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Artigo de método

Isolamento e cultura de células Müller primárias da retina de ratos Sprague-Dawley (SD)

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DOI:

10.3791/68129

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17 de junho de 2025

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1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar células primárias de Müller retinianas de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais. O procedimento inclui enucleação dos globos oculares, dissecção do tecido retiniano, extração e identificação de células e considerações importantes para a cultura de células subsequente.

Resumo

As células de Müller da retina (RMCs) desempenham um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural e na regulação de várias funções dentro da retina. Como um componente central do microambiente da retina, os RMCs desempenham várias funções vitais. Por meio de seus abundantes canais iônicos, ligantes, receptores, transportadores transmembranares e sistemas enzimáticos, essas células contribuem para a secreção de neurotransmissores e fatores tróficos, regulam o metabolismo da retina e mantêm a homeostase de íons de água. Notavelmente, os RMCs foram recentemente identificados como uma fonte significativa de células-tronco regenerativas endógenas da retina, oferecendo novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças degenerativas da retina. Portanto, estudar as RMCs é essencial para entender os mecanismos patológicos subjacentes aos distúrbios da retina. Este estudo estabelece sistematicamente um protocolo experimental padronizado que inclui digestão de tripsina e purificação de RMCs primários, observação morfológica usando microscopia óptica invertida e coloração de hematoxilina e eosina (HE), identificação de proteínas específicas por meio de coloração por imunofluorescência e análise da pureza celular por citometria de fluxo. Este protocolo serve como uma referência valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações clínicas relacionadas a RMCs, apoiando a exploração de seus mecanismos em doenças da retina e avançando no desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

Introdução

As células gliais de Müller da retina (RMCs), a macroglia predominante na retina, formam o núcleo da unidade neurovascular da retina 1,2. Abrangendo quase toda a espessura da retina, os RMCs embainham quase todos os neurônios e microvasculaturas da retina. Seus processos se estendem para cima até a membrana limitante interna (ILM), formando os pés finais apicais, e para baixo até a membrana limitante externa (OLM), onde desenvolvem microvilosidades especializadas3. Essa arquitetura única permite que os RMCs funcionem como o principal andaime estrutural para a organização da retina 4,5.

As RMCs são enriquecidas com canais iônicos, ligantes, receptores, transportadores transmembranares e enzimas6 e participam do metabolismo da glicose retiniana por meio da glicólise7. Os canais iônicos de potássio (Kir2.1, Kir4.1) e as proteínas dos canais de água (AQP4, AQP9, AQP11) regulam colaborativamente a homeostase iônica e híon-hícola através da membrana celular, mantendo o equilíbrio fisiológico da retina7. Além disso, as RMCs absorvem e eliminam os neurotransmissores liberados pelos neurônios, incluindo glutamato, ácido γ-aminobutírico (GABA) e glicina 7,8.

Condições patológicas como retinopatia diabética7, glaucoma9 e retinite pigmentosa10 podem danificar os RMCs, romper a barreira hemato-retiniana, desencadear inflamação, aumentar a permeabilidade vascular e prejudicar a função retiniana. As RMCs também são reconhecidas como fontes intrínsecas latentes de células regenerativas da retina11,12. Em peixes e certos anfíbios, os RMCs podem se desdiferenciar em células progenitoras da retina que substituem os neurônios perdidos por lesão13. Em retinas de mamíferos adultos, as RMCs expressam proteínas marcadoras relacionadas a células-tronco14,15, concedendo-lhes o potencial de se diferenciar em neurônios retinianos e substituir células danificadas em doenças degenerativas, como degeneração macular relacionada à idade, glaucoma e retinopatia diabética16. Os RMCs primários imitam de perto seu estado in vivo e são de grande valor no estudo e tratamento de doenças degenerativas da retina. No entanto, a literatura contém poucos métodos estabelecidos para isolar e cultivar RMCs primários, particularmente de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais.

