Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Summary

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Abstract

As células dendríticas tolerogênicas (tolDCs) são um subconjunto de células dendríticas (DCs) que são conhecidas por influenciar as células T virgens em direção a um fenótipo de células T reguladoras (Treg). As TolDCs estão atualmente sob investigação como terapias para autoimunidade e transplante, tanto como terapia celular quanto como método para induzir tolDCs de DCs endógenas. Até o momento, no entanto, o número de agentes conhecidos para induzir tolDCs de DCs virgens é relativamente pequeno e sua potência para gerar Tregs in vivo tem sido inconsistente, particularmente terapias que induzem tolDCs de DCs endógenas. Isso oferece uma oportunidade de explorar novos compostos para gerar tolerância.

Aqui descrevemos um método para testar novos compostos imunomoduladores em DCs derivadas de monócitos (moDCs) in vitro e validar sua funcionalidade para gerar Tregs autólogas. Primeiro, obtemos PBMCs e isolamos monócitos CD14⁺ e células T CD3⁺ usando kits de separação magnética disponíveis comercialmente. Em seguida, diferenciamos monócitos em moDCs, tratamo-los com um imunomodulador estabelecido, como rapamicina, dexametasona, IL-10 ou vitamina D3, por 24 h e testamos sua alteração em marcadores tolerogênicos como validação do protocolo. Finalmente, co-cultivamos as tolDCs induzidas com células T autólogas na presença de estimulação anti-CD3 / CD28 e observamos mudanças nas populações de Treg e proliferação de células T. Prevemos que este protocolo seja usado para avaliar a eficácia de novos agentes imunomoduladores para reprogramar DCs já diferenciadas em direção a tolDC.

Introduction

As células dendríticas (DCs) são mediadores críticos entre a imunidade inata e adaptativa. As DCs, que residem principalmente nas membranas mucosas, pele e tecido linfoide, são as células apresentadoras primárias de antígenos (APCs)¹. As DCs captam proteínas estranhas e processam e as apresentam nas principais proteínas de histocompatibilidade (MHC) para células T virgens. As DCs expressam especificamente proteínas MHC classe II, como o antígeno leucocitário humano-DR (HLA-DR) em humanos. O estado de ativação das DCs após a exposição ao antígeno é crítico para a resposta das células T a jusante

Protocol

Todas as amostras de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram obtidas do Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia de doadores não identificados com aprovação prévia do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade da Pensilvânia com o consentimento do paciente.

Opcional: Enquanto neste método, usamos PBMCs recém-isolados obtidos de um laboratório acadêmico, os PBMCs podem ser isolados de sangue total ou produtos sanguíneos enriquecidos com leucaférese. Recomendamos o uso do método de centrifugação com gradiente de densidade, pois este é um m....

Results

Descrevemos um protocolo para PBMCs humanos, isolamos células T CD3⁺ e monócitos CD14⁺ usando kits de separação magnética disponíveis comercialmente, diferenciamos monócitos em CD14^-, HLA-DR⁺, CD141⁺, CD1c⁺ moDCs usando GM-CSF e IL-4, tratamos por 24 h e co-cultivamos com células T autólogas com estimulação anti-CD3/CD28 por 72 h. Um esquema experimental é mostrado na Figura 1.

Isolamento de.......

