En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Resumo

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido < 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

Resumo

A complexa estrutura laminar da retina apresenta desafios significativos para o mapeamento molecular espacial abrangente. As técnicas atuais para investigar a arquitetura do tecido e as interações moleculares são limitadas por restrições técnicas que comprometem as relações espaciais ou restringem o perfil molecular. Métodos existentes, como corte transversal, preparações de montagem inteira, dissociações químicas ou mecânicas e seções espessas na face interrompem a integridade do tecido, perdem o contexto espacial crítico ou, na maioria das vezes, são simplesmente incompatíveis com plataformas de sequenciamento espacial de alta dimensão.

Este estudo apresenta uma técnica de crioseccionamento que produz cortes finos (<20 μm) na face , preservando as relações espaciais essenciais para mapear as distribuições das células da retina. O método mantém a integridade do RNA e a arquitetura do tecido enquanto gera seções compatíveis com plataformas de análise molecular de alto rendimento. A integridade do RNA é mantida porque esta técnica secciona tecido fresco congelado, que os fabricantes de plataformas transcriptômicas espaciais suportam oficialmente em relação ao tecido pós-fixado. Validamos essa abordagem usando vários métodos de perfil molecular, demonstrando integração bem-sucedida com hibridização in situ manual de RNAscope (12 alvos) e sequenciamento espacial de Xenium (300 alvos). A técnica preserva consistentemente a arquitetura do tecido nas amostras, mantendo a qualidade do RNA adequada para essas aplicações moleculares sensíveis.

Esse avanço metodológico permite novas investigações sobre distribuições de tipos de células da retina, gradientes moleculares entre lâminas e aspectos espaciais da patologia da retina. A versatilidade e compatibilidade da técnica com as plataformas modernas de biologia espacial fornecem uma base para o mapeamento molecular abrangente da complexa organização celular da retina.

Introdução

Os neurônios da retina desenvolveram topografias espaciais que facilitam o processamento de informações, o que, em muitas espécies, resulta em especializações grosseiras como fóveas, área central e estrias ^1,2,3. Em contraste com a diversidade bem compreendida da distribuição dos fotorreceptores, a especialização espacial da produção da retina, formada pelas células ganglionares da retina (RGCs), é menos clara. Para a maioria das espécies, as distribuições espaciais dos RGCs são totalmente desconhecidas. Mesmo para o camundongo, sem dúvida um, se não o modelo de vertebrado mais bem estudado da função visual, menos de um terço dos subtipos de RGC foram mapeados com técnicas tradicionais como imuno-histoquímica de montagem inteira². Essas técnicas falham porque a maioria dos subtipos de RGC não possui um marcador genético específico. Em vez disso, informações moleculares de dimensão superior são necessárias para uma classificação precisa do RGC⁴ por meio do sequenciamento de RNA de célula única ^5,6,7.

As informações sobre a distribuição do RGC são importantes, pois as topografias observadas no camundongo demonstram correlatos ecológicos claros entre o posicionamento do RGC e a função visual. O exemplo mais marcante é a organização espacial dos RGCs ɑON-S, que se agrupam na retina temporal. Essa região recebe a imagem da presa⁸ durante os comportamentos de caça⁹. Também é bem apreciado que os subtipos de RGC são diferencialmente suscetíveis à doença¹⁰, e algumas doenças comuns como o glaucoma têm um componente espacial para sua progressão^11,12. Assim, uma questão importante que o campo enfrenta é: qual é a organização espacial dos subtipos de RGC à medida que revestem a retina¹? Essa lacuna no conhecimento está atualmente limitando os insights sobre outros comportamentos e doenças guiados visualmente.

O foco do presente método é abordar essas lacunas de conhecimento molecular por meio de uma abordagem de criosseccionamento em face que preserva as relações espaciais e permite análises moleculares de alta resolução. Plataformas modernas de sequenciamento espacial, como o Xenium da 10X, representam um avanço transformador no perfil molecular, oferecendo insights sem precedentes sobre a organização dos tecidos e as interações celulares. No entanto, essas plataformas, juntamente com técnicas de plex inferior como RNAscope e métodos de sequenciamento com código de barras espacialmente como o Visium, compartilham uma restrição técnica crítica: elas exigem seções de tecido mais finas que 20 μm. Esse requisito apresenta um desafio particular para o tecido retiniano, que normalmente mede 200 μm de espessura.