Este protocolo utiliza ratos SD neonatais de 3 a 5 dias de idade, sem preferência de gênero. Em condições estéreis, os globos oculares são enucleados e o tecido retiniano é digerido usando tripsina. As RMCs primárias são então isoladas por centrifugação e purificação para posterior cultura e passagem. A análise morfológica usando microscopia óptica invertida combinada com coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou que as células isoladas exibiam características de RMC. A coloração por imunofluorescência confirmou a expressão de marcadores proteicos específicos para RMC, incluindo glutamina sintetase (GS), proteína de ligação ao retinaldeído celular (CRALBP), vimentina, aquaporina-4 (AQP4) e canal de potássio retificador interno 4.1 (Kir4.1). A análise por citometria de fluxo após a marcação com anticorpos GS e CRALBP demonstrou uma pureza celular de ≥90%, o que atende aos critérios estabelecidos para experimentos biológicos baseados em RMC e garante a adequação para estudos funcionais subsequentes. Durante o processo experimental, as células na quarta passagem mostraram adesão reduzida ao frasco de cultura, alterações morfológicas e sinais de senescência, levando à morte celular. Portanto, apenas as células das três primeiras passagens foram usadas em experimentos subsequentes.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de Ética: 2024069). Cinquenta ratos Sprague-Dawley livres de patógenos específicos (FPS) (3-5 dias de idade, sexo não especificado, peso corporal 7-10 g) foram usados no estudo. Os animais foram obtidos comercialmente e alojados no Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Licença de Uso de Instalações No.: SYXK [Sichuan] 2024-049) em condições laboratoriais padrão. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e cultura de RMCs primários

  1. Preparação de itens experimentais
    1. Esterilize os seguintes itens sob luz ultravioleta por pelo menos 30 min na bancada limpa antes de usar: frascos de cultura T25, tubos e racks de centrífuga, pipetas e suportes, recipientes para resíduos líquidos, isqueiros, lâmpadas de álcool espirituoso e marcadores.
    2. Esterilize os seguintes itens em autoclave antes de usar: pontas de pipeta de 1 mL, placa de dobra, placas de Petri de vidro com tampas, pinças curvas, malha de náilon de 45 μm (malha 300), pinças dentadas, pinças desdentadas e microtesouras de córnea.
  2. Preparação ambiental: Desinfetar o ambiente e a mesa cirúrgica para dissecção do globo ocular com luz ultravioleta por mais de 30 min. Borrife álcool nas mãos do experimentador todas as vezes antes de entrar e depois de sair da bancada limpa. Defina a incubadora para 37 °C e 5% de CO2. Pulverize as mãos do experimentador com álcool antes e depois de abrir a incubadora.
  3. Preparação da solução: Prepare a solução de D-Hank, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM com alto teor de glicose), soro fetal bovino (FBS, inativado pelo calor), solução de penicilina/estreptomicina (100x) e solução de tripsina-EDTA a 0,25%.
    NOTA: Aqueça o DMEM e o FBS em banho-maria a 37 °C antes de usar.
    1. Prepare as soluções de D-Hank e PBS contendo penicilina / estreptomicina a 1% adicionando 100 μL de solução de penicilina / estreptomicina a 10 mL de solução de D-Hank ou PBS, respectivamente.
    2. Prepare o meio de cultura completo adicionando 100 μL de solução de penicilina/estreptomicina e 2 mL de FBS a 10 mL de DMEM com alto teor de glicose.
      NOTA: Prepare as soluções em uma bancada limpa de laboratório e use-as imediatamente quando possível. Conservar o meio de cultura completo a 4 °C e aquecer a 37 °C antes de cada utilização. Descarte se armazenado por mais de uma semana.
  4. Remoção de olhos
    1. Eutanasiar ratos SD neonatais por luxação cervical (sem asfixia por CO2) em uma bancada esterilizada seguindo protocolos aprovados institucionalmente. Mergulhe os corpos em álcool 75% por 5 min para desinfecção e, em seguida, transfira para um prato curvo estéril.
    2. Despeje a solução de D-Hank em dois recipientes de cultura de vidro de 10 cm.
    3. Use uma pinça dentada para abrir a pálpebra ao longo da fissura palpebral para expor o globo ocular.
    4. Use uma pinça desdentada mantida aberta e paralela à fissura palpebral para pressionar o orbital. Assim que o nervo óptico for alcançado e o globo ocular estiver exposto, feche a pinça para levantar e extrair o globo ocular.
    5. Coloque o globo ocular em uma placa de cultura de vidro com a solução de D-Hank, enxágue e transfira para outra placa com a solução fresca de D-Hank.
      NOTA: Certifique-se de que o globo ocular permaneça intacto. Idealmente, uma parte do nervo óptico deve permanecer ligada para facilitar a separação do tecido retiniano.
  5. Dissecção da retina
    1. Prepare uma placa de cultura vazia esterilizada com tampa e ajuste o microscópio.
    2. Coloque a placa de cultura de vidro da etapa 1.4.5 sob o microscópio. Use micro pinças oftálmicas curvas para fixar suavemente a região entre a córnea e o nervo óptico para expor a córnea.
    3. Perfure a junção corneoescleral usando uma microtesoura de córnea. Corte ao longo do limbo de forma circular e, em seguida, faça incisões esclerais simétricas de aproximadamente 2 mm de comprimento. Solte a pinça e prenda novamente na junção do nervo óptico e da esclera.
    4. Use uma segunda pinça para pressionar suavemente perto da raiz do nervo óptico, direcionando a pressão para a interface córnea-nervo óptico. Quando o tecido da lente aparecer, remova-o com cuidado e continue pressionando até que o tecido da retina surja.
      NOTA: Remova a lente com cuidado para evitar a extração inadvertida do tecido da retina.
    5. Transfira o tecido retiniano separado para outra placa de cultura estéril usando uma pinça. Cubra o prato, borrife-o com álcool e coloque-o na bancada limpa.
  6. Extração de RMCs primárias
    1. Ligue o interruptor de ventilação da bancada limpa.
    2. Abra a tampa do prato de cultura. Use uma pipeta com uma ponta de 1 mL para pipetar o tecido da retina para cima e para baixo cerca de 15 vezes para quebrá-lo em pequenos pedaços. Adicione 1 mL de tripsina a 0,25% e incube a 37 °C por 5 min.
    3. Retire a placa de cultura da incubadora e coloque-a na bancada limpa. Adicione 2 mL de meio completo e pipete suavemente para interromper a digestão.
      NOTA: Use o dobro do volume de tripsina para interromper a digestão. Por exemplo, se 1 mL de tripsina foi usado, termine com 2 mL de meio completo.
    4. Filtre a suspensão celular através de uma tela de náilon de 300 malhas em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o prato com PBS preparado e colete a suspensão restante.
    5. Centrifugue o tubo a 878 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT). Aspire e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 2 mL de meio completo e centrifugue novamente a 878 x g por 5 min para purificar as células.
    6. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 2 mL de meio completo. Adicione 3 ml de meio completo a cada balão T25 previamente e, em seguida, adicione 1 ml da suspensão celular. Agitar o balão em cruz e colocá-lo na incubadora.
    7. Realizar a primeira mudança de meio após 48 h de incubação. Retirar o balão da incubadora e colocá-lo na bancada limpa. Descarte o meio gasto e lave a superfície aderente às células três vezes com 1 mL de PBS.
      1. Adicione 5 mL de meio completo fresco. Continue trocando o meio a cada dois dias até que a confluência celular exceda 90% e, em seguida, prossiga com a subcultura.

