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Artigo de método

Avaliação da Fração Perdida: Diversidade, Abundância e Massa de Microplásticos (1-300 μm) em Sistemas Aquáticos

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DOI:

10.3791/68148

⸱

22 de agosto de 2025

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia a ser aplicada a amostras aquáticas coletadas em filtros para detectar, identificar e quantificar MPs de tamanho mícron (1-300 μm). A microespectroscopia Raman pode identificar a estrutura química polimérica das partículas de MP e quantificar suas abundâncias em termos do número de partículas e sua massa em amostras de água.

Resumo

O protocolo aqui apresentado permite a quantificação de microplásticos (MPs) tão pequenos quanto ~ 1 μm de diâmetro, identificação precisa dos tipos de polímeros e estimativa do volume de partículas, permitindo criticamente o cálculo da massa de MP. Resultados representativos de amostras coletadas na Great South Bay (GSB), NY, mostraram que as partículas dentro da faixa de diâmetro esférico equivalente (ESD) de 1-6 μm foram as mais abundantes, com aproximadamente 75% das partículas medindo menos de 5 μm. Notavelmente, a etapa de pré-peneiramento não produziu partículas maiores que 60 μm, sugerindo que grandes MPs eram raros nos locais costeiros amostrados. Antes da filtração, uma etapa de oxidação química foi usada para remover detritos orgânicos, o que facilitou a filtração de volumes maiores de água (>1 L) de amostras discretas coletadas em garrafas e reduziu o entupimento do filtro. Embora essa abordagem tenha melhorado significativamente a eficiência da filtração, aspectos da metodologia ainda precisam ser refinados para reduzir o tempo total necessário para a preparação da amostra e análise de dados. A microespectroscopia Raman e o processamento de dados associado permanecem demorados, particularmente para analisar com precisão partículas menores que 10 μm em matrizes ambientais complexas. Os esforços contínuos estão focados em minimizar as incertezas analíticas, otimizar o trade-off entre a precisão da contagem de partículas e o tempo de processamento e reduzir artefatos no fluxo de trabalho de detecção.

Introdução

Os microplásticos (MPs) são um grupo altamente heterogêneo de partículas que variam amplamente em tamanho, forma, cor, densidade, composição química e outras propriedades físicas, tornando sua identificação e quantificação particularmente desafiadoras1. Uma variedade de métodos analíticos tem sido empregada em levantamentos de MP, desde técnicas visuais, como microscopia de luz2 , até abordagens químicas mais avançadas, como cromatografia gasosa de pirólise3. A microscopia de luz é um método comumente usado para caracterizar MPs maiores (tipicamente 0,5-5 mm) devido à sua simplicidade, velocidade e custo-benefício1. Ele permite a identificação visual e quantificação de partículas semelhantes a plástico, ao mesmo tempo em que fornece informações sobre a morfologia e estrutura da superfície2. No entanto, essa técnica não fornece informações químicas sobre a composição química e depende da experiência do analista. A identificação incorreta é uma limitação bem documentada da análise visual, com taxas de erro relatadas variando de 20% a 70%, principalmente para partículas pequenas e transparentes. Tais erros podem superestimar significativamente as concentrações de MP em amostras ambientais4.

Por outro lado, a cromatografia gasosa de pirólise (GC) combinada com a espectrometria de massa (MS) pode fornecer informações detalhadas sobre a composição química dos MPs por meio da análise de produtos de degradação térmica3. Quando emparelhado com uma etapa de dessorção térmica, também pode detectar aditivos plásticos durante a mesma análise5. No entanto, este método requer a pré-seleção manual de partículas semelhantes a plástico e sua colocação cuidadosa no sistema de pirólise, resultando em baixo rendimento da amostra1.

