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Artigo de método

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

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DOI:

10.3791/68176

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6 de junho de 2025

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1Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, 2Centro de Esterilidad Montevideo, 3Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos o protocolo Spatula Montevideo para vitrificação de embriões pré-implantacionais de camundongos e ovelhas, consistindo em uma espátula caseira e utilizando soluções caseiras. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras de concentração crescente, carregadas na espátula, imersas em nitrogênio líquido e, finalmente, seladas com um canudo de 0,5 mL.

Resumo

Este estudo descreve um método de vitrificação eficiente e econômico para criopreservação de embriões de camundongos e ovelhas conhecido como Espátula Montevidéu (MVD). Este protocolo utiliza uma espátula caseira como dispositivo de transporte, que é preparada com uma ponta de carregador de gel. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras caseiras de concentração crescente, carregadas na espátula e, em seguida, imersas diretamente em nitrogênio líquido. Aproximadamente 30-40 embriões de camundongos em estágio de pré-implantação podem ser carregados na espátula, que é posteriormente selada com um canudo de 0,5 mL. O uso de espátulas em vez de criotubos, que são freqüentemente usados para armazenar embriões vitrificados, otimiza o espaço nos dewars de nitrogênio líquido. Além disso, o processo de aquecimento requer apenas uma solução caseira de sacarose de concentração decrescente para reidratar os embriões e restaurar sua morfologia. Nosso laboratório tem usado com sucesso a Espátula Montevidéu para embriões pré-implantação de camundongos e ovelhas por mais de 10 anos. A Espátula Montevidéu demonstrou uma taxa média de recuperação (embriões recuperados/vitrificados) de 84% e uma taxa de sobrevivência (embriões viáveis/recuperados) de 97% em embriões de camundongos. A vitrificação de embriões murinos produziu melhores resultados do que o congelamento lento, embora não tenham sido observadas diferenças nos resultados reprodutivos (taxas de gravidez, parto e natalidade). Em embriões de ovelhas, taxas semelhantes de sobrevivência e desenvolvimento embrionário foram alcançadas com a Espátula Montevidéu em comparação com um dispositivo comercial. Embora a taxa de prenhez tenha sido maior para o dispositivo comercial, a taxa de sobrevivência dos cordeiros não foi significativamente diferente entre os dispositivos. O método de vitrificação Spatula Montevideo é uma técnica de criopreservação simples que pode ser usada para armazenar embriões excedentes, fazer backup de linhagens de camundongos geneticamente modificados e modelos de ovelhas e facilitar seu intercâmbio entre pesquisadores em todo o mundo.

Introdução

A eficiência da geração de animais geneticamente modificados (GM) aumentou significativamente devido ao desenvolvimento de métodos baseados em endonuclease, particularmente CRISPR/Cas9. Muitos laboratórios em todo o mundo produzem várias linhagens de camundongos e ratos GM que devem ser criopreservadas para evitar deriva genética e manter a integridade dofenótipo 1 original. Além disso, o arquivamento elimina a necessidade de reprodução constante, o que geralmente resulta em número excessivo de animais. Alguns laboratórios enviam linhagens de camundongos GM como embriões ou espermatozoides criopreservados para repositórios internacionais, facilitando a troca desses modelos e evitando o transporte de animais vivos. Isso garante acessibilidade às linhas sem a geração repetitiva de modelos animais GM idênticos2. Por essas razões, a criopreservação de embriões e espermatozoides é fundamental em qualquer instalação animal GM. Geralmente, a criopreservação de embriões é preferida para armazenar linhagens GM porque os embriões contêm o genoma diplóide completo com modificações e podem ser facilmente recuperados por meio da transferência de embriões.

A vitrificação é um processo de não equilíbrio caracterizado por um desequilíbrio entre a água que entra na célula e a água que forma cristais extracelulares ao seu redor. Este método evita a formação de cristais de gelo intracelulares, distinguindo-o do método de congelamento lento (SLF)3 (ver Figura 1). A alta concentração de crioprotetores e o contato direto com nitrogênio líquido (LN2) permitem um resfriamento ultrarrápido (~40 °C/s), alcançando um estado vítreo das amostras em segundos. Além disso, a vitrificação é mais rápida, fácil e menos dispendiosa do que o congelamento lento4. Requer LN2 mínimo e normalmente emprega equipamentos simples que podem ser comprados comercialmente ou caseiros5 (ver Figura 1).

Além disso, o processo de aquecimento é geralmente rápido e replicável. Deve ser realizada rapidamente para evitar toxicidade crioprotetora e manter o estado vítreo3. Ao congelar embriões, muitos laboratórios consideram a conveniência do dispositivo transportador, sua confiabilidade, robustez, capacidade de retenção e custos.