2. Passagem de RMCs

NOTA: Passe as células quando a confluência exceder 90%. Neste protocolo, as culturas primárias normalmente requerem passagem 5-6 dias após o isolamento. O tempo da primeira passagem pode variar dependendo da densidade do revestimento. Ajustar a densidade celular para 4 x 103 células/ml e semear as células em frascos de cultura T25. Quando a confluência atingir >90% após 3-4 dias, prossiga com a passagem.

  1. Retirar o balão de cultura T25 da incubadora. Descarte o meio de cultura e lave as células três vezes com 1 mL de solução de PBS contendo penicilina/estreptomicina a 1%.
  2. Adicione 1 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% ao frasco e incube por 1 min e 30 s.
  3. Observar o balão ao microscópio invertido. Quando as células parecerem redondas, destacadas e começarem a flutuar, remova o frasco da incubadora. Transfira-o para a bancada limpa e adicione 2 mL de meio de cultura completo para terminar a digestão.
  4. Use uma pipeta para aspirar a suspensão celular. Pipete suavemente contra a parede do frasco para desalojar quaisquer células aderentes restantes.
  5. Transfira toda a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Enxágue a parede do frasco com 2 mL de PBS contendo penicilina / estreptomicina a 1% e adicione-o ao mesmo tubo. Centrifugue o tubo a 878 x g por 5 min em RT.
  6. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em um volume apropriado de meio completo. Passe as células na proporção de 1:2 ou 1:3, conforme necessário.
    NOTA: Use células na passagem 2 (P2) para experimentos a jusante (Figura 1).