Até o momento, os pesquisadores confiaram principalmente em seções transversais ao aplicar essas tecnologias ao tecido retiniano¹³. Embora as seções transversais revelem efetivamente relações moleculares dentro das camadas nucleares e plexiformes no contexto de circuitos verticais, elas são menos adequadas para capturar as distribuições espaciais mais amplas de células da retina que as preparações de montagens inteiras tradicionalmente revelaram⁸. Tentativas recentes de seccionamento em face foram limitadas por restrições de espessura de seção, com estudos alcançando apenas seções de 50 μm com¹⁴ de espessura para plataformas modernas de análise molecular high-plex. Outras abordagens históricas que foram implantadas para estudar a lâmina retiniana individual, mas não são compatíveis com as técnicas modernas de sequenciamento espacial, incluem digestão enzimática, combinada com dissociação mecânica^15,16 ou dissociações mecânicas isoladas 17,18,19,20. Aqui, apresentamos uma nova técnica de crioseccionamento projetada especificamente para tecido retiniano fino e curvo que supera essas limitações. Resumidamente, nosso método envolve a extração da câmara posterior do olho, criando cortes em relevo através da retina e da esclera, achatando o tecido com retina interna contra uma lamínula, incorporando o tecido na OCT e, finalmente, criosseccionando da retina externa para a interna (Figura 1). Nosso método mantém relações espaciais enquanto produz seções finas o suficiente (<20 μm) para ferramentas de biologia espacial de alta dimensão, conforme validado por meio da implementação bem-sucedida com RNAscope manual (12 alvos) e a plataforma automatizada Xenium (300 alvos), demonstrando compatibilidade em diferentes escalas de complexidade de análise molecular.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo e com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e diretrizes institucionais relevantes que aprovam esses métodos supervisionados pela Universidade do Colorado. Todas as etapas relacionadas ao uso de animais e eutanásia devem seguir os regulamentos locais e as licenças experimentais. Todos os camundongos foram alojados com cuidados padrão em uma instalação veterinária credenciada com acesso gratuito a comida e água. Esta técnica de criosseccionamento facial baseia-se em técnicas padrão de dissecção de retina otimizadas para camundongos C57BL / 6. Para desenvolver esta técnica, foram utilizados aproximadamente 150 camundongos de ambos os sexos, com idades entre 6 semanas e 2 anos de idade. A técnica final comunicada aqui tem uma taxa de sucesso de aproximadamente 95%, independentemente das características demográficas do camundongo. Observe que, se uma temperatura não estiver listada para uma etapa, a temperatura ambiente de aproximadamente 20-25 °C é esperada. As soluções sem a temperatura listada funcionarão se refrigeradas e, portanto, a faixa de temperatura de trabalho para soluções é de 4-25 °C.