Preferimos o método de vitrificação de espátula de volume mínimo para criopreservação de rotina de embriões de ovelhas e camundongos, usando o dispositivo Spatula Montevideo (MVD)6. Inicialmente, empregamos o método de congelamento lento7 , mas rapidamente fizemos a transição para a vitrificação. Para criar um dispositivo mais simples e eficiente em termos de espaço para o dewar LN2 , modificamos a espátula caseira de Tsang e Chow (2009)8, que é conectada a um criotubo, para desenvolver a espátula MVD que é selada com um canudo de 0,5 mL (ver Tabela de Materiais). A espátula possui uma ponta de carregador de gel (ver Tabela de Materiais), onde uma plataforma de aproximadamente 1 mm² é formada pela fusão suave da ponta com pinças finas, criando uma placa semelhante a uma pétala para carregar os embriões. Esta plataforma pode acomodar até 40 embriões de camundongos em uma pequena gota de vitrificação. Uma haste de identificação (consulte a Tabela de Materiais) é inserida na extremidade aberta da ponta do carregador de gel.

O objetivo deste método é vitrificar embriões de forma simples, rápida e barata que, além disso, economize espaço no dewar de nitrogênio. Este sistema tem sido usado com sucesso por muitos anos, proporcionando excelentes taxas de sobrevivência de embriões (~ 97%) e resultados reprodutivos, particularmente em embriões de camundongos. Como a Espátula MVD é preparada em laboratório, é um método de baixo custo em comparação com os dispositivos comerciais9. Além disso, economiza espaço no dewar de nitrogênio em comparação com o uso de criotubos 8,10.

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Figura 1: Comparação das duas principais técnicas utilizadas para criopreservação de embriões. Essa figura foi modificada com permissão de Crispo et al.1. Criado em BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Os animais utilizados para a obtenção de embriões de camundongos foram alojados e manuseados de acordo com a legislação nacional 18.611 e as diretrizes internacionais de cuidados com os animais11. O protocolo experimental (licença número #007-18) foi oportunamente aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Institut Pasteur de Montevideo (consentimento por escrito). Os protocolos experimentais para ovócitos/embriões de ovinos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com os Animais Fundación IRAUy (protocolo #001-2017), atendendo às diretrizes ARRIVE12 e foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais de cuidados com animais11.

