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Artigo de método

In vivo Aplicação da rotulagem de proximidade baseada em TurboID em Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/68193

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13 de junho de 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, estabelecemos um protocolo detalhado para marcação de proximidade (PL) baseada em TurboID no ovário de D. melanogaster , abrangendo etapas desde a suplementação de biotina e dissecção do ovário até a validação da expressão transgênica e enriquecimento de peptídeos biotinilados para espectrometria de massa.

Resumo

A marcação por proximidade (PL) é um método poderoso para mapear redes de interação proteína-proteína. Os avanços na marcação de enzimas, especialmente o TurboID, ampliaram seu uso em sistemas biológicos. O TurboID é particularmente vantajoso para aplicações in vivo devido à sua robustez, não toxicidade e facilidade de uso. Esta enzima biotinila promiscuamente biomoléculas próximas, incluindo proteínas e ácidos nucléicos, dentro de uma faixa de aproximadamente 10 nm na presença de biotina. Aplicamos este método para investigar o interactoma da abobrinha (Zuc), um fator chave na biogênese do RNA de interação com piwi (piRNA) na membrana mitocondrial externa (OMM) em células germinativas do ovário de Drosophila melanogaster . Expressando Zuc-TurboID em células germinativas e suplementando com biotina, induzimos a biotinilação de proteínas Zuc-proximais. A análise de espectrometria de massa após o enriquecimento de peptídeos biotinilados identificou proteínas próximas a Zuc, incluindo interagentes bem conhecidos na biogênese de piRNA. Curiosamente, descobrimos novos interagentes de Zuc envolvidos no dobramento de proteínas, organização de membranas e tráfego de vesículas.

Introdução

Os métodos convencionais de mapeamento de interação proteína-proteína (PPI), como espectrometria de massa de purificação de afinidade (AP-MS) e sistemas híbridos de levedura-2 (Y2H), muitas vezes não conseguem capturar proteínas de baixa abundância, expressas transitoriamente ou ligadas à membrana. Essa limitação decorre de sua incapacidade de replicar as condições fisiológicas nativas de uma célula viva 1,2,3. Para superar esses desafios, o PL surgiu como uma técnica poderosa para mapeamento de proteoma de alta resolução em um nível de sub-organela in vivo. O PL aproveita a fusão de uma enzima promíscua com a proteína isca, permitindo que a enzima catalise a formação de moléculas reativas de vida curta1. Essas moléculas reativas, como a biotina, marcam proteínas covalentemente dentro de alguns nanômetros da proteínade fusão 4. Posteriormente, as proteínas biotiniladas são isoladas e analisadas por espectrometria de massa para facilitar a identificação de proteínas em larga escala 5,6.

Nos últimos anos, várias enzimas promíscuas foram desenvolvidas para avançar as técnicas de PL. Duas enzimas amplamente utilizadas são a biotina ligase mutante R118G derivada de Escherichia coli (BioID) e a enzima 2 da ascorbato peroxidase derivada de ervilha (APEX2). O BioID converte biotina e ATP em biotinil-5'-adenilato (bioAMP)1. Esta molécula reativa liga-se covalentemente a resíduos de lisina de proteínas próximas dentro de ± raio de 10 nm. Uma das principais vantagens do PL baseado em BioID é o uso de biotina. É uma biomolécula natural e não tóxica em organismos vivos, o que permite a marcação in vivo segura6. No entanto, o BioID tem limitações, incluindo cinética de marcação lenta (18-24 h) e a necessidade de alta temperatura (37 °C) para atividade catalítica ideal4. Essas características podem dificultar sua aplicação no estudo de processos biológicos dinâmicos. Enquanto isso, o APEX2 catalisa a formação de radicais biotina-fenoxila na presença de biotina-fenol e peróxido de hidrogênio (H2O2)7. Esses radicais reagem principalmente com a cadeia lateral de aminoácidos ricos em elétrons, como a tirosina, e também podem se ligar à cisteína, histidina e triptofano8. A capacidade de marcação rápida da enzima peroxidase (< 1 min) é adequada para capturar IBPs dinâmicos e transitórios9. Além disso, possui uma faixa de detecção mais ampla (até 20 nm) do que a biotina ligase. No entanto, o PL baseado em APEX2 tem suas desvantagens, incluindo a necessidade de um agente oxidante tóxico, H2O2, e a baixa permeabilidade da biotina-fenol, que limitam a aplicabilidade in vivo10.