Discussion

Aqui descrevemos um método confiável e versátil para avaliar a funcionalidade de agentes imunomoduladores para induzir tolDCs a partir de moDCs e validar sua funcionalidade para gerar Tregs a partir de células T autogênicas ex vivo. Existem várias etapas críticas neste protocolo. Primeiro, os monócitos são células notoriamente sensíveis e devem ser obtidos de PBMCs frescos, não previamente congelados, para obter os melhores resultados. Os monócitos devem ser isolados o mais rapi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1-10 µ L Pontas de pipeta filtradas	VWR	76322-158	Tubo de
centrífuga de 1,5 mL	geral VWR	77508-358	Pipetas
serológicas de 10 mL	geral VWR	414004-267	Cultura celular geral
100-1000 µ L Pontas de pipeta filtradas	VWR	76322-164
Tubo cônico de 15 mL	VWR	77508-212	Cultura celular geral
20-200 µ L Pontas de pipeta filtradas	VWR	76322-160	Cultura de células gerais
2-mercaptoetanol	MP Biomedical	194834	T Cell Culture
Tubo cónico de 50 mL	VWR	21008-736	Cultura de células geral
60 x 15 mm Prato, Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	Cultura de células geral
96 Placa inferior cónica (V) de poços, superfície não tratada	Thermo Fischer	277143	Cultura de Células Gerais
96 poços Placa de Fundo Plano	Thermo Fischer	161093	Cultura de Células Geral
APC/Cyanine7 anti-humano CD272 (BTLA) Anticorpo	Biolegend	344518	Citometria de Fluxo
Attune NxT (Laser Vermelho/Azul, 7 Canais)	Thermo Fischer	A24863	Citometria de Fluxo
BSA	Thermo Fischer	15260-037	General Cell Anticorpo
monoclonal de cultura CD14 (61D3), PE	Thermo Fischer	12-0149-42	Citometria de fluxo
CD1c Anticorpo monoclonal (L161), PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0015-42	Citometria de fluxo
CD209 (DC-SIGN) Anticorpo monoclonal (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5	Thermo Fischer	45-2099-42	Citometria de fluxo
CD25 Anticorpo monoclonal (CD25-4E3), APC	Thermo Fischer	17-0257-42	Citometria de Fluxo
CD274 (PD-L1, B7-H1) Anticorpo Monoclonal (MIH1), PE	Thermo Fischer	12-5983-42	Citometria de Fluxo
CD4 Anticorpo Monoclonal (RPA-T4), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42	Citometria
de Fluxo CD40 Anticorpo Monoclonal (5C3), APC	Thermo Fischer	17-0409-42	Citometria de Fluxo
CD40 Anticorpo Monoclonal (5C3), APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	Citometria de Fluxo
CD69 Anticorpo Monoclonal (FN50), PE	Thermo Fischer	MA1-10276	Citometria
de Fluxo CD86 Anticorpo Monoclonal (BU63), FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	Citometria
Fluxo CD8a Anticorpo Monoclonal (RPA-T8), PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0088-42	Citometria
de FluxoFundo cônico (poço em V) Placa de 96 poços	citometria de fluxo	Thermo Fischer	2605
de	células T	Thermo Fischer	430488 de 2
mL (DMSO), grau de sequenciamento	Thermo Fischer	20688	Cultura de células gerais
DPBS	Thermo Fischer	14200166	Cultura de células gerais
EasySep Kit	de isolamento de monócitos humanosStem Cell Technologies	19359	Kit
Isolamento de Células T Humanas EasySep	Stem Cell Technologies	17951	Separação de Células
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000	Separação de Células
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G
Poliestireno de Fundo Redondo Falcon de Cultura de Células, 5 mL	Stem Cell Technologies	38025
Inibidor de ligação ao receptor Fc de separação celular Anticorpo policlonal	Thermo Fischer	14-9161-73	Citometria de fluxo
Soro bovino fetal	Thermo Fischer	A5670701	Cultura de células geral
Corante de viabilidade fixável eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	Citometria de fluxo
Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição	Thermo Fischer	00-5523-00	Citometria de Fluxo
FOXP3 Anticorpo Monoclonal (PCH101), PE-Cyanine5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	Citometria de Fluxo
HBSS	Thermo Fischer	14170-112	Cultura de Células Geral
Soro Bovino Fetal Inativado por Calor	Thermo Fischer	A5670801	Cultura de Células Geral
HEPES (1 M)	Thermo Fischer	15630106	moDC Cell Anticorpo
monoclonal HLA-DR de cultura (L243), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	Citometria de fluxo
Ativador de células T CD3 / CD28 / CD2	StemCell Technologies	10970	Proteína
recombinante GM-CSF humana para	Thermo Fischer	300-03	moDC
Kit ELISA IL-10 humano, Thermo Fischer		BMS215-2HS	Elisa
IL-4 Humano, Proteína Recombinante Sem Animais	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC Cultura de Células
PBMC Humano (Recém-Isolado)	UPenn HIC	N/A
Células TNF alfa ELISA Kit Thermo	Fischer	BMS223-4	ELISA
Microscópio de Luz (DMi1)	Lucia	391240	de Cultura de Células Geral
(LPS)	Invivogen	tlrl-eblps	moDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Stain Kit	Thermo Fischer	L34975	Flow Cytometry
MEM Non-Essential Acids Solution (100x)	Thermo Fischer	11140050	T Cell Culture
Penicilina-Estreptomicina (100x)	Thermo Fischer	15140122	General Cell Culture
Pipeta Controller	VWR	77575-370	Rapamicina de Cultura de Células em Geral
, 98+%	Thermo Fischer	J62473. MF	moDC Cell Culture
RPMI 1640 com Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	Tampão de Separação de Cultura de Células Gerais
	Stem Cell Technologies	20144
Coquetel de Estimulação de Células T de Separação de Células (500x)	Thermo Fischer	00-4970-93	Contas
Compensação de Cultura de Células T UltraComp eBead Plus	Thermo Fischer	01-3333-41	Flow
Conjunto de pipetas variáveis	Fischer Scientific	05-403-152	Cultura celular geral