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Artigo de método

Frequência e distribuição de cruzamentos na meiose de Caenorhabditis elegans por genotipagem de SNP usando PCR em tempo real

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DOI:

10.3791/68183

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11 de julho de 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método para medir as frequências de cruzamento e distribuição durante a meiose em Caenorhabditis elegans. A genotipagem do polimorfismo de nucleotídeo único com PCR em tempo real foi usada para determinar a origem dos cromossomos. O mapeamento de 4 pontos permitiu determinar as distribuições cruzadas das regiões do braço esquerdo, centro e braço direito de cada cromossomo.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para o estudo da meiose. Além das vantagens gerais, como um ciclo reprodutivo curto, muitas progênies e um corpo transparente para imagens, existem seis pares de cromossomos holocêntricos homólogos. Há forte interferência cruzada e regulação da distribuição cruzada. Para medir a frequência de cruzamento, foram desenvolvidos o mapeamento de marcadores visíveis, o mapeamento de snip-SNP e a quantificação de marcadores citológicos como precursores da formação de cruzamento. Aqui, apresentamos um método de genotipagem de SNP modificado para medir a frequência e distribuição de cruzamento na oogênese de C. elegans . Este método pode omitir as etapas trabalhosas de digestão de restrição e eletroforese em gel e evitar o julgamento ambíguo de bandas de DNA não cortadas. A genotipagem do polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) é realizada usando a cepa híbrida Bristol/Hawaiian. O cruzamento de hermafroditas com machos que expressam myo-3p::GFP nos permite focar na oogênese. Um único lisado de verme produz molde de DNA suficiente para todos os seis cromossomos. A química TaqMan baseada em exonuclease 5' e as sondas de ligante de sulco menor (MGB) específicas de SNP permitem a detecção precisa de SNP a uma taxa de genotipagem de aproximadamente 97,7%. Utilizamos a detecção precisa de SNPs para medir a frequência de cruzamento em C. elegans. Este método também pode ser aplicado para determinar a frequência de cruzamento em mutantes machos ou com defeito de cruzamento, bem como para intervalos cromossômicos mais específicos.

Introdução

A formação de cruzamento entre cromossomos homólogos é essencial para a segregação adequada dos cromossomos e também para a geração de diversidade genética1. Erros na formação cruzada causam aneuploidia, que pode levar à infertilidade, aborto espontâneo e defeitos congênitos2. A frequência de cruzamento varia de acordo com a região cromossômica, tipo de mutante, idade e sexo, ressaltando a necessidade de medir com precisão a frequência de cruzamento em cada uma dessas condições 3,4,5. O objetivo geral deste método é medir com precisão a frequência de cruzamento de cada domínio cromossômico e, assim, determinar com precisão a distribuição de cruzamentos em todo o comprimento do cromossomo C. elegans.

Tradicionalmente, o mapeamento de dois pontos usando marcadores morfológicos tem sido usado para medir a frequência de cruzamento 6,7,8,9,10. Em C. elegans, fenótipos atarracados, curtos, de corpo gordo (Dpy) e de movimento descoordenado (Unc) são frequentemente usados para criar mapas cromossômicos6. As vantagens deste método são seu baixo custo e capacidade de analisar muitas progênies. As desvantagens desses métodos incluem a limitação da escolha dos loci de interesse e a impossibilidade de usar progênies letais porque seus fenótipos não são visíveis. A fim de superar o inconveniente da escolha do local, os transposons Tc1 têm sido usados como marcadores para locais marcados com sequência polimórfica (STS)11,12. Tc1s podem ser detectados usando PCR e eletroforese. Enquanto a cepa padrão Bristol N2 tinha 30 cópias do transposon Tc1, os isolados de C. elegans de Bergerac na França (RW7000 e DP13) tinham 500 cópias de Tc1. Assim, o número e a distribuição de transposons Tc1 variam entre os isolados, e isso é usado para analisar os cromossomos da progênie de vermes híbridos entre isolados por PCR. Posteriormente, os SNPs também foram usados para medir a frequência e distribuição do cruzamento13,14. O SNP entre as cepas Bristol N2 e CB4856 havaiana apareceu a cada 1.000 pb15,16. Os SNPs são detectados como polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) usando PCR, digestão de restrição e eletroforese. Recentemente, pequenos locais de inserção/deleção (InDel), bem como SNPs entre Bristol N2 e Hawaiian CB4856 foram propostos como marcadores mais eficientes17. No entanto, medir a frequência de cruzamento usando Tc1, RFLP e InDel requer processos trabalhosos, como PCR, tratamento com enzimas de restrição e eletroforese. Se cada processo não for otimizado em uma análise em larga escala, os resultados podem ser mal interpretados devido a fatores como a precisão da PCR, o tipo de enzima de restrição usada, a eficiência da clivagem do DNA e a clareza e separação de bandas durante a eletroforese. Em contraste, o método proposto utiliza a genotipagem de SNP por PCR em tempo real para facilitar a quantificação exata e precisa.