Em 2018, Branon et al. desenvolveram uma nova biotina ligase chamada TurboID, uma versão mutante de 35 kD de BirA (a biotina ligase encontrada em E. coli)4. Esta enzima incorpora uma mutação na posição R118 (R118S) junto com 15 outras mutações relativas a BirA. Ele exibe atividade catalítica duas vezes maior do que o BioID. A biotinilação induzida por TurboID em 10 min produz dados proteômicos com tamanho e especificidade comparáveis a 18 h de marcação por BioID. Além disso, demonstra excelente atividade de rotulagem a 30 °C4. Portanto, o TurboID é mais adequado para aplicação em organismos como Drosophila ou Caenorhabditis elegans, que são comumente criados a 25 °C e 20 °C, respectivamente.

Neste estudo, pretendemos utilizar PL baseado em TurboID para estudo de interactoma no ovário de Drosophila. Os protocolos descritos aqui são empregados para mapear o interactoma de Zuc em células germinativas. Zuc é uma endonuclease localizada na membrana mitocondrial externa (OMM), que medeia a biogênese de piRNAs, pequenos RNAs não codificantes críticos para a manutenção da integridade do genoma 11,12,13. Ao comparar proteínas biotiniladas identificadas na análise Zuc-TurboID com as de dois controles adicionais, NES-TurboID e Tom20-TurboID, definimos candidatos distintos que interagem com Zuc.

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Protocolo

1. PL em mosca adulta

  1. Preparação de alimentos com biotina
    1. Preparar a solução de NaOH 1 M diluindo o stock de NaOH 10 M em água tripla destilada (TDW). Armazene-o em temperatura ambiente (RT). Prepare a solução estoque de biotina 1 M dissolvendo 0,0049 g de pó de biotina em 20 mL de TDW. Adicione 150-200 μL de NaOH 1 M para aumentar a solubilidade da biotina. Vórtice para homogeneizar a solução. Conservar a solução-mãe de biotina a 4 °C.
    2. Retire a comida para moscas do frasco e leve ao microondas por 2 minutos até derreter.
      NOTA: O alimento padrão para moscas contém 5% de fubá, 3% de fermento, 10% de sacarose, 1% de ágar, 0,3% de ácido propiônico e 0,3% de metil 4-hidroxibenzoato13.
    3. Adicione o estoque de biotina ao alimento derretido com uma concentração final de 100 μM e, em seguida, misture por vórtice. Dispense imediatamente 4,5 mL de alimentos suplementados com biotina em cada frasco vazio usando uma pipeta sorológica. Deixe os alimentos esfriarem por 30 min, coloque uma tampa de algodão no frasco e armazene os alimentos com biotina a 4 °C.
      NOTA: A biotina deve ser adicionada antes que os alimentos esfriem e endureçam.
  2. Alimentação com biotina
    1. Cruze as moscas transgênicas que superexpressam a proteína de fusão TurboID com moscas GAL4 específicas do tecido ou da célula 14,15,16. Como controle negativo, moscas cruzadas do tipo selvagem com moscas do driver GAL4 para garantir que não haja indução de biotinilação.
    2. Cerca de 10 dias após o cruzamento, as progênies começarão a eclodir. Dissolva o fermento seco em pó em TDW e mexa até formar uma pasta lisa. Aplique uma colher de pasta de fermento na parede de um novo frasco. Bata suavemente no frasco antigo contendo moscas recém-nascidas para coletar as moscas no fundo. Inverta o frasco antigo no novo frasco contendo pasta de fermento, certificando-se de que as bordas de ambos os frascos estejam alinhadas para evitar que as moscas escapem.
    3. Bata nesses frascos juntos para transferir moscas do frasco antigo para a parte inferior do novo frasco. Depois que as moscas forem transferidas, coloque com segurança as tampas de algodão de volta nos frascos novos e antigos. Aguarde 3 dias. A pasta de levedura pode ser armazenada na RT por alguns dias.
      NOTA: A transferência de moscas precisa ser feita o mais rápido possível, porque as moscas só serão atordoadas temporariamente.
    4. Prepare a solução de ácido propiônico a 0,5% diluindo 250 μL de estoque de ácido propiônico em 50 mL de TDW. Armazene-o no RT.
    5. No3º dia, prepare a solução de trabalho de biotina 100 μM diluindo o estoque de biotina 1 M em TDW e, em seguida, adicione 500 μL de ácido propiônico a 0,5%. Misture a solução de trabalho de biotina com fermento seco em pó e mexa até formar uma pasta. Adicione uma colher de laboratório de pasta de biotina-levedura na parede do frasco de biotina para alimentos. A pasta de biotina-levedura pode ser armazenada em RT por alguns dias.
    6. Divida as moscas em dois grupos. Mantenha um grupo no frasco de alimento normal como controle e transfira o outro grupo para o frasco de alimento de biotina (pasta de biotina-levedura adicionada) para iniciar a biotinilação. Após 16 h de biotinilação, transfira as moscas para um novo frasco de alimento normal.
      NOTA: Anteriormente, realizamos um teste de alimentação com biotina por 4 h, 8 h e 16 h. O sinal de biotinilação foi mais forte após 16 h de alimentação, então escolhemos esse ponto de tempo para experimentos subsequentes.
  3. Coleção de ovário de Drosophila
    1. Coloque as moscas na almofada de mosca CO2 , mantenha as fêmeas e descarte os machos. Depois que as moscas estiverem devidamente anestesiadas (não se movendo mais), pipete 1 mL de meio de inseto frio de Grace na placa de dissecação.
    2. Leve uma mosca para a placa de dissecação usando uma pinça de ponta fina e deixe-a submergir no meio. Segure o tórax da mosca com uma pinça, tome cuidado para não esmagar o corpo. Em seguida, use outra pinça para remover suavemente a ponta do abdômen posterior (onde a parte da genitália está localizada).
    3. Use o fórceps para espremer lentamente os ovários (começando da parte superior do abdômen até a parte inferior).
    4. Quando estiverem fora, remova as redes musculares e outros tecidos que circundam os ovários. Tenha cuidado para não danificar os ovários.
    5. Transfira cuidadosamente os ovários limpos para um tubo de 1,7 mL usando uma pinça; Mantenha o tubo no gelo. Repita as etapas 1.3.2 - 1.3.4 para as próximas moscas.
    6. Gire o tubo a 3.500 x g por 30 s a 4 ° C e, em seguida, use pontas de micropipeta para remover o meio restante. Tenha cuidado para não tocar nos ovários.
    7. Congele o tubo com nitrogênio líquido e armazene os ovários a -80 °C. As amostras de ovário são estáveis por 1 ano.