3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

  1. Passagem de sementes 2 (P2) células em uma placa de 6 poços contendo lamínulas estéreis pré-colocadas a uma densidade de 2 x 105 células por poço. Adicione 2 mL de meio de cultura completo a cada poço. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, descarte o meio de cultura e enxágue suavemente cada poço duas vezes com 1 mL de PBS.
  2. Adicione 1 mL de fixador de paraformaldeído a 4% em cada poço e incube por 30 min para fixar as células. Descarte o fixador e lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.
  3. Adicione 1 mL de coloração de hematoxilina a cada poço e incube por 15 min. Descarte a solução de coloração e enxágue os poços 2-3 vezes com 1 mL de PBS.
  4. Observe as células ao microscópio. Se a coloração de hematoxilina parecer muito escura, use álcool de ácido clorídrico a 1% para diferenciar e remover o excesso de coloração citoplasmática. Lave 2-3 vezes com 1 mL de PBS.
  5. Adicione 1 mL de solução de coloração de eosina a cada poço. Observe a coloração ao microscópio por aproximadamente 30 s ou até que a intensidade de cor desejada seja alcançada. Enxágue os poços 2-3 vezes com 1 mL de PBS. Monte as lamínulas em lâminas usando resina neutra.

4. Coloração de imunofluorescência

  1. Semeie células P2 em uma placa de 6 poços contendo lamínulas estéreis pré-colocadas a uma densidade de 2 x10,5 células por poço. Adicione 2 mL de meio de cultura completo a cada poço.
    1. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, descarte o meio de cultura. Remova a lamínula e coloque-a em um frasco de coloração. Lave a lamínula três vezes com 1 mL de PBS, 5 min de cada vez.
  2. Adicione aproximadamente 50 μL de solução de permeabilização (Triton X-100: PBS = 1: 200) para cobrir as células. Incube em temperatura ambiente por 5 min e depois lave três vezes com 1 mL de PBS, 5 min de cada vez. Adicione aproximadamente 50 μL de solução de bloqueio de BSA a 3% e incube em temperatura ambiente por 20 min.
  3. Descarte cuidadosamente a solução de bloqueio. Adicione aproximadamente 200 μL de solução de anticorpo primário preparada em PBS para cobrir a lâmina: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) ou Vimentina (1:200). Colocar a lamínula numa câmara humidificada e incubar durante a noite a 4 °C.
  4. Lave a lamínula três vezes com 1 mL de PBS, 5 min de cada vez.
  5. Adicione aproximadamente 200 μL de anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho marcado com FITC17. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 50 min. Lave a lamínula três vezes com 1 mL de PBS, 5 min de cada vez.
  6. Manchar os núcleos com DAPI por 10 min. Lave três vezes com 1 mL de PBS, 5 min de cada vez.
  7. Adicione uma gota de meio de montagem anti-desbotamento ao slide. Monte a lamínula com o lado da célula voltado para baixo. Sele e observe sob um microscópio de fluorescência.

5. Citometria de fluxo

  1. Ajuste a concentração celular para 1,0 x 107 células/mL usando o tampão de coloração por citometria de fluxo.
  2. Alíquota de 100 μL da suspensão unicelular em dois tubos de amostra separados por condição. Designe um tubo como o controle negativo (não corado).
  3. Adicione 100 μL de meio de permeabilização A (do kit obtido comercialmente, consulte a Tabela de Materiais) a cada tubo. Misture delicadamente e incube por 15 min em temperatura ambiente no escuro.
  4. Adicione 3 mL de tampão de coloração por citometria de fluxo pré-resfriado a cada tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT e rejeitar o sobrenadante.
  5. Adicione 100 μL de meio de permeabilização B (do kit obtido comercialmente) a cada tubo e vórtice para misturar. Adicione 0,1 μL de anticorpo CRALBP aos tubos de amostra designados e 0,8 μL de anticorpo GS aos tubos correspondentes. Não adicione nenhum anticorpo ao tubo de controle negativo. Incubar a 4 °C no escuro durante 30-60 min.
  6. Adicione 3 mL de tampão de coloração por citometria de fluxo a cada tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT e rejeitar o sobrenadante.
  7. Ressuspenda cada tubo em 100 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo. Adicione 1 μL de IgG (H&L) anti-coelho de cabra conjugada com FITC a cada tubo corado com CRALBP e 1 μL de IgG (H&L) de cabra conjugada com PE a cada tubo corado com GS. Não adicione nenhum anticorpo ao tubo de controle negativo. Incubar a 4 °C no escuro durante 30-60 min.
  8. Adicione 3 mL de tampão de coloração por citometria de fluxo a cada tubo. Centrifugue a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
  9. Ressuspenda cada tubo em 300 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo. Prossiga com a análise de citometria de fluxo imediatamente; alternativamente, ressuspenda em 500 μL de paraformaldeído a 1%-4%, armazene a 2-8 °C no escuro e analise dentro de 24 h.
  10. Analise amostras negativas e positivas usando o software de citometria de fluxo.

