta a postura e o equilíbrio, limita a coordenação motora fina e induz a ruptura motora nos membros superiores.

1. Pese os ratos para calcular a dose adequada de Harmalina.
2. Permita que os ratos se habituem à sala de testes por 1 h.
3. Ligue o computador e configure a tigela. Conecte a câmera e a luz. Abra o software de gravação e ajuste as configurações da câmera conforme descrito na seção 2 do protocolo.
4. Injetar os roedores com Harmalina (10 mg/kg, i.p.).
5. Após 15 min, despeje os pellets na tigela apropriada e comece a gravar. Teste o rato em cada tigela ao longo de 3 dias.
   Dia 1 Tigela simples: ~100 pellets
   Dia 2 Menos tigela: ~ 50 pellets
   Dia 3 Tigela Plinko: ~50 pellets
   NOTA: Monitore o local da injeção quanto a anormalidades, incluindo irritação da pele, comportamentos dolorosos, ataxia, hipotermia e alterações posturais por até 3 h após a injeção. Após as janelas de 3 h, continue monitorando quaisquer mudanças no comportamento, incluindo latências para comer ou beber, ou qualquer tremor residual.

9. Análise de vídeo usando aprendizado de máquina

NOTA: Após a coleta de dados e gravação de vídeo, os alcances foram contados manualmente e pontuados da seguinte forma: Sucesso (recuperar e consumir pellet), Drops (recupera o pellet, mas solta o pellet antes do consumo), Falha (incapaz de recuperar o pellet). Esses dados pontuados à mão foram usados como dados de verdade para a análise de aprendizado de máquina.

1. Usando código Python personalizado em https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask, foram feitas comparações entre animais tratados com Baseline e Harmaline para identificar mudanças no desempenho de alcance (Figura 3, Figura 4, Figura 5 e Figura 6).
2. Para analisar a cinemática conjunta do comportamento de alcance, incluindo trajetória de alcance, conformação e posição da pata e mudanças na estratégia de alcance nos vários tipos de tigelas, use o software de aprendizado de máquina gratuito e de código aberto Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (consulte https://sleap.ai/ para obter uma explicação mais extensa e um guia passo a passo para usar o programa de código aberto⁴⁹).
   NOTA: O SLEAP⁴⁹ pode ser baixado em https://github.com/talmolab/sleap.
3. Abra um novo projeto e adicione 3 vídeos da tarefa de alcance.
4. Crie um esqueleto composto por 15 nós: 1 braço, 1 pulso, 1 centro da palma da mão, 4 bases, 4 nós dos dedos e 4 nós da ponta dos dedos (baixe o esqueleto em https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Adicione bordas entre os nós de modo que o braço se conecte ao pulso e, em seguida, ao centro da palma da mão. A partir do centro da palma da mão, conecte os nós da base, da articulação e da ponta dos dedos de forma que o centro da palma da mão seja sempre o nó inicial (Figura 7A).
6. Rotule um mínimo de 50 quadros antes de executar o treinamento. Aqui pode-se treinar um novo modelo ou usar os modelos para centrado e centróide no github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Depois que o modelo for treinado, abra um novo vídeo e execute inference: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   NOTA: A inferência pode ser executada como um script bash em um cluster local. Os vídeos rastreados podem exigir revisão (consulte https://sleap.ai/ para obter instruções de revisão).
8. Para analisar melhor os nós e entender as diferenças entre os grupos na cinemática das juntas, use o ponto-chave gratuito e de código aberto MoSeq⁵⁰ (consulte https://github.com/dattalab/keypoint-moseq para obter detalhes sobre download e instruções de uso).
9. Crie sílabas discretas de comportamento usando keypoint-MoSeq⁵⁰ (Figura 7B). Realize análises adicionais para mapear a frequência de transição, probabilidade e mudanças na frequência de transições entre as condições de Harmalina e Linha de Base por tigela (Figura 7C, D). Consulte https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask para obter o código de análise.