2. Expressão de transgene e detecção de proteína biotinilada por ensaio de Western blot

NOTA: Para o ensaio de western blot, colete cerca de cinco pares de ovários por amostra.

  1. Lise tecidual
    1. Descongele o tecido do ovário congelado. Adicione 50 μL de tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X-100), suplementado com 1x coquetel de inibidor de protease (PI) e 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF). Armazene o tampão de lise RIPA (sem 1x coquetel PI e 1 mM PMSF) a 4 °C.
      NOTA: O coquetel PI e o PMSF só devem ser adicionados logo antes do experimento.
    2. Interrompa os ovários usando um homogeneizador portátil acoplado a um pilão de plástico (1 min por tubo). Um processo de lise tecidual em gelo por 10 min é necessário para garantir a lise completa, seguido de homogeneização.
    3. Centrifugue a 13.500 x g por 10 min a 4 ° C para separar o lisado de proteínas dos detritos.
    4. Pipete o lisado de proteína transparente para um novo tubo de 1,7 ml (evite retirar a camada lipídica por cima) e, em seguida, armazene o lisado a -20 °C até a nova utilização.
  2. Medição da concentração de proteína por ensaio de ácido bicinconínico (BCA)
    1. Prepare o reagente de trabalho (WR) do ácido bicinchonínico (BCA) misturando o reagente A e o reagente B na proporção de 50:1. Misture 1 μL de lisado ou padrão BSA diluído com 200 μL de WR em uma placa de 96 poços (em duplicatas) e, em seguida, incube a placa a 37 ° C por 30 min.
      1. Calcule quanto WR é necessário usando esta fórmula:
        (# padrões + # amostras) × (# réplicas) × (volume WR por amostra)
        Para fazer um conjunto de padrões proteicos, prepare várias diluições de 2 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) em tampão de lise RIPA (sem coquetel PI e PMSF) com concentrações finais de 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 e 2000 μg/mL.
    2. Meça a absorbância usando um leitor de microplacas no comprimento de onda de 495 nm. Gere uma curva padrão a partir dos valores de absorbância da BSA e, em seguida, determine a concentração de proteína.
  3. Ensaio de Western blot
    1. Eletroforese em gel
      1. Adicione 30-50 μg de lisado de proteína ao tampão de carga 2x SDS. Adicione TDW (se necessário) para fazer uma concentração final de proteína de 2 μg/μL e uma concentração final de 1x SDS e, em seguida, ferva a amostra a 95 °C por 10 min.
      2. Prepare o buffer de corrida misturando 25 mL de buffer 20x MOPS com 500 mL de TDW para fazer uma concentração de 1x de buffer de corrida. Armazene-o no RT.
      3. Enxágue os poços do gel Bis-Tris com 1 mL de tampão corrido (3x) e, em seguida, coloque o gel Bis-Tris na câmara de eletroforese. Encha a parte frontal da câmara com o novo tampão de corrida até que todos os poços estejam submersos (± 250 mL). Encha a parte de trás da câmara com o buffer de corrida usado (metade do volume do novo buffer de corrida usado é suficiente).
      4. Carregue a amostra no gel Bis-Tris e use 4 μL de escada de proteína prestada como marcador. Realize eletroforese (200 V, 30 min). Retire o gel da e enxágue com TDW.
    2. Blotting de membrana
      1. Faça o tampão de transferência adicionando 20 mL de tampão de transferência (25x estoque) e 50 mL de metanol em 430 mL de TDW.
