Method Article

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

DOI:

10.3791/68185

⸱

May 30th, 2025

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalha o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico adequado para investigar a mecânica do polímero de microtúbulos. A síntese de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico desenvolvido para a investigação da mecânica de polímeros de microtúbulos. O projeto utiliza os benefícios intrínsecos dos dispositivos microfluídicos baseados em polidimetilsiloxano (PDMS) e introduz vários recursos para permitir uma abordagem experimental robusta e personalizável de alto rendimento. O dispositivo desenvolvido incorpora recursos redundantes de captura de bolhas para evitar a ocorrência de bolhas de ar prejudiciais. Além disso, o dispositivo faz interface com um sistema automatizado de controle de fluxo para reduzir a intervenção manual e permitir análises de alto rendimento. O software de simulação comercial é utilizado para melhor desenvolver e entender o transporte de fluidos usando este sistema. Finalmente, demonstramos a capacidade de conduzir vários experimentos simultaneamente em um único dispositivo, aumentando extensões de microtúbulos com rótulos fluorescentes distintos em diferentes seções do dispositivo. No geral, este sistema de fluxo microfluídico pode ser usado para sondar a mecânica do polímero de microtúbulos e fornece melhorias no projeto experimental para estudos in vitro de microtúbulos mais amplos. A síntese de microfabricação, controle de fluxo automatizado e abordagens de modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microfluídica permite o controle preciso de volumes minúsculos de fluido, geralmente inferiores a um microlitro, pelo intrincado projeto e fabricação de canais de fluxo de fluido 1,2. A pequena escala de dispositivos microfluídicos dá origem a fenômenos de engenharia únicos. Ou seja, o número de Reynolds - uma medida adimensional da razão entre as forças inerciais e viscosas no fluxo de fluidos - é pequeno, normalmente da ordem de O(10) ou inferior em microfluídica, ressaltando a importância das forças viscosas em dispositivos microfluídicos. Além disso, o número de Péclet, que compara o transporte convectivo ao difusivo, mostra que o transporte convectivo é geralmente insignificante em microfluídica 3,4,5. Esse regime de fluxo laminar orientado por difusão em microfluídica é vantajoso, pois suporta experimentos paralelos em um único dispositivo, mantendo gradientes de fluido precisos.

A fotolitografia continua sendo o principal método para a fabricação de dispositivos microfluídicos 6,7,8. Em resumo, esse processo envolve a criação de um modelo gravado 'mestre' do design microfluídico (Figura 1). Um substrato fotossensível é preparado e uma fotomáscara do design microfluídico expõe seletivamente áreas de fotorresistente à radiação ultravioleta. Os métodos de gravação subsequentes desenvolvem o substrato, produzindo um relevo do desenho. O polidimetilsiloxano (PDMS) é frequentemente fundido e curado no mestre. O PDMS curado, que adota as características negativas do design, é então removido do mestre e colado a uma lamínula de vidro. Todo esse processo de fabricação normalmente leva de 1 a 2 dias, permitindo iterações rápidas de design e a produção de vários dispositivos. Revisões detalhadas de processos de litografia macia e microfabricação estão disponíveis em outras referências 1,2,3,10,11,12,13.

figure-introduction-1
Figura 1: Visões gerais do processo tradicional de fotolitografia e processo de microfabricação. (A) Processo de fotolitografia tradicional e (B) processo de microfabricação. Dependendo da aplicação e das características fotorresistentes desejadas, um fotorresistente negativo ou positivo pode ser usado, mesmo que produzam o mesmo mestre de design. Características como a altura desejada do recurso ou a temperatura de fusão do fotorresistente ajudam a determinar o tipo de fotorresistente apropriado. Esta figura foi modificada com permissão de Rogers (2022)14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O uso da microfluídica tem ampliado as possibilidades em muitos campos de pesquisa, sendo seu impacto mais recente nas ciências biológicas. Dada a sua pequena escala, a microfluídica permite o gerenciamento preciso de recursos limitados e valiosos, como células ou proteínas. Ainda mais impactante é a capacidade de ajuste dos sistemas microfluídicos para imitar as condições fisiológicas, como modificações na rigidez do substrato, o exercício de força em um espécime e até mesmo a integração de corrente elétrica. Além disso, o uso de microfluídica oferece a capacidade de manipular vários reagentes em paralelo e de prototipar rapidamente e refinar iterativamente os projetos do sistema. Esses recursos permitem a miniaturização de fluxos de trabalho laboratoriais inteiros em um único dispositivo, comumente chamado de "lab-on-a-chip"1,6,9,15,16,17,18,19.

Uma das aplicações biológicas celulares da microfluídica é a investigação de polímeros de microtúbulos. Os microtúbulos são um componente essencial do citoesqueleto da célula, desempenhando um papel vital em processos como divisão celular e transporte de carga intracelular20,21. Como o elemento mais rígido do citoesqueleto, os microtúbulos exibem um módulo de elasticidade comparável ao do Plexiglass22,23. Suas propriedades mecânicas robustas são cruciais para várias funções celulares, incluindo, por exemplo, a contração dos cardiomiócitos, onde eles se dobram e relaxam ciclicamente durante as fases sistólica e diastólica do coração24. Dispositivos microfluídicos foram adotados anteriormente para investigar as propriedades dos microtúbulos e suas estruturas de ordem superior in vitro. De fato, a microfluídica tem sido usada para sondar a dinâmica de polimerização de microtúbulos, interações microtúbulo-microtúbulo e os efeitos de proteínas associadas a microtúbulos nas propriedades mecânicas dos microtúbulos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.

Embora a introdução da microfluídica no campo dos microtúbulos tenha trazido muitas descobertas interessantes, ainda há espaço para melhorias na adaptação desses dispositivos para a pesquisa de microtúbulos. Neste trabalho, abordamos duas limitações específicas que persistem no estudo de microtúbulos em dispositivos microfluídicos: o potencial de formação de bolhas de ar dentro do dispositivo, normalmente introduzido pela manipulação manual de dispositivos microfluídicos, e a subutilização de ensaios de alto rendimento. Primeiro, manipulações manuais, como conectar e desconectar tubos, podem introduzir a formação de bolhas nos canais. A formação de bolhas de ar dentro de uma célula de fluxo é catastrófica, pois as bolhas de ar podem desnaturar proteínas, cisalhar polímeros de microtúbulos e afetar adversamente as culturas de células42,43. Além disso, cantos afiados e ângulos oblíquos no dispositivo resultam em umedecimento superficial não uniforme, aumentando a possibilidade de entrada de ar. Inúmeras técnicas foram desenvolvidas para reduzir a formação, persistência e impacto das bolhas de ar; no entanto, o uso de métodos de mitigação de bolhas não é universal 42,43,44,45,46. Além disso, embora uma das principais vantagens do uso da microfluídica seja a capacidade de experimentação de alto rendimento, a microfluídica ainda não foi usada para ampliar a pesquisa de microtúbulos. Dispositivos microfluídicos podem ser projetados para testar várias condições experimentais em paralelo no mesmo dispositivo. Por exemplo, gradientes de fluido podem ser usados para direcionar o fluxo de diferentes proteínas ou medicamentos associados a microtúbulos, permitindo sua entrega direcionada a regiões específicas de microtúbulos particionados dentro do mesmo dispositivo.