1. Vitrificação (Figura 2)

  1. Preparação de espátula MVD
    1. Encurte a ponta do carregador de gel (consulte a Tabela de Materiais) cortando os primeiros 10 mm e o cone da ponta.
      NOTA: Isso cria uma ponta mais curta e reta, facilitando a vedação final com o canudo de 0,5 mL (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Segure a extremidade da ponta do carregador de gel com a pinça #5 do relojoeiro (consulte a Tabela de Materiais) a aproximadamente 1.0 cm da ponta. Coloque suavemente a ponta na chama de um bico de Bunsen (consulte a Tabela de Materiais) e segure por 8 a 10 s para formar uma plataforma semelhante a uma pétala de aproximadamente 1 mm2.
    3. Retire da chama e segure firmemente com a pinça por 5 s.
    4. Usando um estereomicroscópio (consulte a Tabela de Materiais), verifique se a plataforma em forma de pétala (~ 1 mm2) está formada e a borda distal está selada.
      NOTA: A plataforma deve ser fechada na extremidade distal para evitar a infiltração de LN2 durante a vitrificação. Certifique-se de que a plataforma esteja limpa e livre de roscas plásticas. Se for muito pequeno ou tiver roscas, apare a ponta e repita o procedimento.
    5. Repita as etapas 1.1.1-1.1.4 para preparar o número necessário de espátulas (1 espátula = até 40 embriões de camundongo).
    6. Esterilize as espátulas usando raios ultravioleta (UV) ou óxido de etileno e guarde-as em um tubo ou caixa estéril.
    7. No dia da vitrificação, recupere as espátulas, manuseando-as na extremidade oposta da plataforma. Insira uma haste de identificação (consulte a Tabela de Materiais) em cada espátula e coloque-as na base do estereomicroscópio. Rotule a haste com um marcador permanente ou etiqueta adesiva resistente ao nitrogênio líquido.
      NOTA: Evite sempre tocar na plataforma ao manusear as espátulas. O comprimento total do dispositivo completo (espátula + canudo de 0,5 mL + haste de identificação) não deve exceder mais de 1 cm do comprimento da taça.
  2. Preparação de soluções de vitrificação
    1. Prepare a solução FS: Dissolva 1,5 g de meio de gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) e 0,85 g de sacarose (ver Tabela de Materiais) em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais). Aqueça em banho-maria fervente até dissolver completamente e, em seguida, esterilize com um filtro de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Esta solução pode ser conservada a 4 °C até 6 meses.
    2. Prepare a solução de pré-vitrificação (PV): No dia da vitrificação, misture 10% de etilenoglicol (ver Tabela de Materiais), 10% de dimetilsulfóxido (ver Tabela de Materiais) e 80% de meio M2 (ver Tabela de Materiais). É necessário um volume total de 100 μL para 5 espátulas.
    3. Prepare a solução de vitrificação (V): No dia da vitrificação, combine 15% de etilenoglicol, 15% de dimetilsulfóxido, 10% de meio M2 e 60% de solução FS. Um volume total de 100 μL é necessário para 5 espátulas.
  3. Processo de desidratação e vitrificação de embriões
    1. Prepare o LN2: Despeje o LN2 em um recipiente adequado (por exemplo, um recipiente de poliestireno isolado de 10 cm x 30 cm x 20 cm) e coloque tantos canudos de 0,5 mL quanto espátulas a serem usadas.
      NOTA: Para facilitar a visualização da plataforma da espátula durante a manipulação sob LN2, sugere-se que um recipiente de poliestireno isolado com fundo colorido seja usado para criar um efeito de contraste.
      CUIDADO: Use óculos e luvas apropriados (consulte a Tabela de Materiais) ao manusear o LN2.
    2. Prepare as soluções: Em uma placa de Petri de plástico de 100 mm (consulte a Tabela de Materiais), coloque as seguintes gotas: 100 μL de M2, 20 μL de solução PV e 20 μL de solução V para cada espátula.
    3. Vitrificar embriões: Coloque os embriões a serem vitrificados na gota M2. Manuseie 30-40 embriões de cada vez, incubando-os na gota de solução PV por 30 s e, em seguida, na gota de solução V por mais 30 s em temperatura ambiente (RT).
    4. Use um capilar de vidro puxado (consulte a Tabela de Materiais) com um conjunto de tubo aspirador (consulte a Tabela de Materiais). Pré-carregue o capilar com pelo menos 1 μL da respectiva solução antes de colocar os embriões.
      NOTA: Os embriões estarão em alturas diferentes nas gotas, portanto, ajuste o micrômetro do estereomicroscópio para localizá-los. Recupere embriões de cada gota quando restarem 10 s. Todas as manipulações de embriões devem ser realizadas sob o estereomicroscópio.
    5. Carregar embriões: Aspire os embriões usando uma solução V mínima (por exemplo, ~ 0,1 μL) e coloque-os rapidamente na plataforma da espátula.
    6. Imersão em LN2: Após carregar os embriões, mergulhe imediatamente a plataforma da espátula em LN2 por 5 s (segurando a espátula com a mão, pela haste). Em seguida, mantendo a espátula em vapores de LN2 , sele-a com um canudo de 0,5 mL usando uma pinça longa de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Remova o LN2 do canudo antes de selar para evitar a expansão durante o aquecimento. Certifique-se de que a espátula e o canudo estejam alinhados corretamente para evitar o contato entre a gota do embrião e a parede do canudo. Por conveniência, as espátulas seladas podem permanecer no recipiente LN2 até que todas as espátulas estejam carregadas com embriões, reabastecendo com LN2 conforme necessário.
    7. Repita o procedimento: Repita as etapas 1.3.3 a 1.3.7 para cada grupo de embriões, usando um novo par de gotas de PV e V.
    8. Armazenamento: Transfira as espátulas para taças (consulte Tabela de materiais) e, em seguida, para um dewar de armazenamento LN2 (consulte Tabela de materiais).

figure-protocol-1
Figura 2: Esquema do processo de vitrificação usando Espátula MVD. Veja o texto para mais detalhes. Criado em BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Aquecimento (Figura 3)