Para superar as limitações dos métodos tradicionais, técnicas automatizadas que permitem a identificação e quantificação de MPs estão se tornando cada vez mais essenciais. A espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR) fornece identificação precisa do polímero por meio de suas impressões digitais espectrais exclusivas 6,7,8. Esses métodos de espectroscopia vibracional detectam vibrações moleculares induzidas por luz, laser para Raman e infravermelho para FTIR, produzindo espectros que refletem estruturas moleculares específicas7. Ambas as técnicas avançaram significativamente na detecção e caracterização de pequenas partículas de MP (<300 μm) em várias matrizes ambientais8. Eles reduzem os falsos positivos confirmando quimicamente partículas semelhantes a plástico, minimizam os falsos negativos e não são destrutivos. Quando acopladas à microscopia (microespectroscopia), essas técnicas permitem a identificação e quantificação de partículas poliméricas menores que 0,3 mm (com detecção de μFTIR até ~10 μm e μRaman até ~0,3 μm)8. Cada método, no entanto, tem limitações: Raman oferece maior resolução espacial e detecção aprimorada para certos polímeros (por exemplo, poliestireno), mas é mais suscetível à interferência de fluorescência e normalmente requer tempos de aquisição mais longos. No entanto, a microespectroscopia Raman pode detectar partículas menores que 0,3 μm, cobrindo uma faixa de tamanho de microplástico mais ampla do que a imagem FTIR 8,9.

A principal ferramenta para o trabalho descrito aqui é um microespectrofotômetro Raman confocal disponível no Laboratório de Imagem Molecular NAno-Raman (NARMIL) da SoMAS. O protocolo foi otimizado para detectar, identificar e quantificar MPs de tamanho micro (<300 μm) em filtros de amostras de água que geralmente são excluídas quando redes de plâncton ou manta são usadas para amostrar plásticos marinhos. Além disso, é necessário um processo de quimi-oxidação para reduzir a presença de resíduos não plásticos (detritos orgânicos). Isso minimiza a interferência analítica antes da análise microespectroscópica Raman e, mais importante, evita o entupimento dos poros do filtro, permitindo a filtração de volumes maiores de água. Usando essa tecnologia, é possível detectar partículas de MP na fração de tamanho submicrométrico a milimétrico coletadas em filtros de amostras de água e permite o cálculo de concentrações específicas de MP, tamanhos de partículas e massas.

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Protocolo

Este protocolo foi modificado a partir da versão original9. O protocolo é uma orientação para a análise de amostras aquáticas (água potável, rio, lago, litoral ou oceano aberto) para extrair, detectar e quantificar MPs (<300 μm) em filtros. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Controle de qualidade

  1. Certifique-se de filtrar todos os reagentes através de um filtro de membrana de 0.22 μm antes de usar.
  2. Certifique-se de que o pessoal use jalecos de algodão (sem materiais sintéticos) e lave as mãos antes e entre o manuseio da amostra.
  3. Enxágue o equipamento de filtragem com água destilada filtrada a 0.22 μm antes e entre as filtrações. Cubra com papel alumínio limpo quando não estiver em uso.
  4. Espaços em branco de campo: Encha os frascos de amostra enxaguados com água destilada filtrada de 0,22 μm e processe como amostras ambientais.
  5. Brancos de laboratório: Processe 1 L de água destilada filtrada a 0,22 μm através de filtros Al2O3 ao lado de cada lote de amostra.

2. Coleta e preparação de amostras de água natural para quantificação de MP

  1. Pré-enxágue todos os sample frascos (incluindo Niskin e recipientes de vidro) com água destilada filtrada de 0,22 μm para minimizar a contaminação.
  2. Amostras discretas de coluna de água (>1 L) de sistemas aquáticos podem ser coletadas usando métodos de amostragem padrão, por exemplo, garrafas de vidro (água de superfície) ou garrafas de Niskin de cloreto de polivinila (PVC) montadas em roseta (coluna de água) e transferidas diretamente para garrafas de vidro.
  3. Pré-filtre a água coletada usando peneiras metálicas de 200 μm e 60 μm para remover detritos orgânicos e separar MPs em frações de tamanho.
    NOTA: As partículas retidas podem ser identificadas diretamente sob o microscópio.
  4. Armazenar a água que passa pela peneira metálica de 60 μm em garrafas de vidro. Posteriormente, filtrar esta fracção em filtros de membrana de óxido de alumínio (Al2O3) (25 mm de diâmetro, tamanho dos poros de 0,2 μm).