Aqui, projetamos iterativamente um dispositivo microfluídico que aborda essas limitações. Fornecemos o protocolo passo a passo da fabricação do dispositivo, permitindo assim que um público mais amplo empregue a tecnologia microfluídica em sua pesquisa de microtúbulos. Este design de dispositivo incorpora recursos de captura de bolhas e utiliza um sistema de controle de fluxo automatizado para reduzir a intervenção manual, ao mesmo tempo em que permite gradientes de soluções no dispositivo para análises de alto rendimento. Em resumo, o desenvolvimento deste projeto microfluídico pode facilitar uma pesquisa e compreensão mais amplas da mecânica dos microtúbulos, oferecendo melhorias valiosas para projetos experimentais em todo o campo mais amplo de pesquisa de microtúbulos.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: O trabalho detalhado nesta parte do protocolo foi realizado na sala limpa da classe 100 do núcleo do Instituto Vanderbilt de Ciência e Engenharia em Nanoescala (VINSE). Uma sala limpa controlada com aventais apropriados e iluminação filtrada por UV é desejada para evitar danos ao dispositivo devido à umidade/condições de iluminação ambiente e para evitar a contaminação por partículas. Todas as manipulações em wafers de silício devem ser feitas com o lado polido do wafer de silício voltado para cima. Use uma pinça ao manipular wafers e minimize as superfícies de contato do wafer para evitar arranhões. Mantenha as bolachas em placas de Petri com as tampas tampadas durante o transporte e no final de cada dia, a menos que seja indicado de outra forma.

1. Fotolitografia (6 - 8 h)

  1. Limpe um wafer de silício de 3 "por 5 min sob vácuo (idealmente, pressão de vácuo < 5 × 10-5 torr) usando plasma de oxigênio (O2) ou ar seco limpo (CDA).
  2. Centralize o wafer de silício em um revestidor de rotação para deposição do fotorresistente.
  3. Deposite ~ 1-2 mL de fotorresistente SPR 220 7.0 no centro do wafer de silício.
    CUIDADO: Manuseie o fotorresistente com luvas e proteção para os olhos e descarte de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local.
  4. Gire o fotorresistente no wafer de silício até a espessura desejada com base nas curvas de rotação do fabricante. Gere camadas de ~ 13 μm de espessura girando a 1000 RPM por 30 s. Posteriormente, limpe o fotorresistente residual no revestidor de rotação com acetona e descarte-o de acordo com os protocolos específicos do local.
    NOTA: Se após o revestimento por centrifugação, o wafer não for revestido uniformemente com fotorresistente, repita as etapas 1.2-1.4. Um revestimento não uniforme pode ser devido a um wafer não centralizado no revestidor de rotação, usando muito pouco fotorresistente e/ou não depositando o fotorresistente no centro do wafer.
  5. Tocando o mínimo possível do fotorresistente no wafer, transfira o wafer de silício para uma placa quente regulada a 70 °C.
  6. Incubar o wafer de silício na placa de aquecimento, aumentando a temperatura em 10 °C a cada 3-5 min até que a temperatura atinja 115 °C.
  7. Desligar a placa de aquecimento e deixar arrefecer a pastilha de silício até à temperatura inferior a 65 °C.
    NOTA: As etapas de aquecimento e resfriamento são executadas lentamente para evitar rachaduras térmicas do fotorresistente, o que é comum nessa espessura. Se ocorrerem rachaduras térmicas, elas geralmente podem ser corrigidas reaquecendo o wafer de silício e diminuindo a taxa de resfriamento.
  8. Usando uma pinça, transfira o wafer de silício resfriado para um alinhador de máscara e carregue o wafer de silício e uma fotomáscara correspondente no alinhador de máscara seguindo os protocolos específicos do fabricante/local.
    NOTA: As fotomáscaras foram fabricadas por uma parte externa usando um projeto especificado, que foi criado com o AutoCAD. Consulte Arquivo suplementar 1 para obter a renderização do design da máscara.
  9. Exponha o wafer de silício à radiação ultravioleta (UV) por um tempo específico (com base na potência da lâmpada UV) seguindo os protocolos específicos do fabricante/local. A energia desejada para esta aplicação é ~400 mJ/cm2, e calcule o tempo de exposição pela fórmula: figure-protocol-1.
  10. Após a exposição, remova o wafer de silício do alinhador de máscara e deixe o fotorresistente reidratar por 4 h por circulação de ar. Certifique-se de que a tampa da placa de Petri esteja aberta para permitir a circulação de ar, mas coloque a placa em uma área improvável de ser exposta a partículas.
    NOTA: Uma pausa de 4 horas pode ser feita durante este tempo de reidratação, mas recomenda-se continuar com o procedimento no mesmo dia.
  11. Após a reidratação de 4 horas, transferir o wafer exposto para uma placa de aquecimento regulada a 70 °C.
  12. Incubar o wafer de silício na placa de aquecimento, aumentando a temperatura em 10 °C a cada 3-5 min até que a temperatura atinja 115 °C.
  13. Deixar incubar o wafer a 115 °C durante 10 min.
  14. Crie uma 'tampa' isolante para o wafer exposto moldando uma folha de papel alumínio na forma de uma tampa de placa de Petri.
  15. Desligue a placa de aquecimento e cubra o wafer exposto com a tampa de papel alumínio. Deixe o wafer esfriar durante a noite.
    NOTA: A rachadura térmica do fotorresistente é muito mais comum durante a etapa de incubação pós-exposição, e é por isso que um resfriamento lento durante a noite é recomendado. Isso conclui as etapas necessárias para o primeiro dia de fabricação. Recomenda-se prosseguir para a próxima seção no dia seguinte.

2. Desenvolvimento (1 - 2 h)

  1. Quando estiver pronto para desenvolver o wafer exposto, obtenha um recipiente limpo e um revelador fotorresistente apropriado. Aqui, o desenvolvedor MF-319 é usado com um contêiner dedicado.
    CUIDADO: Manuseie o revelador com luvas e proteção para os olhos, transfira o recipiente a granel para um recipiente secundário e descarte-o de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local.
  2. Despeje revelador suficiente no recipiente para submergir totalmente o wafer exposto (o volume real varia de acordo com o recipiente).
  3. Mergulhe o wafer exposto no revelador e espere até que todos os fotorresistentes indesejados sejam dissolvidos. Girar/agitar suavemente o recipiente ajuda no desenvolvimento até que pouco ou nenhum fotorresistente residual seja visível no wafer, exceto no design do dispositivo.
    NOTA: Várias trocas da solução do revelador podem ser necessárias para remover totalmente o fotorresistente indesejado, dependendo do volume da solução do revelador usada.
  4. Remova o wafer revelado da solução de revelação e enxágue suavemente ambos os lados do wafer com água desionizada (DI) por 30 s.
  5. Seque o wafer desenvolvido com gás nitrogênio (N2).
  6. Armazene o wafer revelado em uma placa de Petri em um ambiente seco e fresco até que esteja pronto para uso posterior. Embrulhe a placa de Petri em papel alumínio para evitar a degradação do fotorresistente devido à exposição à luz ambiente.
    NOTA: É recomendado, mas não obrigatório, prosseguir para a próxima seção no mesmo dia.

3. Silanização (1 - 2 h)

  1. Transferir a pastilha de silício para um exsicador.
  2. Coloque um pequeno recipiente de alumínio (ou um pedaço de papel alumínio dobrado em forma de recipiente) no dessecador.
  3. Pipetar 1 gota (~ 50 μL) de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano no recipiente de alumínio.
    CUIDADO: Manuseie a solução de silano com luvas e proteção para os olhos e descarte-a de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local.
  4. Feche o dessecador e ligue o aspirador.
  5. Permita que a dessecação/silanização ocorra por 1-2 h.
  6. Após o término do tempo de silanização, desligue o aspirador e recupere o wafer silanizado. Armazene o wafer silanizado em uma placa de Petri embrulhada em papel alumínio em um ambiente seco e fresco até que esteja pronto para uso posterior.
    NOTA: A silanização pode precisar ser repetida periodicamente nos wafers e com mais frequência em dispositivos onde camadas mais finas de PDMS são usadas. Se a adesão do PDMS for observada ao remover o PDMS do wafer, o wafer pode precisar ser resilanizado, e esta seção deve ser repetida assim que todo o PDMS for removido do wafer. Isso conclui as etapas necessárias para criar mestres de dispositivos microfluídicos. Os mestres são estáveis e as seções subsequentes podem ser executadas quando desejado.

4. Deposição de PDMS (1 - 2 h)

NOTA: Se houver PDMS residual no mestre de uma microfabricação anterior, o PDMS residual deve ser removido antes de depositar o novo PDMS.