1. Dissecção

1. Anestesie o camundongo com isoflurano e valide a anestesia com pinça do dedo do pé, ou siga as regras e regulamentos locais para induzir e confirmar a anestesia, pois outros métodos são igualmente apropriados.
2. Eutanasiar o rato por luxação cervical: prenda a cabeça do rato com uma mão e a base da cauda com a outra, depois puxe em direções opostas. Realize a eutanásia secundária por decapitação.
3. Marque o pólo temporal do globo na córnea para manter a orientação e criar um ponto fraco para a dissecção (Figura 2B e Figura 3A).
4. Mergulhe o globo em solução de Ames em um prato contendo um pedaço de papel de filtro (maior que o globo, mas menor que o prato).
   NOTA: O uso de soluções diferentes de Ames resultará em deterioração da retina (Figura 4A).
5. Usando uma pinça afiada # 5 e uma tesoura de íris, remova cuidadosamente toda a musculatura, fáscia, vasculatura e nervos do globo ( Figura 2E, F e Figura 3B ) sem perfurar a esclera ( Figura 2D ).
   NOTA: A punção da esclera durante esta etapa ( Figura 4B ) resultará em hérnia de tecido ( Figura 4C ).
6. Posicione a ponta de uma lâmina de tesoura de íris perpendicular à marca da córnea, com uma tesoura paralela à cabeça do nervo óptico. Perfure o globo nesta posição (Figura 3C,D).
7. Faça uma única incisão limpa através da córnea e do limbo, continuando na esclera e na retina em direção à cabeça do nervo óptico (Figura 3E).
   NOTA: Não corte a cabeça do nervo óptico ou a esclera e a retina se separarão. O comprimento exato desta incisão varia dependendo do tamanho do globo, que pode variar drasticamente entre animais velhos e jovens, bem como em algumas linhas Cre em relação a animais selvagens. Recomendamos deixar cerca de 1 mm de tecido entre a extensão mais profunda desta incisão e a cabeça do nervo óptico.
8. Posicione a lâmina perpendicularmente ao corte inicial (Figura 3F,G), aproximadamente 1 mm posterior ao limbo (Figura 2C). Comece a cortar radialmente através da esclera e da retina.
   1. Mantenha uma linha de corte consistente posterior e paralela ao limbo usando pinças afiadas para guiar e girar o globo. Embora minimizar os cortes seja o ideal, priorize a manutenção de um caminho radial limpo. Se a retina e a esclera se separarem, reposicione a lâmina da tesoura da íris para cortá-las juntas.
      NOTA: Cortar o limbo pode causar a separação da retina da esclera durante a extração do cristalino. Pequenos recortes e rotações são aceitáveis. Evite aplicar força para prendê-lo, pois isso corre o risco de hérnia de retina.
   2. Estime a distância posterior de 1 mm usando a largura média da lâmina da tesoura da íris. Quando incerto, erre para uma posição mais posterior, pois a conexão da retina com o limbo se curva internamente. Um corte mais posterior facilita a extração plana da retina.
9. Depois de concluir o corte radial paralelo ao limbo, inspecione as conexões retinianas restantes. Corte-os cuidadosamente com uma tesoura de íris até que as seções anterior e posterior do globo estejam separadas.
10. Usando dois pares de pinças afiadas # 5, separe suavemente as porções anterior e posterior do globo (Figura 3H). Em camundongos mais velhos, fibras transparentes podem conectar o cristalino ao copo retiniano; Corte-os cuidadosamente com uma tesoura de íris, minimizando a separação retina-escleral.
    NOTA: A lente deve permanecer presa ao limbo e à córnea.
11. Usando o papel de filtro como plataforma de suporte, corte a retina em um padrão de folha de trevo (também conhecido como cruz de ferro) com uma tesoura de íris (Figura 3I-K).
    NOTA: As incisões da folha do trevo devem ser mais curtas do que a incisão de orientação primária feita inicialmente através do limbo se a orientação de gravação com esta fatia for desejada. Recomendamos reduzir o tamanho dessas três novas incisões radiais para ser aproximadamente 1-2 mm mais curto que a incisão primária. Se uma característica diferente, como o gradiente de opsina, for usada para orientação, é apropriado que todas as incisões tenham o mesmo comprimento, mantendo sempre aproximadamente 1 mm de tecido entre a parte mais profunda da incisão e a cabeça do nervo óptico para evitar a separação da retina e da esclera.
12. Repita a dissecção com o segundo olho. Para minimizar a necrose, complete a remoção da câmara anterior do segundo olho dentro de 10 minutos após a eutanásia.

2. Criopreservação

1. Prepare uma pipeta de plástico de transferência descartável cortando a ponta para criar uma abertura maior do que a retina e a esclera dissecadas (doravante denominadas retina).
2. Sugue suavemente a retina na pipeta e deposite-a em uma lâmina de microscópio de vidro. Usando um lenço de laboratório, remova cuidadosamente o excesso de solução de Ames ao redor da retina até que ela não possa mais flutuar livremente e possa ser achatada.
3. Usando duas pinças afiadas # 5, desdobre a retina e posicione-a plana com o copo interno do olho voltado para cima. Dependendo do tamanho do tecido, faça cortes em relevo de 0,5-2 mm em cada segmento de trevo para achatar ainda mais a retina, ajustando cuidadosamente o tecido para evitar dobras (Figura 5A). Remova a solução de Ames adicional até que o líquido permaneça apenas adjacente à retina.
4. Usando uma lamínula, pressione e transfira rapidamente a retina (Figura 5B) com o líquido circundante de modo que a esclera externa fique voltada para cima e a ocular interna entre em contato com a lamínula, ou seja, as células ganglionares da retina ficarão voltadas para cima (Figura 5C).
5. Verifique se a retina não está dobrada e faça os ajustes necessários; adicione a solução de Ames para facilitar a manipulação. Como o excesso de líquido fará com que o tecido se enrole, use um lenço de laboratório para remover todo o excesso de solução de Ames e deixe a retina secar ao ar por 5 a 10 segundos.
   NOTA: A falha em permitir uma breve secagem ao ar pode resultar aleatoriamente na separação tecido-OCT durante a criossecção. A secagem excessiva ao ar pode levar a danos nos tecidos relacionados ao cristal de sal.
6. Aplique o meio OCT para cobrir a retina e use uma pinça para espalhar essa camada uniformemente pela lamínula, evitando a flutuação da retina. Aguarde 30 s para que o meio OCT penetre na retina.
7. Congelar rapidamente a retina na OCT (Figura 5D) usando uma placa de metal resfriada indiretamente com vapor de nitrogênio líquido ou colocando-a em contato direto com gelo seco.
8. Armazene as retinas em gelo seco se for usar imediatamente ou em um freezer a -80 ° C em um saco plástico ou recipiente contendo dessecantes se armazená-lo a longo prazo.