3. Quimi-oxidação de amostras de água

NOTA: Para minimizar a interferência analítica de partículas biogênicas abundantes, as amostras são limpas por oxidação química antes da análise microespectroscópica Raman.

  1. Combine 100 mL de peróxido de hidrogênio a 30% (v / v) com 1 L de amostra em um recipiente de vidro e misture bem.
    CUIDADO: Manuseie H2O2 com cuidado - oxidante forte, pode causar irritação na pele e nos olhos. Use luvas e óculos de proteção e siga os procedimentos de segurança do laboratório.
  2. Cubra o recipiente com uma tampa ou papel alumínio e leve ao forno a 60 °C por ~10 h.
  3. Deixe a amostra esfriar por 10 min e, em seguida, prossiga para a filtração ainda quente.

4. Filtração de amostras de água

NOTA: Devido à fragilidade inerente do filtro, deve-se tomar cuidado para não dobrar os filtros de membrana Al2O3 durante a montagem e remoção, manuseando exclusivamente o filtro pelo anel anular de polipropileno ligado à membrana.

  1. Em uma capela de fluxo laminar, filtre amostras e blanks de 1 L usando um sistema de filtragem todo em vidro com base de vidro sinterizado e braçadeira de metal.
  2. Após a filtração, enxágue os filtros com água destilada filtrada a 0.22 μm.
  3. Monte o filtro em uma lâmina de microscópio sem lamínula para análise Raman.

5. Análise microespectroscópica Raman de partículas MP filtradas

NOTA: Um microespectrofotômetro Raman confocal e seu software são usados como método analítico para identificar e quantificar partículas de MP. O instrumento é configurado com um microscópio de epifluorescência vertical modificado, um estágio xyz motorizado controlado por computador com tamanho de passo de 0,1 μm em todas as dimensões, quatro linhas de laser (laser de íons Ar+ de 457/514 nm, laser He/Ne de 633 nm, laser de diodo de 785 nm) e um detector CCD refrigerado por peltier de 1.040 × 256.

  1. Usando o recurso de aquisição de imagem no software Raman, defina a configuração do instrumento para análise de MPs de amostras aquáticas.
    1. Laser: 633 nm He/Ne a ~9,3 mW de potência do laser (via objetiva de 50×).
    2. Grade: 1200 linhas/mm.
    3. Faixa espectral: 200-2500 cm-1.
    4. Tempo de exposição: 0,7 s/espectro.
  2. Configure uma grade dentro de uma região de interesse (ROI) tomando espectros a cada 1 μm nas dimensões x e y.
  3. Defina cada ROI como uma grade de 100 μm x 100 μm na imagem da câmera (10.000 μm2).
    NOTA: A área de ROI pode ser modificada; Por exemplo, áreas menores reduzirão o tempo total de análise.
  4. Analise ~40 ROIs por filtro, selecionados aleatoriamente usando um modelo de padrão cruzado para representar a distribuição espacial do MP em toda a área de filtro exposta.
  5. Após a coleta automatizada de dados, use o recurso de aquisição de imagem no software para produzir mapas químicos 2D detalhados de cada ROI.
  6. A partir de cada mapa químico, identifique e quantifique as partículas de MP usando a análise de componentes (método de correlação de mínimos quadrados não negativos) de acordo com os recursos do software.
  7. Compare espectros com bibliotecas de referência. Aceite correspondências com pontuação >60 (pontuação da biblioteca interna 0-100) como MPs10 confirmados.

6. Enumeração quantitativa baseada em filtro de partículas MP

  1. Depois de totalizar o número de partículas de ~40 ROIs, calcule o número de partículas MP por litro de amostra (N), de acordo com a equação 111.
    figure-protocol-1(1)
    onde Af é a área total exposta do filtro (mm2), n é o número total de partículas MP contadas somadas em todas as ROI examinadas, b o número de ROI examinado, M o tamanho da área de uma ROI (mm2) e V o volume (l) da água filtrada da amostra.
  2. Estabelecer a incerteza analítica do número total de partículas (N) em cada amostra, calculando o erro-padrão de todo o ROI contado por amostra.
  3. Relate o número total de partículas por L como N ± 1S.E.