  1. Em uma balança, pesar em um recipiente PDMS e agente de cura associado em uma proporção de peso de 10:1. O peso total necessário varia de acordo com a espessura desejada do PDMS e o tamanho da placa de Petri. Para uma placa de Petri de 4", ~ 20 g de PDMS e ~ 2 g de agente de cura produzirão uma espessura de 2-3 mm.
    CUIDADO: Manuseie a solução PDMS com luvas e proteção para os olhos e descarte-a de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local.
  2. Misture o PDMS e o agente de cura no recipiente por 5 min usando uma espátula de plástico ou outra ferramenta apropriada.
  3. Transfira o recipiente PDMS misto para um dessecador para desgaseificação.
  4. Feche o dessecador e ligue o aspirador. Bolhas de ar começarão a aparecer no PDMS.
  5. Deixe ocorrer a dessecação/desgaseificação por 30 min. Dependendo da quantidade de PDMS usada e do formato do recipiente, o tempo real pode variar; um ponto final geral é quando poucas ou nenhuma bolha está presente no PDMS.
  6. Após a desgaseificação, desligue o aspirador e recupere o recipiente PDMS.
  7. Despeje o PDMS misturado e desgaseificado no mestre em uma placa de Petri.
  8. Incubar o mestre na placa de Petri fechada a 65 °C durante a noite para permitir que o PDMS cure completamente.
    NOTA: Isso conclui as etapas para a deposição do PDMS. Recomenda-se permitir que o PDMS cure em uma incubadora durante a noite. O PDMS é então estável, para que as seções subsequentes possam ser executadas quando desejado.

5. Montagem do dispositivo PDMS (1 - 2 h)

  1. Recupere o(s) mestre(s) do dispositivo que curou PDMS, um par de pinças, um punção de biópsia padrão de 1.5 mm com um êmbolo manual e um bisturi/lâmina de barbear.
    CUIDADO: Manuseie a lâmina com cuidado e nunca corte em sua direção ou em outras pessoas. Recomenda-se uma lâmina auto-retrátil ou de segurança.
  2. Ao redor dos recursos do dispositivo, corte pedaços retangulares de PDMS do mestre de camadas. Certifique-se de que cada peça do PDMS tenha algum espaço em cada lado, flanqueando os recursos do dispositivo para facilitar um bom contato de colagem, garantindo que cada peça se encaixe em sua própria lamínula de vidro de 22 mm × 22 mm.
    NOTA: É importante evitar tocar na superfície inferior do PDMS (o lado com os recursos), portanto, sempre manuseie o PDMS pelas bordas usando uma pinça. Além disso, nunca coloque o lado do recurso do PDMS voltado para baixo em qualquer superfície. Quando não estiver em uso, armazene o PDMS com o lado do recurso voltado para cima em um recipiente fechado até que seja necessário.
  3. Faça furos de entrada e saída nas peças do PDMS usando um furador limpo de 1,5 mm. Perfure o PDMS do dispositivo em uma camada sobressalente de PDMS de sacrifício, em vez de em uma superfície dura que possa danificar o furador.
  4. Recupere e limpe uma lamínula de vidro de 22 mm × 22 mm com um lenço umedecido com álcool isopropílico (IPA).
  5. Limpe a lamínula de 22 mm × 22 mm por 5 min sob vácuo (pressão < 0,5 Torr) usando plasma CDA. Isso removerá quaisquer detritos ou revestimentos orgânicos na lamínula.
  6. Limpe a lamínula de vidro de 22 mm × 22 mm e o lado do recurso do PDMS com um pano umedecido com IPA.
  7. Coloque o PDMS (lado do recurso voltado para cima) e a lamínula de vidro (o mesmo lado voltado para cima que foi limpo anteriormente) no limpador de plasma e limpe o plasma simultaneamente por 30 s sob vácuo (pressão < 0.5 Torr) usando plasma CDA.
  8. Remova a lamínula de vidro e o dispositivo PDMS do limpador de plasma. Inverta o PDMS de modo que o lado do recurso fique voltado para baixo e coloque-o na lamínula de vidro. Observe a ligação e pressione levemente o PDMS conforme necessário para facilitar um bom contato.
  9. Incubar a lamínula colada numa placa de Petri fechada a 65 °C durante 3 min para facilitar a colagem.
    NOTA: A ligação de plasma altera a hidrofobicidade da lamínula de vidro, gerando uma superfície hidrofílica. Foi observado por meio de evidências anedóticas que o estado hidrofóbico original da lamínula retorna após aproximadamente 2 dias de incubação em temperatura ambiente. Recomenda-se o uso de dispositivos fabricados não antes de 2 dias após a ligação do plasma. Isso conclui as etapas de microfabricação. Os dispositivos não têm prazo de validade definido, mas devem ser armazenados em local fresco e seco quando não estiverem em uso.

6. Preparação do canal de fluxo microfluídico (1 h)

  1. Prenda um dispositivo microfluídico montado em um adaptador de platina personalizado limpo47.
  2. Recupere uma seringa, um adaptador Lour-lock e uma ponteira de encaixe e um pedaço de tubo transparente de 1.5 mm de diâmetro externo (aproximadamente 15-20 cm de comprimento). Conecte o tubo à seringa através do adaptador.
  3. Conecte mais três peças de tubulação às saídas do dispositivo microfluídico (esta tubulação não precisa ter um comprimento específico) e direcione a outra extremidade dessas tubulações para um frasco de resíduos a jusante.
  4. Usando a seringa, prepare o dispositivo microfluídico introduzindo soluções de acordo com as etapas abaixo. A sequência e o volume das soluções são os seguintes: 50 μL de solução tampão BRB80, 25 μL de solução de anticorpo anti-rodamina, aguarde 5 min, 50 μL de BRB80, 25 μL de poloxâmero 407 (F127), aguarde 15 min e 50 μL de BRB80. Veja a Tabela 1 para um exemplo.
    1. Puxe a solução de sua fonte para o tubo.
      NOTA: Não puxe a solução totalmente para dentro da própria seringa. A solução deve permanecer apenas na tubulação.
    2. Pressione suavemente o êmbolo da seringa até que uma pequena gota de fluido esteja presente na extremidade do tubo. Isso impedirá que o ar entre no dispositivo microfluídico quando a tubulação estiver conectada.
    3. Conecte a tubulação à entrada do dispositivo microfluídico.
    4. Pressione lentamente o êmbolo da seringa até que a maior parte, mas não toda, a solução tenha passado pelo tubo. Deixar uma pequena quantidade de líquido na tubulação garantirá que nenhum ar seja forçado inadvertidamente através da tubulação. Observe a tubulação e os canais microfluídicos durante essas transferências, procurando por bolhas.
      NOTA: Se ocorrerem bolhas na tubulação, inicie a solução de problemas (tente remover a bolha antes que ela entre no dispositivo microfluídico, desconectando a tubulação pouco antes da chegada da bolha e, em seguida, reconectando a tubulação após a passagem da bolha, etc.).
    5. Repita as etapas 6.4.1 a 6.4.4 para o próximo reagente até que todos os reagentes tenham passado por voo. Um novo pedaço de tubo de entrada será necessário para cada reagente para evitar a contaminação cruzada dos reagentes de origem. Assim que a lavagem final do BRB80 estiver concluída, o dispositivo ficará estável por vários minutos. Uma gota de solução BRB80 nas entradas evitará o ressecamento do dispositivo.
  5. Prepare 'sementes' de microtúbulos estabilizadas com guanosina-5'-[(α,β)-metileno]trifosfato (GMPCPP) de acordo com protocolos padrão (com uma proporção de marcação TTR de ~ 25%)47,48.
  6. Prepare uma solução tampão de imagem ('antifade') em uma concentração de trabalho 2x, combinando os seguintes reagentes nas respectivas quantidades (dependendo das concentrações de estoque) para produzir suas concentrações finais especificadas: BRB80 suplementado com 40 mM de glicose, 40 μg/mL de glicose oxidase, 16 μg/mL de catalase, 0,5 mg/mL de caseína, 50 mM de cloreto de potássio e 10 mM de ditiotreitol (DTT). Este tampão de imagem é usado para prolongar a fotoestabilidade. Veja a Tabela 2 para um exemplo.
  7. Dilua uma porção da solução antidesbotamento 2x 1:1 em BRB80 para obter uma solução de trabalho 1x de antidesbotamento. Aqueça este antifade à temperatura ambiente (RT); A solução antidesbotamento de estoque deve ser mantida no gelo.
OrdemReagentesDiluição de volumeVolume de lavagemTempo de incubação
1BRB80N/A50 μLN/A
2Anticorpo anti-rodamina1:50 em BRB80, misture bem25 μL5 min
3BRB80N/A50 μLN/A
4Poloxâmero 407 (F127)1% em BRB8025 μL15 min
5BRB80N/A50 μLN/A

Tabela 1: Ordem de preparação dos canais do dispositivo microfluídico.