      2. Organize um sanduíche composto por absorventes mata-borrão, papel de filtro, gel e membrana de nitrocelulose em um módulo de borrão. Antes de empilhar uma nova camada, use um rolo para remover as bolhas.
      3. Instale o módulo de blot na câmara de transferência e, em seguida, encha a câmara com 500 mL de tampão de transferência. Transfira proteínas por 1 h a 175 mA.
        NOTA: O tampão de transferência deve ser preparado antes do experimento.
    3. Bloqueio
      1. Adicione 5 mL de estoque Tween20 em 45 mL de TDW para fazer 10% de solução estoque Tween20. Dissolva dois comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em 400 mL de TDW. Remova 4 mL de solução e, em seguida, adicione 4 mL de Tween20 a 10% (concentração final de 0,1%) para fazer 1x solução de PBST. Armazene-o no RT.
      2. Remova a membrana borrada da câmara de transferência e enxágue com 1x PBST.
        NOTA: Se a membrana precisar ser incubada com anticorpos diferentes, corte-a com uma lâmina de aço inoxidável limpa de acordo com os tamanhos de proteína esperados antes de realizar a etapa de bloqueio.
      3. Para verificar as expressões gênicas, use 2% de BSA em 1x PBST para a etapa de bloqueio (1 h, RT). Faça uma solução de 2% de BSA adicionando 1 g de BSA em 50 mL de 1x PBST. Para detecções de proteínas biotiniladas, execute o bloqueio usando 3% de BSA em 1x PBST (durante a noite, 4 ° C). Dissolva 1,5 g de pó de BSA em 50 mL de 1x PBST para fazer uma solução de BSA a 3%. Armazenar soluções de bloqueio a 4 °C.
        NOTA: O BSA usado é diferente daquele usado no ensaio BCA. O ensaio BSA para BCA faz parte do kit BCA.
    4. Incubação primária de anticorpos
      1. Dilua 1 μL de α-V5 em 10 mL de BSA a 2% (1: 10.000) e 10 μL do gene de limpeza α-HSP90 em BSA a 2% (1: 1.000). Adicione 2,7 μL de conjugado estreptavidina-rábano peroxidase (SA-HRP) em 9 mL de solução 1x PBST para fazer 0,3 μg/mL DE SOLUÇÃO SA-HRP.
      2. Para verificar as expressões gênicas, incubar a membrana com anticorpo primário durante a noite a 4 °C. Para detecções de proteínas biotiniladas, incubar a membrana por 1 h a 4 °C. Armazene o anticorpo primário novamente a 4 °C. Pode ser usado várias vezes.
      3. Lave a membrana com 1x PBST por 3x em RT por 15 min cada.
    5. Incubação secundária de anticorpos
      1. Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando 2 μL de IgG anti-coelho ou anti-camundongo de cabra (peroxidase de rábano (HRP) conjugada) em 10 mL de BSA a 2% (1: 5.000).
        NOTA: Para SA-HRP, um anticorpo secundário não é necessário. Prossiga diretamente para a etapa de visualização. Os anticorpos secundários devem ser diluídos de novo antes da experiência.
      2. Incubar a membrana em solução de anticorpo secundário por 40 min em RT. Lave a membrana com 1x PBST por 3x em RT por 15 min cada.
    6. Detecção de proteínas com método de quimioluminescência aprimorada (ECL)
      1. Misture 750 μL de luminol e 750 μL de solução HRP (proporção 1:1). Mantenha a membrana úmida no tampão de lavagem enquanto prepara a mistura.
        NOTA: Esta mistura deve ser preparada na hora antes do experimento. Como os produtos químicos são sensíveis à luz, mantenha-os longe da luz solar ou de outras fontes de luz intensa (a exposição de curto prazo à iluminação do laboratório é boa).
      2. Mergulhe a membrana na solução por 30 s e coloque-a entre folhas de plástico transparentes. Observe as bandas de proteínas borradas com um instrumento Chemidoc.