3. Crioseccionamento

1. Defina a câmara do criostato para -18 °C e stage para -12 °C. Coloque a retina na câmara para equilibrar a temperatura.
2. Crie uma cúpula OCT no mandril de amostra. Se estiver usando o mesmo modelo de criostato, certifique-se de que esta cúpula ocupe os 2-3 anéis internos. Depois de congelada, apare a cúpula OCT para criar uma superfície plana paralela à lâmina no mandril para manter o nivelamento laminar (Figura 6A).
3. Crie ou anote o guia de orientação relacionando o mandril ao criostato stage.
   NOTA: No modelo de criostato que recomendamos, o guia de orientação é uma linha central gravada na posição de 12 horas acima do suporte do mandril, enquanto o próprio mandril tem um recorte triangular nos anéis mais externos. Juntos, nos referimos a esses recursos como o guia de orientação. Se o seu criostato não tiver esses recursos, recomendamos o uso de um marcador permanente para fazer o seu próprio.
4. Prepare a retina para transferência usando uma lâmina de barbear, removendo o excesso de OCT ao redor da retina lateralmente e, em seguida, separando cuidadosamente a retina da lamínula para torná-la móvel.
5. Remova o mandril do stage e aplique uma pequena gota de OCT líquido na superfície plana preparada do LCT.
6. Coloque a retina diretamente sobre a OCT líquida. Usando uma lâmina de vidro pré-resfriada (-18 °C), pressione e segure a retina contra o estágio OCT por 10-30 s até congelar.
7. Aplique OCT adicional sobre a retina e o estágio para garantir a ligação completa. Congele na área de congelamento rápido do criostato. Incube o estágio retina/OCT no criostato por no mínimo 30 min para garantir a ligação completa.
8. Comece a seccionar:
   1. Apare cuidadosamente o excesso de OCT até que a retina se torne visível (Figura 6B). Use a lâmina de barbear para remover o excesso de OCT das bordas do bloco.
      NOTA: Sempre retraia o stage antes de retomar o corte após qualquer corte manual radial. Para aparar fatias na face, recomendamos usar a mesma espessura de corte que será usada para as seções desejadas; no entanto, a espessura de corte pode estar entre 10 μm e 100 μm com base na preferência do usuário.
   2. Continue aparando enquanto inspeciona as seções quanto à presença de esclera. Quando a esclera estiver visível, ajuste o ângulo do palco conforme necessário. Continue aparando até que as seções mostrem uma distribuição igual da esclera, o que garante um nivelamento ideal e uma área máxima de trevo em cada seção.
   3. Colete seções de tecido (Figura 6C).
      NOTA: A espessura ideal dependerá do ensaio final que está sendo realizado e deve aderir a este protocolo a jusante. Por exemplo, se for empregado 10X Xenium, recomendamos seções de 20 μm de espessura. Já para o 10X Visium, seções de 15 μm de espessura são mais apropriadas.
   4. Use lâminas pré-resfriadas e manipule as seções na posição usando dois pincéis.
   5. Coloque um dedo sob a seção até que a OCT derreta e o tecido adira (aproximadamente 5 s).
   6. Retorne a lâmina para uma superfície fria para recongelamento do tecido.
      NOTA: Ao coletar seções em pequenas áreas (por exemplo, para Xenium), vários ciclos de congelamento e descongelamento podem ser necessários. Embora isso não afete as técnicas baseadas em sonda, pode afetar a qualidade do RNA para abordagens de sequenciamento imparciais.
9. Armazenar as lâminas em gelo seco para uso imediato, a -20 °C para RNAscope no dia seguinte e a -80 °C para armazenamento de longo prazo.

4. Detecção de alvos e microscopia

NOTA: Embora a técnica seja compatível com outros métodos de perfil molecular, detalhamos o RNAscope como um exemplo validado.