  1. Preparação da solução
    1. Prepare uma solução de sacarose 1 M dissolvendo 0,85 g de sacarose em 2,5 mL de meio M2. Esterilizar a solução com um filtro de 0,22 μm.
      NOTA: Esta solução pode ser preparada e conservada a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
    2. Preparar soluções de sacarose 0,5 M e 0,25 M diluindo a solução de sacarose 1 M com o volume adequado de meio M2.
    3. Manter as soluções de sacarose a 37 °C numa placa quente (ver Tabelas de Materiais) até ao início do aquecimento.
  2. Preparação da placa de aquecimento
    1. Em uma placa de Petri de plástico de 100 mm, coloque as seguintes gotas de solução: uma gota de 500 μL de sacarose 0,5 M, uma gota de 50 μL de sacarose 0,5 M e uma gota de 50 μL de sacarose 0,25 M para cada espátula a ser aquecida. Coloque três gotas de meio M2 (100 μL cada) para lavar.
  3. Processo de aquecimento
    NOTA: O processo de aquecimento ocorre em RT, por exemplo, 20-22 °C na base de um estereomicroscópio.
    1. Recupere as espátulas seladas do dewar. Coloque-os em um recipiente apropriado com LN2. Veja a Figura 3.
    2. Coloque a placa de aquecimento no estereomicroscópio. Um de cada vez, segure a base da espátula com uma pinça de aço inoxidável e, com a mão enluvada, puxe a haste de identificação e depois o canudo. Mergulhe rapidamente a plataforma contendo os embriões na gota de sacarose 0,5 M de 500 μL.
    3. Certifique-se de que todos os embriões caíram na gota; Se necessário, mova suavemente a espátula para ajudar na sua libertação. Carregue os embriões em um capilar de vidro puxado, coloque-os na gota de 50 μL de solução de sacarose 0,5 M e incube por 2 min.
    4. Coloque os embriões na gota de 50 μL de solução de sacarose 0,25 M e incube por mais 2 min.
      NOTA: Antes de colocar os embriões em cada solução, pré-carregue o capilar com a solução a ser usada.
    5. Por fim, lave os embriões três vezes em diferentes gotas de meio M2 para remover a sacarose.
    6. Incubar os embriões em condições adequadas para cada espécie durante pelo menos 1 h antes da utilização.

figure-protocol-2
Figura 3: Esquema do processo de aquecimento da Espátula MVD. Veja o texto para mais detalhes. Criado em BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Inicialmente, usamos o método tradicional de congelamento lento baseado em soluções de propilenoglicol, canudos e equipamentos de congelamento de taxa controlada7. No entanto, depois de considerar o método de vitrificação uma opção potencialmente mais fácil e econômica, realizamos um estudo para comparar os resultados do congelamento lento tradicional (SLF) vs. Espátula MVD em embriões de camundongo derivados in vivo de 8 células e 2 células produzido...

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Discussão

A Espátula MVD é um dispositivo de vitrificação fácil de montar, de baixo custo e volume mínimo, com alta capacidade de retenção de embriões e ocupação ideal de dewar de nitrogênio líquido. Este método provou ser simples, rápido e robusto. Em média, alcançamos não apenas altas taxas de recuperação e sobrevivência de embriões vitrificados (~ 90%), mas também bons resultados reprodutivos ao realizar a transferência de embriões em camundongos (~ 80% de taxa de gravidez e ~ 30% de taxa de na...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Alejo Menchaca por sua contribuição para o desenvolvimento da Espátula MVD. GS recebeu financiamento do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (Processo: GS 2437 347). GS, MNM e MC receberam financiamento do FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosul (https://focem.mercosur.int/es/) (Grant Number: COF 03/11). GS e MC são bolsistas do Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguai. (https://www.anii.org.uy/). Os financiadores (Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - Facultad de Ciencias -Universidad de la República; FOCEM - Fundo para a Convergência Estrutural do Mercosul; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguai) não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ Filtro M Sartorius16534Filtro de seringa Minisart 0.2 µ L
0,5 mL de palhaMinitubo13408/0044Paillette médio tipo francês
Conjunto de tubo de aspiração SigmaRolamento A5177
Bico de Bunsen Indulab7000134
Dimetilsulfóxido SigmaD2650
Etilenoglicol Sigma102466
Ficoll PM70 SigmaF2878Gradiente de densidade médio
Ponta do Gel-carregadorEppendorf 10411193
Capilar de vidro Marienfeld2900000Tubo capilar de microhematócrito
Luvas para manuseio de LN2 Escudo TempCE0338Crioglove
TaçasMinitubo16913/1133
Óculos para manuseio de LN2   3M  40661-00000-10Revestimento antiembaçante e anti-riscos
Placa quenteLabecLA-SH-II-5BModelo digital
Vareta de identificação Tecnologias IMV6326LG48 mm não estéril
Recipiente de isopor isolado
Dewar do armazenamento de LN2Taylor-WhartonXT21-AICriociência
Pinças longas de aço inoxidávelFerramentas de Belas Ciências11000-25
M2 SigmaM7167
PBS Feito em casaSolução salina tamponada com fosfato. Normalmente, 1 L de tampão concentrado 5x é preparado e depois diluído para 1x. Receita: 40 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de potássio, 7,2 g de fosfato dissódico anidro, 1,2 g de fosfato monopotássico. Adicione água destilada e esterilize em autoclave.
Placa de Petri de plástico Falcão    351029Placa de Petri bacteriológica não tratada com TC
EstereomicroscópioOlimpoSZ2-LGB
SacaroseSigmaS1888
Relojoeiro' s #5 fórceps Ferramentas de Belas Ciências11254-20

Referências

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