Figura 3: Mudanças no alcance entre as tigelas e o tratamento. (A) Para o teste de linha de base (n = 5), em todas as 3 tigelas, houve uma diferença significativa nos alcances totais (H (df) = 8,48, p = 0,014, Kruskal-Wallis), com mais alcances ocorrendo com o tipo de tigela Plinko (p = 0,011, teste post-hoc de Dunn com correção de Bonferroni). (B) A perturbação da harmalina (n = 5) não resultou em diferenças entre os tipos de tigelas. Os erros são relatados como S.E.M. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de desempenho entre condições e entre tipos de tigelas. (A) Houve uma tigela significativa (F (2) = 5,78, p = 0,007) e diferença de resultado (F (2) = 3,92, p = 0,029) durante o teste inicial. As tentativas de alcance aumentaram à medida que o tipo de tigela se tornou mais difícil, embora os alcances tenham sido reduzidos em relação à linha de base em todas as tigelas na condição harmalina. (B) Nenhuma diferença foi encontrada em ratos tratados com harmalina para contagens de alcance entre as tigelas. (C) Houve diferença significativa no resultado (F(2) = 2,07, p < 0,001) durante o teste basal quando analisado pelo desempenho. (D) Não foram encontradas diferenças em ratos tratados com harmalina para o desempenho da tigela ou do resultado. Os erros são relatados como S.E.M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação das condições basais e harmalinas. (A) Não houve diferenças no sucesso do desempenho entre as condições. (B) Para as contagens de falhas, houve uma diferença significativa entre as condições basais e harmalinas (H(df) = 4,85, p = 0,028, Kruskal-Wallis) com um efeito significativo encontrado na condição harmalina (p = 0,028, teste post-hoc de Dunn com correção de Bonferroni). Os erros são relatados como S.E.M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Taxas de aprendizado e alcance. (A) Os animais com Harmalina tiveram uma taxa de aprendizado perturbada em comparação com a condição basal (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Para o total de trechos por minuto, houve uma interação significativa entre bowl (less) e condição (harmaline) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, modelo linear misto) e bowl (plinko) e condição (harmaline) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, modelo linear misto). A harmalina reduziu o total de alcances por minuto em todos os tipos de tigela (Menos: p = 0,01, Plinko: p < 0,001) em comparação com a linha de base. Os erros são relatados como S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: O aprendizado de máquina identifica poses exclusivas e estratégia de tarefa. (A) Localizações dos nós na pata do rato rotuladas usando SLEAP. (B) Exemplos de sílabas identificadas por keypoint-MoSeq durante o alcance. (C) Matriz de frequências de transição de bigramas entre sílabas consecutivas. As probabilidades de transição são normalizadas pela contagem total de bigramas. (D) Um gráfico de transição comparando as diferenças de transição de sílabas entre Harmaline e Baseline. Os nós do gráfico representam sílabas e as arestas indicam transições entre elas. Bordas mais proeminentes indicam transições de sílabas com frequências mais altas. As conexões vermelhas indicam uma transição regulada para cima, enquanto uma conexão azul indica uma transição regulada para baixo em animais tratados com harmalina Os círculos vermelhos indicam o uso regulado para cima, enquanto um círculo azul indica um uso regulado para baixo da sílaba indicada em animais tratados com harmalina Pares de sílabas com frequências menores que 0,005 foram excluídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Depois que os ratos atingiram uma restrição alimentar de 90% do peso corporal, eles foram habituados à câmara por 2 dias e, em seguida, submetidos a procedimentos de modelagem por 1-2 semanas. O número de contatos bem-sucedidos, descartados e fracassados foi pontuado por um observador treinado cego para cada condição. Ao longo de 9 dias (linha de base), os ratos foram testados quanto à capacidade motora fina em 3 configurações diferentes de tigela (Plain, Less e Plinko). Em seguida, os m...

Discussão

As tarefas de alcance para roedores são comumente restritas a pellets únicos e não incluem obstruções ou características autoperturbadoras, que são lutas comuns para pacientes com patologia neurodegenerativa. O método apresentado aqui, usando uma tarefa de alcance de pellets reimaginada e aprendizado de máquina, pode detectar coordenação e estratégia por meio da análise de recursos de pose e transições, além de movimentos de dígitos individuais. A tarefa motora fina criada aqui detectou ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material para impressão 3D	Amazon (Abertura)	B07PGY2JP1	Filamento PLA 1,75 mm Filamento para impressora PLA 3D, Precisão Dimensional +/- 0,03 mm
Câmera	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 MP, Mono, 170 FPS, ON Semi PYTHON 1300 x2
Cabos de câmera	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, Cabos Tipo-A para Micro-B (Travamento)
Lente da câmera	Laboratórios Thor	MVL5WA	Lente de visão artificial EFL, F/1.4, formato 1/2" de 4,5 mm
Conexão da câmera ao tripé	Edmond Optics	88-210	Conexão da câmera ao tripé
Lenços lenços	Amazona (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	AF3 Lavador Desinfetante de Superfície Recipiente de Lenço Suave 160 Ct P13872
Computador	Dell	Precisão	Intel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
Luz IR	Amazona (Serlium)	B0BJFDBT44	Câmera Luz IR 48 LED Iluminadores IR Luzes Infravermelho Impermeável Visão Noturna Luz para Segurança Câmera de CCTV
Cola para painéis	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Cola de vidro
Plexiglass	Amazon (TOOLINHAND  EUA)	B0BRJ1L8TR	12 e vezes; Folhas de acrílico/plexiglass fundidas transparentes de 12" - transparentes de 1/8" Grosso (3 mm) e nbsp;
Python	Fundação de Software Python	Python 3.7
Spinview	Teledyne Technologies	Versão 3.1.0.79
Pellets de açúcar (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, sem sabor 50.000/caixa; Ingredientes: Sacarose, Dextrose, Estearato de Magnésio, Silicato de Cálcio, Óleo Mineral
Tripé	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Tripé de Webcam para Mesa Flexível da Amazon
Pinça	Ferramentas Científicas Finas	11064-07	Pinça de Íris
Cera	Amazon (Ortomecânica)	B00FKDC0UU	Orthowax genuíno