7. Cálculos de tamanho, volume e massa de partículas

NOTA: Determine as dimensões, área e diâmetro esférico equivalente (ESD) de cada partícula com o auxílio de um software de análise de imagem.

  1. Determine a área contando o total de pixels positivos de plástico atribuídos a cada imagem de partícula.
  2. Use esta área de partícula (Ap) para calcular o ESD aplicando a equação 211:
    figure-protocol-2(2)
  3. Calcule uma estimativa de volume elipsóide idealizada para cada partícula usando a equação 312.
    figure-protocol-3(3)
  4. Calcule as massas (M) de cada polímero plástico no pool de MP usando estimativas de volume e densidades específicas publicadas (ρ; g cm3) de cada polímero plástico (ou seja, M = ρV). A massa é geralmente relatada em μg/L
    NOTA: Para estimar a incerteza propagada no cálculo da massa (erro relativo da massa, RE = DP/média) para cada partícula, a incerteza analítica no algoritmo de volume e na densidade média é considerada aplicando a seguinte equação13:
    figure-protocol-4(4)
    Onde R.E. vol é o erro relativo (S.E. da inclinação/inclinação) da inclinação de regressão linear (3-D e "volume 2-D")9. R.E. den são as variações relativas (S.E. / média) na faixa de valores de densidade relatados para cada polímero contido em uma partícula específica.

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Resultados

Aqui, são apresentados os resultados obtidos usando a versão mais recente da metodologia. O método foi modificado em relação à sua aplicação original 9,14. As amostras usadas neste artigo fazem parte de um projeto para avaliar a poluição por MP em três principais corpos d'água costeiros de Long Island, NY: Great South Bay, Peconic Estuary e Shinnecock Bay. Os resultados aqui apresentados servem como uma prova de conceito para nosso método aprimorado, em vez de um...

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Discussão

Essa metodologia permite a quantificação de partículas microplásticas (MP) tão pequenas quanto 1 μm de amostras de água coletadas em filtros, permitindo medições detalhadas de abundância de partículas, composição química, tamanho e massa. No entanto, é essencial reconhecer e abordar as fontes de incerteza inerentes a essa abordagem, particularmente ao analisar partículas menores que 10 μm em matrizes ambientais complexas.

A atual falta de procedimentos padroni...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Larissa Chraim, Anthony Hill, Alanna Chen, Maya Butkevich e Leslie Mejia por sua assistência no laboratório e na análise de dados. Todos os dados espectrais Raman foram produzidos no Laboratório de Imagem Molecular NAno Raman (NARMIL) da Escola de Ciências Marinhas e Atmosféricas da SBU, um recurso comunitário dedicado a aplicações em ciências ambientais e fundado com a concessão NSF-MRI OCE-1336724. A pesquisa foi parcialmente apoiada por uma bolsa inicial da Stony Brook University (SBU) e pela SBU Presidential Dissertation Completion Fellowship CF21.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folha de alumínio qualquer marca comercial
Peneiras analíticas em aço inoxidávelRetsch GmbH, AlemanhaRUÍDO 4188
Filtros AnodiscO que homem
Suporte de filtroMarca Fisher-Millipore SigmaXX1012542
Garrafas de vidroMarca Fisher-Millipore Sigma02-912-313Qualquer recipiente de vidro funciona para o processo de amostragem
Funil de vidroMarca Fisher-Millipore SigmaXX1012514
Peróxido de hidrogênio 30%Inovando Ciências7722-84-1
Microespectrofotômetro Raman confocal inVia Renishaw
Caudal laminarLabconco ou qualquer outro capuz laminar para uso laboratoy
Braçadeira metálicaMarca Fisher-Millipore SigmaXX1012503
Pinça metálicaMarca Fisher-Millipore Sigma13-820-061
Lâminas de microscópioThermo Fisherhttps://www.thermofisher.com/
Luvas de nitriloKimtech55080-54
Nitrocelulose membrana fliters 0.22Tecnologia de filtro GVS 1214898
Forno de calor radialLinha de Instrumentos de Laboratório 3609
Bomba de vácuoWelch25468-01 UMA
WiRE 5.2Renishaw

Referências

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