3. Validação da expressão e localização do transgene por coloração por imunofluorescência

NOTA: Para verificar a expressão e localização do gene, disseque cerca de cinco pares de ovários por amostra de fêmeas de 2 dias alimentadas com pasta de levedura. Os ovários jovens contêm predominantemente estágios iniciais de câmaras de ovos, que são ideais para coloração de imunofluorescência devido à abundância de células enfermeiras (células germinativas) e suas membranas relativamente permeáveis17. Os estágios finais das câmaras de ovos são mais rígidos e difíceis de penetrar devido à formação do complexo da casca do ovo, que começa no estágio 918. Para o teste de biotinilação de proteínas, dissecar cerca de cinco pares de ovários por amostra de fêmeas de 4 dias alimentadas com biotina, conforme descrito na etapa 1.2.

  1. Preparação da amostra
    1. Segure a parte posterior de um ovário dissecado no lugar usando uma pinça. Use outra pinça para separar suavemente o ovário em câmaras de ovos individuais. Trabalhe com cuidado para evitar a ruptura das câmaras de ovos. O protocolo de isolamento da câmara de ovos foi descrito em detalhes em19. Pipete cuidadosamente as câmaras de ovos em um tubo de 1,7 mL e lave com 1 mL de 1x PBS (RT). Corte a borda das pontas da pipeta antes de pipetar para evitar que as câmaras de ovos fiquem presas nas pontas.
      NOTA: Use apenas câmaras de ovos no estágio ≤ 9 (transparentes). Descarte oócitos maduros e câmaras de ovos em estágio avançado ≥ 10. A pipetagem fará com que as câmaras de ovos flutuem na solução. Portanto, deixe as câmaras de ovos assentarem no fundo (por 5 min) antes de prosseguir para as próximas etapas.
  2. Fixação
    1. Dilua 3,125 mL de estoque de formaldeído (FA) a 16% em 6,875 mL de 1x PBS para fazer uma solução de FA a 5%. Armazene-o no RT.
      NOTA: FA é sensível à luz, portanto, mantenha-o longe da luz.
    2. Pipete 1 mL de formaldeído a 5% (FA) no tubo que contém oócitos. Coloque o tubo no multi-rotador e fixe os oócitos por 30 min.
      NOTA: Desde a fixação até a etapa de coloração nuclear, os experimentos são realizados em um multi-rotador com rotação suave.
    3. Prepare 0,5% de Triton X-100 em 1x PBS (1x PBT) como solução de lavagem, adicionando 10 mL de estoque de 10% de Triton X-100 em 190 mL de 1x PBS. Armazene-o no RT.
    4. Enxágue as câmaras de ovos fixas 1x, seguida de lavagem 3x em RT por 10 min. Use 1 mL de 1x PBT para as etapas de enxágue e lavagem.
  3. Bloqueio
    1. Prepare 5% de soro fetal bovino (FBS) adicionando 250 μL de estoque de FBS em 4,75 mL de 1x PBT.
      NOTA: Esta solução deve ser feita na hora antes do experimento.
    2. Adicione 1 mL de FBS a 5% no tubo e execute a etapa de bloqueio por 1 h em RT. Enxágue os oócitos 1x.
  4. Incubação primária de anticorpos
    1. Para verificar a expressão e localização do transgene, diluir 2 μL de α-V5 e 2 μL de α-ATP5A ou α-Tom20 (como marcador mitocondrial) em 400 μL de 1x PBT (proporção de 1:200).
      NOTA: Embora dois anticorpos possam ser usados juntos para corar uma amostra, seus hospedeiros precisam ser diferentes. É para evitar a ligação sobreposta de anticorpos secundários subsequentes.
    2. Incubar as câmaras de ovos com 400 μL de solução diluída de anticorpos primários (durante a noite, 4 °C).