VolumeReagenteConcentração de AçõesConcentração Final
16 μLD-glicose2 M80 mM
16 μLGlicose Oxidase2 mg/ml80 μg/mL
16 μLCatalase0,8 mg/mL32 μg/ml
14 μLCaseína28 mg/ml0,16 mg/ml
8 μLTDT1 milhão20 mM
40 μLCloreto de potássio1 milhão100 mM
290 μLBRB801xN/A
400 μLFINAL (2x concentração de trabalho)

Tabela 2: Receita de solução de imagem antidesbotamento (concentração de 2x).

7.  Introdução de sementes de microtúbulos para microfluídica (10 - 15 min)

  1. Conecte o dispositivo microfluídico ao microscópio.
    NOTA: Como a estabilidade dos microtúbulos depende da temperatura, recomenda-se que os experimentos de imagem sejam realizados a 35 °C.
  2. Conecte 10-15 cm de novo tubo à seringa e puxe uma diluição desejada de sementes de microtúbulos estabilizadas com GMPCPP no tubo.
    NOTA: Para este dispositivo, ~ 10 nM de sementes de microtúbulos GMPCPP foi a concentração ideal.
  3. Pressione suavemente o êmbolo da seringa até que uma pequena gota de fluido esteja presente na extremidade do tubo. Isso impedirá que o ar entre no dispositivo microfluídico quando a tubulação estiver conectada.
  4. Conecte a tubulação à entrada do dispositivo microfluídico.
  5. Pressione lentamente o êmbolo da seringa até que a maior parte, mas não toda, a solução tenha passado pelo tubo. Deixar uma pequena quantidade de líquido na tubulação garantirá que nenhum ar seja forçado inadvertidamente através da tubulação.
  6. Retire o tubo de entrada do dispositivo microfluídico e da seringa e conecte um novo pedaço de tubo à seringa.
  7. Puxe o BRB80 para dentro da tubulação.
  8. Repita as etapas 7.3-7.6 para remover as sementes de microtúbulos não ligadas do dispositivo.
  9. Observe a fixação das sementes à superfície microfluídica usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). O número ideal de sementes em um único campo de visão varia de acordo com a aplicação e o tamanho do campo de visão, mas geralmente, ~ 10-20 sementes por campo de visão de 80 μm × 80 μm é o ideal. Repita as etapas 7.2-7.9 conforme necessário até que a densidade de sementes desejada seja alcançada.
    NOTA: Para monitorar a densidade das sementes dos microtúbulos, deve-se usar exposição intermitente à luz curta (100 ms), pois ainda não há antidesbotamento na solução.
  10. Assim que a densidade de sementes ligada apropriada for atingida, conecte um novo pedaço de tubo de entrada à seringa.
  11. Puxe a solução antifade 1x quente para o tubo e repita as etapas 7.3-7.6.
    NOTA: Com a solução antifade agora no dispositivo, a fotoestabilidade é significativamente melhorada e o dispositivo fica estável. No entanto, ainda é recomendado minimizar a exposição à luz laser.

8. Cultivo de extensões de microtúbulos a partir de sementes (15 - 30 min)

  1. Combine tubulina marcada com fluorescência, tubulina não marcada, solução antidesbotamento 2x, guanosina-5'-trifosfato (GTP) e BRB80 para obter uma solução final contendo tubulina de 14 μM a uma proporção de marcação fluorescente de 7%, antidesbotamento a uma concentração de trabalho de 1x e GTP de 1 mM.
    NOTA: Se estiver usando diferentes concentrações ou diferentes porcentagens de rotulagem de tubulina, o volume de cada reagente precisará ser ajustado para atingir a concentração final desejada e a proporção de marcação. Mantenha a solução de tubulina no gelo até ~ 30 s antes da introdução, momento em que retire a solução do gelo e aqueça-a na mão para RT. Isso ajudará na polimerização das extensões de microtúbulos, que é um processo dependente da temperatura. De fato, a polimerização dos microtúbulos deve ser realizada a 35 °C, enquanto todas as outras etapas experimentais podem ser realizadas em RT.
  2. Conecte 10-15 cm de novo tubo à seringa e puxe a solução de tubulina para dentro do tubo.
  3. Pressione suavemente o êmbolo da seringa até que uma pequena gota de fluido esteja presente na extremidade do tubo. Isso impedirá que o ar entre no dispositivo microfluídico quando a tubulação estiver conectada.
  4. Conecte a tubulação à entrada do dispositivo microfluídico.
  5. Pressione lentamente o êmbolo da seringa até que a maior parte, mas não toda, a solução tenha passado pelo tubo. Deixar uma pequena quantidade de líquido na tubulação garantirá que nenhum ar seja forçado inadvertidamente através da tubulação. Retire a tubulação de entrada do dispositivo microfluídico.
  6. Imagem na frequência desejada por 10-15 min ou até que as extensões sejam longas o suficiente para dobrar. Normalmente, a imagem é realizada a 488 nm a cada 5 s e 561 nm a cada 60 s até que as extensões tenham pelo menos 5-10 μm de comprimento (~15 min).
    NOTA: Nesta concentração de tubulina, os microtúbulos podem alternar estocásticamente entre os períodos de polimerização e despolimerização; Isso é de se esperar, mas no geral, as extensões dos microtúbulos se alongarão49.

9. Estabilização de extensões de microtúbulos (10-15 min)

  1. Combine Taxol, solução antidesbotamento 2x e BRB80 para obter uma solução final contendo 10 μM de taxol e antidesbotamento em uma concentração de trabalho de 1x.
    NOTA: Mantenha a solução de taxol no gelo até ~ 30 s antes da introdução, momento em que retire a solução do gelo e aqueça-a na mão para RT. Isso evitará a despolimerização das extensões dos microtúbulos, que é um processo dependente da temperatura.
  2. Conecte 10-15 cm de novo tubo à seringa e puxe a solução de taxol para dentro do tubo.
  3. Pressione suavemente o êmbolo da seringa até que uma pequena gota de fluido esteja presente na extremidade do tubo. Isso impedirá que o ar entre no dispositivo microfluídico quando a tubulação estiver conectada.
  4. Conecte a tubulação à entrada do dispositivo microfluídico.
  5. Pressione o êmbolo da seringa até que a maior parte, mas não toda, a solução tenha passado pelo tubo. Deixar uma pequena quantidade de líquido na tubulação garantirá que nenhum ar seja forçado inadvertidamente através da tubulação.
  6. Repita as etapas 9.2-9.5 duas vezes em rápida sucessão. O mesmo pedaço de tubo pode ser usado neste caso.
    NOTA: O taxol promove a nucleação de microtúbulos de novo a partir da tubulina em solução, e esses microtúbulos podem pousar na superfície do canal microfluídico e interferir na imagem/flexão subsequente. Por causa disso, a solução de taxol deve fluir através do dispositivo rapidamente e em várias iterações para remover o máximo de tubulina livre do dispositivo o mais rápido possível.
  7. Verifique se os microtúbulos cultivados a partir de sementes ainda estão presentes e estabilizados no dispositivo.