Os cruzamentos não são distribuídos aleatoriamente ao longo dos cromossomos. Em C. elegans, cruzamentos simples tendem a se formar com mais frequência nos braços e são suprimidos no centro 3,5. O mapeamento morfológico de dois pontos não pode identificar onde ocorrem cruzamentos fora dos genes marcadores. Por outro lado, o mapeamento de SNP permite um aumento nos marcadores e demonstrou facilitar a determinação da região exata de um cruzamento ao longo de todo o cromossomo 5,14,18. Neste estudo, empregamos os limites do domínio cromossômico propostos por Rockman e Kruyglyak5 e selecionamos quatro SNPs para análise: em ambas as extremidades do cromossomo e em ambas as extremidades dos limites centro/braço.

Aproveitando os métodos anteriores, propusemos um método de detecção de SNP preciso e rápido por PCR em tempo real usando TaqMan, nuclease 5'19 para medir o cruzamento entre o braço esquerdo, centro e braço direito de cada cromossomo. As vantagens do nosso método em relação às tecnologias alternativas, em comparação com estudos anteriores 20,21,22, são a precisão e a simplicidade. Este método é um método de análise cruzada aplicado por qPCR para C. elegans e é amplamente adequado para pesquisadores que estudam meiose.

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Protocolo

1. Primeiro cruzamento genético

  1. Prepare placas de acoplamento que incluam placas normais de meio de crescimento de nematóides (NGM) com uma pequena mancha OP50 (~ 5 mm de diâmetro) na placa de 35 mm.
  2. Adicione três hermafroditas L4 da cepa Bristol N2 (ou mutantes com fundo Bristol) e nove machos adultos jovens da cepa havaiana CB4856 em uma placa de acasalamento (Figura 1A).
    NOTA: Para analisar mutantes com alta letalidade embrionária, é necessário usar mutantes balanceados com origens de Bristol e havaianas neste cruzamento. Para obter mutantes com origem havaiana, os mutantes de Bristol devem ser cruzados com a cepa havaiana pelo menos seis vezes até que todos os locais de interesse do SNP tenham origem havaiana. Como resultado, o mutante havaiano contém fundo de Bristol apenas na região mutada e no cromossomo balanceador.
  3. Incubar a placa durante 1,5 dias a 20 °C para acasalar as duas estirpes. Transfira cada hermafrodita para uma nova placa NGM individual com OP50.
  4. Coloque as placas em uma incubadora a 20 °C por 1 dia para permitir que ponham ovos fertilizados. Transfira cada hermafrodita para uma nova placa NGM individual com OP50.
  5. Coloque as placas em uma incubadora a 20 °C por 1 dia para permitir que os ovos fertilizados sejam postos novamente. Remova os hermafroditas. Mantenha as placas por 0,5 - 1 dia em uma incubadora a 20 °C para aumentar as progênies para L4.