1. Preparação da amostra:
   1. Remova as lâminas do armazenamento a -80 °C e aqueça a -20 °C por 1 h.
      NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -20 °C por até 12 h antes de iniciar o restante deste procedimento, mas não devem ser deixadas a -20 °C por muito tempo para minimizar a degradação do RNA.
2. Aqueça rapidamente as lâminas a 37 °C durante 10 s.
3. Fixe o tecido imergindo as lâminas em PFA fresco a 4% por 30 min em temperatura ambiente.
4. Lave bem as lâminas com 1x PBS.
5. Desidratação tecidual através de séries de etanol: etanol 50% por 5 min, etanol 70% por 5 min, etanol 100% por 5 min, etanol 100% fresco por 5 min.
   NOTA: Esta é uma etapa crítica de controle de qualidade para montagem de tecido. Se ocorrer descolamento de tecido durante a desidratação, isso indica sobreposição de OCT de seções adjacentes durante a montagem. O corte cuidadoso do excesso de OCT durante o corte e montagem evita esse problema.
6. Preparação da barreira:
   1. Seque as lâminas ao ar na bancada por 5 min em temperatura ambiente.
   2. Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe uma barreira ao redor de cada seção de tecido. Deixe a barreira secar completamente por 5 min em temperatura ambiente.
7. Detecção molecular:
   1. Aplique o tratamento com Protease IV para permeabilização tecidual.
   2. Prossiga com o protocolo do fabricante para hibridização da sonda alvo (2 h a 40 °C), etapas de amplificação de sinal (três amplificadores sequenciais), detecção de fluoróforo (quatro rodadas sequenciais para coloração de três plex).
8. Imagiologia:
   1. Execute a contracoloração nuclear DAPI antes de cada montagem da lamínula.
   2. Monte a lamínula usando um meio de montagem antidesbotamento.
   3. Imagem usando microscopia de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados.
   4. Para detecção multiplex, capture o mesmo campo em todas as quatro rodadas de detecção para registro computacional.
   5. Mantenha configurações de exposição consistentes entre as rodadas para uma comparação precisa do sinal.
      NOTA: Para obter detalhes completos sobre a implementação do RNAscope, consulte os protocolos do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para plataformas totalmente automatizadas como o Xenium, siga todas as etapas de protocolo do fabricante exatamente como fornecidas. Para todos os protocolos, antecipe que a falha devido ao descolamento do tecido provavelmente ocorrerá durante uma etapa inicial de desidratação ou lavagem, devido à sobreposição de OCT, conforme observado neste protocolo exemplar.

Resultados

A implementação bem-sucedida deste protocolo produz seções retinianas intactas na face adequadas para múltiplas abordagens de perfil molecular, mantendo as relações espaciais em toda a superfície da retina. Demonstramos a utilidade do protocolo por meio de uma abordagem de validação sistemática, progredindo da imuno-histoquímica convencional por meio da detecção manual de RNA multiplex para o perfil molecular automatizado de alto rendimento.

A validação inicial de nosso protocolo empr...

Discussão

O método apresentado aqui aborda uma barreira técnica crítica na biologia espacial da retina, permitindo a produção de seções finas na face adequadas para tecnologias modernas de perfil molecular. As etapas mais críticas do protocolo giram em torno do manuseio do tecido durante a dissecção inicial e o controle preciso da temperatura e hidratação durante a criopreservação e seccionamento. A implementação bem-sucedida depende particularmente da obtenção do achatamento adequado do ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ames′ Médio	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	Marca específica não importante
Beadsmith Thread Zap, Queimador de Rosca	The Beadsmith Store	7.90524E+11	Cauterizadores alternativos podem ser usados
Cryostat	Leica	cm1950	Considerações importantes é o volume controlável separadamente vs temperatura do palco.
Gelo Seco	NA	NA	NA NA Fine
Science Tools Dumont #5 Fórceps	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	Marca específica não importante
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Marca específica não importante
Pinça/Fórceps de Ponta Fina Reta de Alta Precisão Fisherbrand	Fisher Scientific	12-000-127	Marca específica não importante
Tesoura de Dissecação Padrão Fisherbrand	Fisher Scientific	08-951-20	Marca específica não importante
Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand	Fisher Scientific	22-037-246	Marca específica não importante
Integra Miltex Noyes Tesoura de Íris	Integra Miltex 181510	12-460-278	Marca específica não importante
Microscópio de epifluorescência de disco giratório Olympus IX81	Para Figure 7
	Scientific	12-567-400	Marca específica não importante
Microscópio trinocular de zoom estéreo de precisão World Instrument (IV) no suporte de lança	Instrumento de precisão mundial PZMTIVBS	50-253-8607	Marca específica não importante
Zeiss Axio Imager.Microscópio de epifluorescência M2			Seccionamento óptico habilitado (para a Figura 8)