10. Extensões de microtúbulos estabilizadas por flexão (10 - 15 min)

NOTA: As extensões de microtúbulos estabilizadas agora podem ser dobradas usando um controlador de fluxo. Aqui, um sistema de deslocamento de pressão positiva regulado (Elveflow OB1 MK3+) foi usado para fluir a solução de um frasco de fonte hermética através de um medidor de vazão e para o microfluídico. Dependendo das especificidades da configuração do controlador de fluxo disponível, podem ser feitas modificações nas etapas a seguir.

  1. Configure o controlador de fluxo e o equipamento associado de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local, usando tubulação para conectar o frasco de origem à entrada do medidor de vazão e a saída do medidor de vazão à entrada microfluídica, mas não conecte a tubulação ao dispositivo microfluídico ainda.
  2. Insira ~ 200 μL da solução de taxol de 10 μM em um frasco de origem que pode ser conectado à configuração do controlador de fluxo. Esta configuração usa conexões Luer-lock para criar uma vedação hermética.
  3. Ligue o sistema de controle de fluxo e prepare a tubulação para remover o ar. Isso impedirá que o ar entre no dispositivo microfluídico quando a tubulação estiver conectada.
  4. Depois que a tubulação tiver sido preparada através do medidor de vazão e uma pequena gota de fluido estiver presente na extremidade da tubulação, desligue o sistema de controle de fluxo.
  5. Conecte a tubulação à entrada do dispositivo microfluídico. Use uma entrada perpendicular à entrada usada para introduzir as sementes de microtúbulos e cultive as extensões de microtúbulos para dobrar ortogonalmente.
  6. Extensões de dobra iniciando e parando o fluxo na vazão ou pressão desejada. Uma pressão de 30 mbar é o padrão para este protocolo usando um fluxo oscilatório de período de 5 s. Imagine a curvatura durante esse tempo, normalmente a cada 0,1 s a 488 nm e a cada 10 s a 561 nm.
    NOTA: Isso completa o ensaio básico de flexão de microtúbulos. Todos os equipamentos e reagentes podem ser limpos/descartados de acordo com os protocolos específicos do fabricante/local.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Justificativa do projeto do dispositivo microfluídico
O design do dispositivo microfluídico neste estudo foi guiado por vários recursos principais (Figura 2), que se baseiam e aprimoram o design tradicional de célula de fluxo simples. É importante notar que o dispositivo microfluídico tem um volume interno de ~ 160 nL, significativamente menor do que o volume de ~ 10 μL das células de fluxo mais tradicionais47, permitindo um uso mais controlado de reagentes potencialmente preciosos, como componentes de proteínas purificadas. Como o controlador de fluxo microfluídico contém dois canais de regulação, o dispositivo foi desenvolvido assumindo que apenas duas portas de entrada/saída teriam controle de pressão a qualquer momento. Mais canais controlados por pressão podem ser implementados, se desejado.

figure-results-1
Figura 2: Esquema do projeto do dispositivo microfluídico. As marcações retangulares na periferia são para auxiliar visualmente na visão da periferia dos canais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A câmara central retangular do dispositivo serve como a principal área de imagem onde as sementes de microtúbulos são fixadas e as extensões de microtúbulos são polimerizadas a partir dessas sementes. A câmara é interceptada por um canal de fluxo de cada lado, com canais retos ao longo do eixo x servindo como entrada e saída para facilitar a troca rápida da solução de reação. O canal de entrada de microtúbulos também é usado para introduzir sementes de microtúbulos na câmara, com fluxo laminar resultando na ligação da semente à superfície do vidro ao longo da direção do fluxo. Na direção perpendicular (eixo y), os canais de fluxo se ramificam em canais menores em direção à câmara, semelhante a alguns dos projetos anteriores 25,28,36,39. A geometria ramificada é particularmente adequada para estudar as propriedades mecânicas dos microtúbulos. O fluxo de uma solução para a câmara central a partir de uma direção perpendicular à orientação das sementes dos microtúbulos permite forças de flexão induzidas pelo fluxo em ângulos quase normais. Além disso, a inclusão da geometria ramificada com muitos canais de fluxo menores facilita uma aplicação de força mais homogênea em uma ampla área da câmara central, o que não é alcançado por uma geometria de fluxo simples de canal único. Desta forma, o motivo de ramificação, embora aparentemente mais complicado, pode reduzir a complexidade geral na determinação da força transmitida aos microtúbulos (Figura 3). Este projeto também apresenta várias linhas de simetria, permitindo facilidade de uso e a oportunidade de avaliar a flexão de várias direções (por exemplo, superior vs. inferior).

figure-results-2
Figura 3: A inclusão de um motivo de ramificação resulta em uma grande área de fluxo semelhante. Simulações de dois projetos de dispositivos sob fluxo em estado estacionário: um sem canais ramificados (A) e outro com canais ramificados (B). As setas denotam a direção do fluxo local e são proporcionais à magnitude do fluxo. A coloração da superfície denota a velocidade da linha central. As imagens à direita mostram a seção ampliada do dispositivo onde os microtúbulos (não mostrados) orientados ao longo do eixo x estariam sujeitos a forças de flexão de um fluido que flui na porta superior e sai pela porta inferior. A incorporação de canais de ramificação aumenta a área relativa sujeita a campos de velocidade semelhantes, sem aumentar o volume de reagente necessário. Esta figura foi modificada com permissão de Rogers (2022)14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Notavelmente, o dispositivo também implementa uma série de coletores de bolhas nos canais de fluxo de entrada e saída para evitar que bolhas de ar entrem na câmara central de imagem. Especificamente, optamos por incluir matrizes de micropilares dentro do caminho do fluxo para impedir que as bolhas de ar passem devido à tensão superficial (Figura 2) 46. Além disso, para evitar a entrada de ar, projetamos as bordas dentro do dispositivo como curvas suaves, em vez de ângulos oblíquos. Juntos, esses recursos de design reduzem a possibilidade de bolhas de ar e aumentam a robustez do dispositivo.

Fabricação de dispositivos microfluídicos
Determinar os parâmetros adequados para criar o mestre do dispositivo exigiu alguma otimização. Como observado anteriormente, este fotorresistente é muito sensível aos principais parâmetros operacionais, como iluminação ambiente e as taxas de aquecimento e resfriamento durante as etapas de fotolitografia50. Por exemplo, se o mestre foi resfriado muito rapidamente após o aquecimento, rachaduras térmicas podem se desenvolver no fotorresistente. Isso é indesejável, pois as rachaduras podem comprometer a integridade do canal. Embora as rachaduras possam ser resolvidas reaquecendo a resistência a uma temperatura próxima à sua temperatura de transição (~ 115 ° C), descobrimos que permitir que o mestre esfrie a placa quente era a maneira mais robusta de evitar rachaduras. Além disso, o excesso de luz ambiente pode resultar em exposição não intencional do fotorresistente, enfraquecendo a resistência e resultando nos próprios recursos do dispositivo (que devem permanecer no wafer após o desenvolvimento) passando por uma remoção parcial durante a etapa de desenvolvimento. Por esse motivo, incentivamos que a etapa de desenvolvimento seja realizada no dia seguinte às etapas de cozimento pós-exposição e resfriamento ambiente durante a noite. Além disso, sempre que o mestre do dispositivo não estiver em uso, recomendamos armazená-lo em uma área escura ou embrulhado em papel alumínio para evitar degradação ao longo do tempo. Uma vez determinados esses parâmetros, o processo de fotolitografia foi altamente repetível (Figura 4).

Depois que o mestre foi criado, o PDMS líquido foi fundido em cima do mestre, permitindo que o PDMS curasse e criasse uma impressão negativa das características do mestre. Descobrimos que a fundição do PDMS com uma espessura de 2-3 mm permitiu fácil manipulação dos dispositivos; em contraste, se revestido por rotação para atingir uma espessura na faixa de μm, o PDMS era propenso a rasgar ou se auto-aderir, dificultando a manipulação. Além disso, uma camada PDMS mais espessa permite uma conexão mais fácil da tubulação, pois a tubulação permanecerá nas portas de entrada/saída sem a necessidade de um selante ou braçadeira.