2. Segunda cruz

  1. Escolha seis hermafroditas L4 cruzados (híbridos Bristol / Havaianos) e 12-15 ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p :: GFP :: LacZ :: NLS + (pSAK4) myo-3p :: GFP mitocondrial + dpy-20 (+)] I (TTS24) Bristol machos em uma nova placa de acasalamento (Figura 1B).
    NOTA: A cepa inserida ccIs4251 é obtida do Caenorhabditis Genetics Center e deve ser cruzada com a cepa N2 do tipo selvagem mais de seis vezes.
  2. Mantenha a placa por 1,5 dias a 20 ° C em uma incubadora para acasalar. Transfira cada hermafrodita para uma nova placa NGM com OP50.
  3. Coloque as placas em uma incubadora a 20 °C por 1 dia para permitir que ponham ovos fertilizados. Transfira cada hermafrodita para uma nova placa NGM individual com OP50.
  4. Mantenha as placas por 1 dia em uma incubadora a 20 °C para deixá-las botar ovos fertilizados novamente. Transfira cada hermafrodita parental para um tubo de PCR com 3 μL de tampão de lise para verificar se o primeiro cruzamento foi bem-sucedido.
  5. Verifique os genótipos dos genótipos dos pais como um híbrido Bristol / Hawaiian por PCR em uma região do cromossomo V. Separe as bandas por eletroforese em gel de agarose a 2,5%.
    1. No SNP, WBVar01973670, o comprimento do amplicon de PCR do genoma de Bristol é de 220 pb e do genoma havaiano é de 196 pb. Se os resultados da PCR indicarem que os pais são homozigotos de Bristol, isso se deve à autofecundação do primeiro cruzamento. Não use a progênie desses vermes para análises posteriores.

3. Amostragem

  1. Prepare o tampão de lise de vermes da seguinte forma: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8,2, 2,5 mM MgCl2, 0,45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45% Tween 20 e 0,01% gelatina. Esterilize por filtração e armazene em temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, adicionar 3 μL de 20 mg/ml de proteinase K (em H2O) a 1 ml de tampão de lise e conservar em alíquotas a -20 °C.
  2. Verificar a expressão da GFP no músculo da parede corporal das progênies do segundo cruzamento por microscópio de dissecação fluorescente antes de adicionar os vermes aos tubos de PCR individuais. A ampliação é de 6,1-55x e o comprimento de onda usado é de 440-460 nm.
  3. Escolha um único verme positivo para GFP e adicione a cada tubo de PCR contendo 3 μL de tampão de lise de vermes ( Figura 1C ). Coletar um total de 360 (90 x 4 réplicas biológicas) progênies cruzadas de machos adultos em cada um dos 360 tubos de PCR.
    NOTA: Para evitar a colheita de descendentes autofecundados, vermes positivos para GFP devem ser selecionados para a amostragem. Hermafroditas não acasalados menores que L4 também estão disponíveis para análise de autossomos, mas como eles têm números diferentes de cromossomos X, machos e hermafroditas devem ser identificados após crescerem para L4 e amostrados ao analisar o cromossomo X.
  4. Coloque as amostras em um freezer a -80 °C por 5 min. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até que a lise possa começar.
  5. Ao analisar mutantes com alta letalidade embrionária, colete os embriões mortos em vez de larvas vivas para obter resultados imparciais. Para coletar embriões, use uma ponta de pipeta com 0,5 μL de solução de quitinase (20 mg/mL de quitinase, 50 mM de NaCl, 70 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2). Colete embriões dentro de 4 h após a postura.
    NOTA: Embriões mortos colocados há mais de 4 horas não são adequados para análise de PCR, provavelmente devido à degradação do DNA genômico.

4. Lise da amostra

  1. Defina os tubos de PCR no termociclador a 60 °C por 1 h, seguido de 95 °C por 15 min. Adicione 100 μL de água livre de nuclease a cada tubo e misture bem.
  2. Armazene amostras a -20 °C até iniciar a genotipagem de SNP por PCR em tempo real.