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Resultados

Depois que as células primárias são semeadas no frasco de cultura, as mudanças subsequentes no meio e a passagem ajudam a eliminar as RMCs pouco aderentes e a remover os detritos celulares gerados durante a passagem, enriquecendo assim a população de RMC na cultura. As CMRs foram identificadas com base em sua morfologia usando um microscópio óptico invertido (Figura 1) e coloração de hematoxilina e eosina (H&E) (Figura 2). A ...

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Discussão

Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar RMCs primários de ratos SD neonatais. O protocolo abrange todas as etapas, incluindo preparações pré-experimentais, enucleação do globo ocular, isolamento do tecido retiniano e procedimentos passo a passo para extração, cultura, passagem e identificação do RMC. Ele também enfatiza as principais considerações que devem ser observadas ao longo de todo o processo de cultura de células, oferecendo orientação técnica padronizada para pesq...

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Divulgações

Todos os autores não têm conflito de interesse relacionado ao conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo da Fundação da Natureza da Província de Sichuan (2023NSFSC0690).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.1% Triton X-100SolarbioT8200
0.25% Tripsina-EDTAHyclone SH30042.01B
1% de ácido clorídrico álcoolBIOSYSTEMS3803651E
4% ParaformaldeídoSolarbioP1110
45μ m malha de nylon (300 mesh)SolarbioYA0926
Placa de 6 poçosServicebioIMC202302001
Placa de Petri de vidro de 6 cmNormax5058541
75% ÁlcoolKESHIGEA004
Aquaporina-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Incubadora de cultura de célulasThermoFORMA311
proteína de ligação ao retinaldeído celular (CRALBP)de HA721330HUABOI
Hunan XiangyiTDZ5-WS
Bancada limpaZHICHENGZHJH-C12
Tesoura de córneaJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
Solução D-HankSolarbioH1045
DMEM  meio de alta glicoseGibcoC11995500BT
Fetal Soro Bovino (FBS)Sbjbio life SciencesBC-SE-FBS01
FIX& PERM Medium AMultiSciencesGAS006/2
FIX& TampãoMultiSciencesGAS006/2
MultiSciencesS1001
Fluoromount-G Mídia de montagem fluorescenteSourthernBiotech0100-01
Anticorpo policlonal de glutamina sintetaseProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
Cabra 324 Anti-Coelho IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE
Cabra Anti- 323 Coelho IgG H & L FITCBiossbs-0295G-FITC
Kit de coloração de hematoxilina-eosina (HE) Máquina deSolarbioG1120
InstrumentoZealway(Xiamen) IncGI80DS
Microscópio de fluorescência invertidaNikon 
Microscópio de contraste de fase invertidaLeica Canal
4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Resina neutraSolarbioG8590-100
Solução de penicilina-estreptomicina (100&vezes;)HycloneSV30010
Phosphate Buffer salina (PBS) (pH7.2- 7.4)SolarbioP1020-500ml
Anticorpo secundário (anti-coelho de cabra marcado com FITC)ServicebioGB22303
ratos Sprague-Dawley Fornecedor verificado - Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd.Licença de Produção Nº: SCXK [Sichuan] 2020-0030
T25 Frasco de culturaCornning 
Tubos de Tornado: 15mLWHB Tubos de Tornado WHB-15-1
: 50mLWHB WHB-50-1
esterilizador de desinfecção ultravioletaGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
Centrífuga de coloração por citometria de fluxo PERM Medium B desinfecção de alta pressão SMZ1500 de potássio retificador interno DMIL 430639

Referências

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