Finalmente, enquanto os ensaios tradicionais de célula de fluxo para essas aplicações biológicas geralmente usam lamínulas de vidro que foram pré-limpas usando uma solução de Piranha (peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico) e depois silanizadas, descobrimos que as lamínulas tratadas com uma limpeza de plasma estendida e lavagem IPA eram adequadas para nossos propósitos47. Outras aplicações, como imagens de molécula única, podem exigir um tratamento de vidro de cobertura mais extenso.

figure-results-3
Figura 4: Processo de fotolitografia. (A) A máscara com o desenho desejado (máscara feita de cromo gravado em vidro). (B) Ligeira rachadura do fotorresistente no wafer de silício devido ao estresse térmico (as setas destacam algumas rachaduras). Essas rachaduras geralmente se estendem por todo o wafer. (C) O mestre desenvolvido. (D) A configuração microfluídica no microscópio. Os componentes individuais são rotulados em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Crescimento, estabilização e flexão dos microtúbulos
As sementes de microtúbulos cultivadas em GMPCPP servem como locais de nucleação para a polimerização das extensões de microtúbulos e são estáveis contra a despolimerização por várias horas à temperatura ambiente. As sementes foram ligadas à lamínula de vidro no canal microfluídico usando um anticorpo anti-rodamina47. Extensões dinâmicas de microtúbulos foram então cultivadas na presença de tubulina solúvel (marcada com fluorescência, mas não conjugada com rodamina) e GTP. Dessa forma, os locais de nucleação das sementes foram fixados à lamínula de vidro, mas as extensões não. Durante o período de crescimento de extensão de 15 min, as extensões dos microtúbulos polimerizaram e despolimerizaram estocásticamente, como esperado devido à sua instabilidade dinâmica intrínseca49. Após este período de crescimento, uma lavagem de Taxol de 10 μM foi realizada para eliminar qualquer tubulina remanescente da solução e estabilizar as extensões de microtúbulos que se formaram. A estabilização é fundamental, pois as extensões dos microtúbulos se despolimerizariam após a depleção da tubulina. Além de ligar e estabilizar o polímero de microtúbulos, o Taxol também demonstrou impactar a mecânica do polímero de microtúbulos e pode induzir curvatura nas extensões de microtúbulos lineares 51,52,53,54. Os resultados mostrados aqui refletiram essas observações; no entanto, a curvatura das extensões dos microtúbulos é indesejável, pois isso resulta em forças desiguais transmitidas ao longo da rede durante a flexão. Portanto, apenas os microtúbulos que permaneceram relativamente retos após a estabilização foram usados para análise de flexão. Alternativamente, após o período de crescimento inicial, um período de crescimento secundário com uma solução de tubulina e GMPCPP (em oposição ao GTP inicial) pode ser usado para criar 'tampas' estáveis nas extremidades de crescimento da rede de microtúbulos e evitar a despolimerização55.

Os microtúbulos foram então dobrados fluindo na solução tampão usando o sistema de controle de pressão para manter uma pressão constante a montante (Figura 5, Vídeo Suplementar 1). Dessa forma, pudemos aproximar o fluxo local experimentado pelos microtúbulos. Ao fluir o fluido pela porta superior e pela porta inferior do dispositivo, a orientação do fluxo deveria ser perpendicular à orientação de semeadura.

figure-results-4
Figura 5: A configuração microfluídica pode ser usada para dobrar microtúbulos estabilizados. Os microtúbulos em estado de repouso após a estabilização com paclitaxel são dobrados durante o fluxo pulsátil. Uma pressão constante a montante de 30 mbar impulsiona o fluxo (a seta indica a direção do fluxo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Determinação do perfil de fluxo no dispositivo microfluídico
A velocidade da linha central na microfluídica pode ser simulada computacionalmente usando o software COMSOL (software de simulação, Figura 6A). No entanto, os microtúbulos estão ligados à lamínula de vidro para microscopia TIRF dentro de ~ 100 nm da superfície. Portanto, a velocidade experimentada pelo microtúbulo não é a mesma prevista na simulação 2D. Para aproximar o fluxo local experimentado pelos microtúbulos, usamos a equação geral de Navier-Stokes para um fluxo de fluido incompressível em uma dimensão:

figure-results-5

Aqui, z é a altura dos microtúbulos no dispositivo, h é a altura total do dispositivo e vc é a velocidade da linha central no dispositivo. Por definição do sistema, a origem z é o centro do dispositivo (Figura 6B). Usando esta definição e uma altura de canal de 13 μm, a altura dos microtúbulos é aproximada como z = -6,4 μm. Resolver esta equação produz uma estimativa para a velocidade local do fluido experimentada pelos microtúbulos:

figure-results-6

figure-results-7
Figura 6: Definição do sistema para análise de fluxo de fluido do fluido que entra no dispositivo na porta superior e sai na porta inferior (portas não mostradas). (A) Simulação do campo de velocidade da linha central dimensionada como na Figura 3B. A estrela denota a área de interesse do painel B. (B) Representação da seção transversal do dispositivo. O perfil de fluxo de fluido totalmente desenvolvido está na direção y com uma velocidade da linha central vc em z = 0 e uma condição de contorno sem deslizamento nas paredes. Observe que as setas neste painel não estão em escala em relação ao campo de velocidade real mostrado no painel A. Esta figura foi modificada com permissão de Rogers (2022)14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além das simulações, a velocidade do fluido pode ser controlada usando um controlador de fluxo baseado em uma taxa de fluxo volumétrico em vez de manter a pressão. Além disso, a taxa de fluxo local em cada dispositivo pode ser determinada diretamente incluindo esferas fluorescentes e monitorando sua velocidade, aliviando assim qualquer variabilidade de amostra para amostra.

Modelagem computacional e demonstrações de gradiente
Finalmente, realizamos simulações computacionais em combinação com experimentos para demonstrar a viabilidade do uso deste dispositivo para experimentos de alto rendimento. Juntamente com a capacidade de dobrar microtúbulos em várias direções graças à simetria do dispositivo, as simulações mostraram que o dispositivo pode manter gradientes precisos, permitindo a investigação simultânea de várias condições experimentais (Figura 7A). Experimentos preliminares (métodos não explicitamente declarados como parte desta publicação) usando corante fluorescente em solução demonstraram consistência com as previsões computacionais (Figura 7B). Além disso, demonstramos com sucesso a partição de diferentes proteínas em diferentes áreas do dispositivo, aumentando simultaneamente extensões de microtúbulos com diferentes marcadores fluorescentes (Figura 8). Até onde sabemos, esta é a primeira aplicação de microfluídica de alto rendimento para investigações de microtúbulos. Esse recurso deste dispositivo pode ser usado para reduzir o tempo e as quantidades de reagentes necessários, ao mesmo tempo em que melhora a robustez experimental. Por exemplo, os efeitos de diferentes proteínas ou concentrações distintas de proteínas individuais na mecânica e dinâmica dos microtúbulos podem ser investigados simultaneamente em um único dispositivo.