5. Genotipagem de SNP

  1. Faça uma mistura da seguinte forma (Figura 2). Em um tubo de 1,5 mL, adicione 125 μL de Master Mix, 6 μL de ensaio de genotipagem SNP (40x), 280 μL de água destilada (DW), primer direto (450 nM), primer reverso (450 nM), sonda 1 (100 nM), sonda 2 (100 nM).
    NOTA: As sondas e primers estão listados na Tabela 1.
  2. Misture bem pipetando várias vezes para garantir uma concentração uniforme. Adicione 4 μL da mistura a cada poço de uma placa de PCR de 96 poços na base de suporte com uma micropipeta de 12 canais.
  3. Adicione 1 μL de lisado contendo cada DNA genômico a cada poço e misture pipetando várias vezes.
  4. Prepare controles positivos, ou seja, homozigotos de Bristol, homozigotos havaianos e híbridos de Bristol / Havaí, e três controles sem modelo como controles negativos (Figura 3A).
  5. Sele a placa com uma película adesiva óptica. Pressione o filme focalizando as bordas de cada poço usando um aplicador.
  6. Centrifugue a placa brevemente para coletar o líquido no fundo e remova as bolhas de ar do líquido.
  7. Carregue a placa no instrumento de PCR em tempo real. Clique no botão Criar novo experimento no software.
  8. Na configuração Propriedades, defina Tipo de instrumento para Sistema QuantStudio 1, Tipo de bloco para Bloco de 96 poços de 0,2 mL, Tipo experimental para Genotipagem, Química para Reagentes TaqMan e Modo de execução como Rápido.
  9. Na configuração Método, defina Volume para 5 μL (garantindo que o volume de reação correto corresponda à configuração), Contagem de ciclos para 40 ciclos (padrão). Defina as configurações de temperatura e tempo da seguinte forma: Pré-leitura Stage a 25 °C por 30 s, Hold Stage (ativação enzimática, partida a quente) a 95 °C por 20 s, PCR Stage a 95 °C por 1 s, 60 °C por 20 s e Pós-leitura Stage a 25 °C por 30 s.
  10. Na configuração Placa, combine as posições das amostras e controles com cada poço na tela do software.
  11. Salve o experimento em um dispositivo USB, carregue-o no instrumento de PCR em tempo real e clique no botão Executar .

6. Análise dos dados

  1. Salve os resultados em um USB e transfira-os para um computador para análise de dados.
  2. Analise os dados de delta Rn (dRn) em tempo real usando a fórmula abaixo, onde Rn (repórter normalizado) é o sinal de fluorescência do corante repórter, VIC e FAM, normalizado dividindo-se pelo sinal de fluorescência do corante de referência passivo, ROX.
    dRn = Rn - linha de base
  3. Revise o gráfico de discriminação alélica.
  4. Confirme a separação dos clusters (Figura 3B). No gráfico de discriminação de alelos, os homozigotos de Bristol são agrupados no canto inferior direito, os híbridos de Bristol / Hawaiian são agrupados no canto superior direito, os homozigotos havaianos são agrupados no canto superior esquerdo e os controles negativos são agrupados no canto inferior esquerdo. Use os seguintes códigos de cores:
    Vermelho: alelo de Bristol
    Azul: alelo havaiano
    Verde: Heterozigoto
    Preto: Controle negativo
  5. Exporte os resultados para um arquivo de planilha e reúna os dados de genotipagem de todas as quatro posições do SNP. Se houver chamadas indeterminadas em quatro posições consecutivas, exclua os dados do valor N. Use 90 amostras por placa para análise.
    1. Identifique os cruzamentos da seguinte forma: Se o SNP na posição #1 for um híbrido de Bristol/Havaí, e as posições #2-#4 forem todos homozigotos de Bristol [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] ou a posição #1 for um homozigoto de Bristol e a posição #2-#4 forem todos híbridos de Bristol/Havaí [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Esses resultados indicam um único cruzamento entre as posições # 1 e # 2 (em algum lugar no braço esquerdo do cromossomo). Da mesma forma, no caso de [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] ou [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], um único cruzamento ocorre entre #2 e #3 (em algum lugar na região central do cromossomo), e no caso de [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] ou [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], um único cruzamento ocorre entre # 3 e # 4 (em algum lugar no braço direito do cromossomo).
      NOTA: Existem seis padrões de cruzamentos duplos. Esquerda e direita: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] e [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], esquerda e centro: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] e [B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], centro e direita: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] e [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. Análise estatística

  1. Insira os valores no software SPSS Statistics (IBM). Para a comparação da distribuição cruzada no braço esquerdo, na região central e no braço direito dos cromossomos, insira 82 cromossomos com um cruzamento no braço esquerdo, 20 cromossomos com um cruzamento na região central e 68 cromossomos com um cruzamento no braço direito.
  2. Realize ANOVA e correção de Bonferroni e determine a significância estatística usando um valor de p bicaudal. Faça quantas comparações forem necessárias, como braço esquerdo versus centro ou WT versus mutante.

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Resultados

Detectamos os quatro sítios SNP no cromossomo II em C. elegans por ensaio de genotipagem de SNP para quantificar a formação de cruzamento por comprimento total do cromossomo, no braço esquerdo, na região central e no braço direito. A detecção de SNPs é realizada de acordo com as instruções do fabricante. A mistura master contém Taq DNA Polimerase, uracila-N-glicosilase termolábil (UNG), dNTP com dUTP e corante ROX de referência passiva. A Taq DNA polimerase é ativada a 95 °C, permitindo a inibição da amplificaçã...

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Discussão

Aqui, introduzimos um método para medir a frequência e distribuição de cruzamento na meiose de C. elegans com base na genotipagem de SNP de progênies cruzadas das espécies híbridas de Bristol / Havaí. Enquanto o método convencional de snip-SNP (RFLP) requer eletroforese em gel após PCR, e a detecção de bandas de DNA requer um sistema de documentação em gel14,18, a genotipagem de SNP pelo ensaio de nuclease 5 'usando PCR ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

As cepas foram gentilmente cedidas pelo Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Agradecemos aos membros do Laboratório Saito por suas discussões úteis sobre este trabalho. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant JP23K05868 à TTS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
101-1000μ l Ponta de pipetaQSP111-N-Q
Solução de 0,5 mol / I-EDTA (pH 8,0)Tesque de Nacalai14347-21
Solução de hidróxido de sódio 10mol / ITesque de Nacalai94611-45
10X DreamTaq Buffer VerdeThermo Fisher Scientific EP0713
10μ L, Ponta Longa, GranduatedFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μ L, ponta padrão, graduadaFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Ágar em póTesque de Nacalai01028-14
AgarosePH JapãoPH108
Autoclave TOMY modelo ES-215 Esterilizador a vapor de alta pressãoTOMY SEIKOES-215
Bacto Peptona Digestão Enzimática de ProteínasThermo Fisher Scientific 211677
Ácido bóricoTesque de Nacalai05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol tipo selvagem Centro de Genética CaenorhabditisN2
Caenorhabditis elegans Havaiano selvagem-tipoCentro de Genética CaenorhabditisCB4856
Cloreto de cálcioTesque de Nacalai06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP mitocondrial + dpy-20(+)] ILaboratório de SaitoTTS24originalmente de PD4251
ColesterolTesque de Nacalai08721-62
Ensaios de genotipagem de SNP TaqMan personalizadosThermo Fisher Scientific 4332077
Mistura de soluções de desoxinucleotídeo (dNTP)Biolabs da Nova InglaterraN04470
DigPrint Doc Tablet DP-T130zFerramentas biológicasDP-T130z
Hidrogenofosfato de di-potássioTesque de Nacalai28726-05
Microscópio de dissecaçãoNikonSMZ-745 C-DS
Dream Taq DNA PolimeraseThermo Fisher Scientific EP0713
Solução de brometo de etídioTesque de Nacalai14631-94
Primer para frente para WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
gelatinaTesque de Nacalai166-31
Gilson PIPETMAN Pipeta ClássicaThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Sulfato de magnésio heptahidratadoTesque de Nacalai21003-75
Placa de reação óptica de 96 poços MicroAmpThermo Fisher Scientific N8010560
Filme de Adedive Óptico MicroAmpThermo Fisher Scientific 4311971
MiniAmp  termocicladorThermo Fisher Scientific MiniAmp
Sistema de eletroforese horizontal Mini-Subcell GT, bandeja de 7 x 10 cmLaboratórios Bio-Rad1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Cloreto de potássioTesque de Nacalai285-38
Di-hidrogenofosfato de potássioTesque de Nacalai28720-65
Proteinase KThermo Fisher Scientific EO0491
Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 1, 96 poços, 0,2 mLThermo Fisher Scientific A40426
Escada de DNA Roxo de 1kb Plus de Carregamento RápidoBiolabs da Nova InglaterraN0550S
Primer reverso para WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
Cloridos de sódioTesque de Nacalai31319-45
TaqPath ProAmp Master MixThermo Fisher Scientific A30866
Prato TC 35, PadrãoSARSTEDT83.3900
Tris (hidroximetil) aminometanoTesque de Nacalai35406-75
Trizma baseSigma-Aldrich  T1503-1KG
Pré-adolescente 20Reagente Yoneyama03706
Picareta de minhoca WormStuffGenesee Científico59-AWP
WormStuff Worm Pick Dicas (90/10% Pt / Ir, 30 Gauge)Genesee Científico59-30PI36

Referências

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