figure-results-8
Figura 7: Formação de gradiente. (A) Simulação de um gradiente de duas soluções entrando no dispositivo com a mesma pressão de entrada (50 mbar) e concentração (15 μM). As portas de entrada para cada solução são indicadas com setas coloridas (uma solução na porta superior e outra solução na porta direita), e as duas portas restantes servem como saídas. O mapa de calor mostra o perfil de concentração da solução superior. O estado estacionário foi alcançado em t = 5 s. (B) Geração experimental de um gradiente semelhante usando corante fluorescente em solução na porta superior e tampão na porta direita. A imagem é uma camada raster feita costurando cada campo de visão (80 μm × 80 μm) para resolver toda a área do dispositivo. Esta figura foi modificada com permissão de Rogers (2022)14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-9
Figura 8: Demonstrando um gradiente de proteína no dispositivo microfluídico. A tubulina marcada com AlexaFluor647 (magenta) foi voada na entrada 1, e a tubulina marcada com AlexaFluor488 (verde) foi voada na entrada 2 do dispositivo em concentrações e taxas de fluxo iguais. O fluxo foi oscilado em incrementos de 90 s para permitir a polimerização da tubulina a partir de sementes de GMPCPP estabilizadas (vermelho) enquanto inibia a mistura. (A) Camada raster em grande escala feita costurando campos de view (80x80 μm) para resolver todo o comprimento do dispositivo. As letras designam a localização relativa de campos de visão individuais nos painéis subsequentes. A barra de escala é de 50 μm nas posições X e Y. (B) Campo de view próximo à entrada 1 do dispositivo, onde as extensões são compostas predominantemente de tubulina marcada com A647. (C) Campo de view próximo ao meio do dispositivo, onde as extensões são compostas por uma mistura de tubulinas marcadas, conforme previsto. (D) Campo de visão próximo à parte inferior do dispositivo, onde as extensões são compostas predominantemente por tubulina marcada com A488. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um diagrama de fluxo de processo (PFD) para a configuração experimental de microfluídica em um microscópio é mostrado na Figura Suplementar 1.

Figura suplementar 1: Um diagrama de fluxo de processo (PFD) para a configuração experimental de microfluídica em um microscópio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1. A configuração microfluídica pode ser usada para dobrar microtúbulos estabilizados. Os microtúbulos em estado de repouso após a estabilização com paclitaxel são dobrados durante o fluxo pulsátil. Uma pressão constante a montante de 30 mbar impulsiona o fluxo. Taxa de reprodução de vídeo 10 fps. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Um arquivo CAD do design da máscara microfluídica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo principal deste protocolo foi projetar e fabricar um dispositivo microfluídico adequado para a investigação da mecânica dos microtúbulos in vitro. O projeto foi baseado no desejo de utilizar os benefícios intrínsecos dos dispositivos microfluídicos baseados em PDMS, ao mesmo tempo em que incluía uma combinação de recursos que permitiriam uma experimentação robusta e personalizável de alto rendimento.

Este objetivo foi alcançado com sucesso, resultando em protocolos de fabricação e diretrizes gerais que podem servir de base para futuros usuários deste sistema. A inclusão de armadilhas de bolhas redundantes no dispositivo diminui a probabilidade de desnaturação de proteínas devido à presença de bolhas de ar. Embora ainda tenhamos alguns desplugues e replugues da tubulação no dispositivo, essas armadilhas de bolhas reduzem a probabilidade de falha experimental. Melhorias futuras na configuração microfluídica podem reduzir ainda mais a quantidade de manipulações manuais de tubos feitas durante um experimento. Além disso, a integração do dispositivo microfluídico com um software de controle de fluxo automatizado permite uma personalização significativa das condições experimentais, reduzindo a possibilidade de erro manual. Demonstramos o desempenho bem-sucedido do dispositivo fabricando o dispositivo e, em seguida, crescendo, estabilizando e dobrando extensões de microtúbulos no dispositivo usando fluxo automático regulado por controlador. Além disso, ao estabelecer um gradiente de soluções distintas de tubulina marcadas com fluorescência dentro do mesmo dispositivo, mostramos que várias condições podem ser executadas simultaneamente em um único dispositivo. Auxiliado por técnicas de modelagem e análise computacional, nosso sistema pode sondar e determinar as propriedades biomecânicas dos microtúbulos, como a rigidez à flexão 52,56,57,58,59.

Possíveis melhorias futuras facilitariam um sistema ainda mais robusto e análises experimentais associadas. Primeiro, a deposição, exposição e cozimento do fotorresistente foram parâmetros cruciais que demonstraram alguma variabilidade. Os tamanhos de recursos relativamente altos do fotorresistente SPR exigiam aquecimento e resfriamento muito graduais para evitar rachaduras térmicas, o que poderia arruinar os dispositivos. Embora dispositivos mais finos tenham sido tentados, encontramos problemas com a manipulação desses tamanhos de recursos menores. Atenção aos detalhes e paciência são cruciais para replicar dispositivos dessa espessura com fotorresistente SPR. Diferentes fotorresistentes podem ser usados para resolver esse problema, dependendo da disponibilidade.

Juntos, o dispositivo microfluídico e o protocolo aqui permitem uma variedade de configurações experimentais com recursos de teste mais robustos e de alto rendimento do que os ensaios anteriores de células de fluxo47. Além disso, os experimentos podem ser automatizados usando controladores de fluxo para manter perfis de fluxo precisos ou gradientes de concentração no dispositivo, reduzindo a variabilidade inerente aos usuários manuais. Futuras aplicações potenciais desta configuração incluem a investigação dos efeitos de proteínas associadas a microtúbulos na rigidez, dinâmica, dano à rede e reparo de microtúbulos, bem como as interações biomecânicas de microtúbulos e filamentos de actina 54,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70. A integração de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem e análise computacional cria um sistema versátil adequado para estudar o citoesqueleto celular in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse. Os autores divulgam o uso do ChatGPT-4o OpenAI para revisão e revisão de texto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos pelo apoio e recursos fornecidos pelo Instituto Vanderbilt de Ciência e Engenharia em Nanoescala (VINSE), onde uma parte desta pesquisa foi conduzida. Este trabalho foi parcialmente financiado por meio de uma doação do NIH NIGMS para M. Zanic (R35 GM1192552) e NSF ID 2018661 concessão para M. Zanic. M. Rogers recebeu apoio da bolsa de GM08320 NIH T32 e um prêmio de financiamento piloto VINTE. L. Richardson é apoiado pelo NSF GRFP Grant No. 1937963. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Alice Leach, David Schaffer, Dra. Christina McGahan e todo o laboratório Zanic por sua assistência e apoio.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL (transparentes)Qualquer marcaTipo de baixa retenção é preferido
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (transparente)Qualquer marcaTipo de baixa retenção é preferido
Punção de biópsia padrão de 1,5 mmIntegra LifeSciences33-31A-P/25
100x/1,49 abertura numérica Objetiva TIRFNikon
22 x 22 mm vidro lamínulasThorLabsCG15CH
3" wafers de silício polido de lado únicoUniversity Wafer447
4" Placa de PetriQualquer marca
450 µ L, Tubo Ultra-Claro de Parede Fina AbertaBeckman Coulter, Inc.345843Referido como 'tubo de airfuge' no protocolo
de lasers de estado sólido de 488, 561 e 640 nmNikon
Coulter, Inc.
AcetonaQualquer marca
Airfuge Ultracentrífuga acionada a arBeckman Coulter, Inc.347854Referido como 'airfuge' no protocolo Alexa
Fluor 488 Microscale Protein Labeling KitThermo Fisher ScientificA30006
Folha de alumínioQualquer marca
Andor iXon Ultra EM-CCDNikon
Andor NEO sCMOSNikon
AutoCADAutodeskVersões genéricas pode ser usado
Tubulina não marcada com cérebro bovino (purificado)N/AFeito em casa, mas pode ser comprado
CaseínaMilliporeSigmaC7078
CatalaseMilliporeSigmaC9322
Ar Limpo e Seco (CDA) (gás pressurizado)Qualquer marca
Fornecimento de ar comprimidoQualquer marcaConecta-se ao microfluídico controlador de fluxo
COMSOL Software multifísicoCOMSOL, Inc.
Adaptador de platina de latão personalizadoN/AFeito internamente para caber nossas lamínulas de 22 mm x 22 mm no microscópio
Água deionizadaQualquer marca
DessecadorQualquer marca
D-glicoseMilliporeSigmaG7528
Ditiotreitol (DTT)MilliporeSigmaD0632
EGTAMilliporeSigma324626
Elveflow Smart Interface (ESI) software Elveflow
Conexões PFA sem flange com ETFE ¼ "-28 a 1/16" Diâmetro externo das virolas Darwin MicrofluídicaCIL-XP-245XUsado para conectar a tubulação dos frascos de fonte micrewtube ao sensor de fluxo através do rack de reservatório pressurizado
Fluiwell 4 canais 2 mLFluiwell Fluiwell 14002001 FluigenteUsado para conectar o sistema de controle de fluxo aos micrewtubes. Também referido como 'rack de reservatório pressurizado'Hotte
de qualquermarca
Glicose oxidaseMilliporeSigmaG6125
GMPCPPJena BioscienceNU-405L
Trifosfato de guanosina (GTP)MilliporeSigmaG8877
Placa quenteQualquer marca
HS-625 de alta velocidade roda de filtro de emissãoFinger Lakes Instrumentação
ImageJ softwareN/A
IncubadoraQualquer marca
Álcool isopropílicoQualquer marca
Karl Suss MA-6 alinhador de máscaraSUSS MicroTec
Cloreto de magnésioMilliporeSigma1.05833
Software MATLABMathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorresistenteDow, Inc.
Kit de Adaptadores Microfluídicos 6-40 a 1/4"-28Darwin MicrofluicsLVF-KFI-08Usado para conectar a tubulação dos frascos de fonte micrewtube ao sensor de fluxo através do rack do reservatório pressurizado (rack Fluiwell)
Conexões Microfluídicas Kit Adaptador Luer Lock FêmeaDarwin MicrofluídicaLVF-KFI-04Usado para conectar a seringa ao tubo
Controladorde fluxo microfluídicoElveflowOB1 MK3+
Sensor de fluxo microfluídicoElveflowMFS3Esta faixa de sensor de fluxo é de 0-80 μ L 
MICROPOSIT MF-319 desenvolvedorDow, Inc.
MicroscópioNikonEclipse Ti
NIS-Elements softwareNikon
Nitrogênio (gás pressurizado)Qualquer marca
Aquecedor de objetivaTokai Hit
One-Piece Fingertight 10-32 Coned Fitting para tubulação de 1/16" OD Darwin MicrofluídicaCIL-F-120XUsado para conectar a seringa ao tubo
Paclitaxol (Taxol)Tocris Bioscience1097
Máscaras de fotolitografiaN/AFeito por uma parte externa usando nossos designs
PIPESThermo Fisher Scientific172615000
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-32G
Sistema de medidor de vazão de plasmaHarrick PlasmaPDC-FMGIntegra-se com o limpador de plasma para permitir o controle de fluxo de gás pressurizado
Pipeta de bulbo de plásticoQualquer marca
Pluoronic F-127MilliporeSigmaP2443Referido como 'poloxômero 407' no protocolo
Cloreto de potássioResearch Products InternationalP41000
Saint Gobain Performance Plastics  Tubo Tygon .020 IDThermo Fisher Scientific50-206-8921Referido como 'tubulação de 1,5 mm' e 'tubulação' no protocolo
BisturiQualquer marca
Revestidor de rotaçãoEquipamento de custo efetivo, LLC.200xEste modelo pode ser descontinuado
Conjuntos de pipetas e pontas padrãoQualquer marca
Seringa de plástico padrãoQualquer marcaUsamos uma seringa Luer-slip de 10 mL
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184Dow, Inc.Referido como 'PDMS' e 'agente de cura' no protocolo
T339 Micrewtube com Lip Seal e Flat Screw CapMedline Industried, LP.T339Referido como 'frasco de origem' no protocolo. Usamos os tamanhos de 0,5 mL e 1,5 mL
TAMRA, SE; 5-(e-6)-Carboxitetrametilrlamina, Éster SuccinimidílicoInvitrogenC1171Referido como 'TTR' no protocolo
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silanoMilliporeSigma448931
Trion Phantom RIE ICP Trion Tecnologia, Inc.Este limpador de plasma é usado apenas na Etapa 1.1 do protocolo. Outro limpador de plasma, como o usado para colagem PDMS, pode ser usado em seu lugar; nós apenas preferimos o vácuo muito mais baixo alcançável por este sistema para limpar o wafer de silício
TRITC Anticorpo PoliclonalThermo Fisher ScientificA6397Referido como 'anticorpo anti-rodamina' no protocolo
PinçasQualquer marca
Bomba de vácuoQualquer marca
A-95 Rotor de ângulo fixo Beckman 347595 de baixa pressão de acesso aberto

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  2. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).
  3. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).
  4. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).
  5. Ng, J. M. K., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).
  6. Dellaquila, A. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).
  9. Neužil, P., Giselbrecht, S., Länge, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).
  10. Manz, A., Graber, N., Widmer, H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).
  11. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  12. Knight, J. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).
  13. Photolithographic fabrication techniques for transistors which are an integral part of a printed circuit. Nall, J. R., Lathrop, J. W. 1957 International Electron Devices Meeting, Washington, DC, USA, , (1957).
  14. Rogers, M. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).
  15. Lee, J. B., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).
  16. Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).
  17. Venkatesan, S. u, Jerald, J., Asokan, P., Prabakaran, R. A Comprehensive Review on Microfluidics Technology and its Applications. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).
  18. Minteer, S. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).
  19. Mitra, S. K., Chakraborty, S. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).
  20. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).
  21. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).
  22. Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).
  23. Gardel, M. L., Kasza, K. E., Brangwynne, C. P., Liu, J., Weitz, D. A. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).
  24. Caporizzo, M. A., Prosser, B. L. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).
  25. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  26. Chu, S. H., et al. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).
  27. Geisterfer, Z. M., Zhu, D. Y., Mitchison, T. J., Oakey, J., Gatlin, J. C. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).
  28. Schaedel, L., et al. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).
  29. Aher, A., et al. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).
  30. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).
  31. Fourniol, F. J., et al. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).
  32. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).
  33. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  34. VanDelinder, V., Brener, S., Bachand, G. D. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).
  35. Roth, S., Gârlea, I. C., Vleugel, M., Mulder, B. M., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in cell-like confinement. bioRxiv. , (2019).
  36. Xu, Z., et al. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).
  37. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  38. Velve-Casquillas, G., Costa, J., Carlier-Grynkorn, F., Mayeux, A., Tran, P. T. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).
  39. Portran, D., Schaedel, L., Xu, Z., Théry, M., Nachury, M. V. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).
  40. Huang, Y. M., Uppalapati, M., Hancock, W. O., Jackson, T. N. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).
  41. Uppalapati, M., Huang, Y., Shastry, S., Jackson, T. N., Hancock, W. O. Microtubule Motors in Microfluidics. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).
  42. Sung, J. H., Shuler, M. L. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).
  43. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  44. Nakayama, T., et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).
  45. Park, S., Cho, H., Kim, J., Han, K. -H. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).
  46. Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  47. Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  48. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  49. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  50. Bartlett, N. W., Wood, R. J. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).
  51. Yang, C. P. H., Horwitz, S. B. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).
  52. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).
  53. VanBuren, V., Cassimeris, L., Odde, D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).
  54. Dye, R. B., Fink, S. P., Williams, R. C. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).
  55. Drechsel, D. N., Kirschnert, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).
  56. Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O., Vidali, L., Tüzel, E. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).
  57. Mickey, B., Howard, J. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).
  58. Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).
  59. Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).
  60. Felgner, H., Frank, R., Schliwa, M. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).
  61. Felgner, H., et al. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).
  62. Nishida, K., et al. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).
  63. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  64. Brouhard, G. J., Rice, L. M. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).
  65. Lawrence, E. J., Chatterjee, S., Zanic, M. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).
  66. Howard, J., Hyman, A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).
  67. Mehidi, A., Aumeier, C. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).
  68. Verhey, K. J., Ohi, R. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).
  69. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).
  70. Théry, M., Blanchoin, L. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceMicrotubule MechanicsPDMS MicrofluidicsMicrotubule PolymerHigh Throughput AssayPlasma CleaningPhotoresist DepositionComputational ModelingFlow Control SystemFluorescent Labeling

Related Articles