      NOTA: Semelhante ao ensaio de Western blot, os anticorpos primários podem ser usados várias vezes para imunocoloração. Antes de armazenar uma solução de anticorpos de volta, certifique-se de que ela não contenha câmaras de ovos.
    3. Enxágue as câmaras de ovos 1x, seguida de lavagem 3x em RT por 10 min.
  5. Incubação secundária de anticorpos
    1. Diluir 2 μL de cabra α-Rb IgG Alexa Fluor 488 e 2 μL de cabra α-M IgG Alexa Fluor 594 em 400 μL de 1x PBT (proporção de 1:200). Incubar câmaras de ovos com 400 μL de solução de anticorpo secundário diluído por 2 h em RT. Para detecção de biotinilação, adicione 2 μL de Alexa Fluor 594 conjugado com estreptavidina a 1x PBT (proporção de 1:200) e incube junto com um anticorpo secundário.
      NOTA: A partir desta etapa, proteja a amostra da luz. Os anticorpos secundários devem ser diluídos de novo antes da experiência. Vários anticorpos secundários podem ser usados juntos, mas cada anticorpo primário deve ser atribuído a diferentes fluoróforos que se originaram de diferentes hospedeiros também para evitar sinais sobrepostos. Por exemplo, 488 Goat α-Rb se ligará ao coelho α-V5. Quanto ao α-ATP5A de camundongo, 594 Goat α-M é usado como seu anticorpo secundário complementar. No caso da detecção de biotinilação, deve ser omitida a utilização de outros corantes com o mesmo comprimento de onda que o conjugado de estreptavidina.
    2. Enxágue as câmaras de ovos 1x, seguida de lavagem 3x em RT por 10 min.
  6. Coloração nuclear
    1. Diluir 1 μL de DAPI em 1 mL de 1x PBS (proporção de 1:1.000). Incubar câmaras de ovos com 1 mL de solução DAPI diluída por 5 min em RT.
      NOTA: O DAPI deve ser diluído recentemente antes do experimento.
    2. Enxágue as câmaras de ovos 1x, seguida de lavagem 3x em RT por 10 min.
      NOTA: As câmaras de ovos podem ser armazenadas em 1x solução PBS a 4 °C por algumas horas antes da montagem, mas é recomendável proceder o mais rápido possível.
  7. Montagem deslizante
    1. Limpe a lâmina de vidro com um lenço de papel sem fiapos e anote as informações da amostra nela. Remova 1x PBS do tubo, mas deixe uma pequena quantidade para evitar o ressecamento.
    2. Corte a borda das pontas da micropipeta e, em seguida, pipete cuidadosamente as câmaras de ovos na lâmina de vidro. Use uma pinça para distribuir cuidadosamente as câmaras de ovos na lâmina de vidro e evitar grumos. Observe as lâminas ao microscópio (a ampliação de 2x é suficiente) para garantir que as câmaras de ovos sejam distribuídas igualmente.
    3. Remova o PBS restante da lâmina de vidro usando uma micropipeta. Pipete 15-30 μL de solução antidesbotamento (sensível à luz) na lâmina de vidro e certifique-se de que ela entre em contato com todas as câmaras de ovos.
    4. Use uma pinça para segurar a borda da tampa deslizante e, em seguida, coloque-a em cima da lâmina de vidro (começando de uma borda à outra) de modo que cubra as câmaras de ovos. Faça isso lentamente para evitar bolhas. Seque o excesso de solução com um lenço de papel sem fiapos e, em seguida, sele as bordas da lamínula com esmalte. Deixe o esmalte secar bem (± 5 min).
    5. Visualize as lâminas com um microscópio confocal. Armazene as lâminas a -20 °C.

4. Enriquecimento de peptídeos biotinilados para análise de espectrometria de massa

NOTA: Cerca de 3 mg de proteínas são necessárias para a amostra de espectrometria de massa. Portanto, disseque cerca de 100 pares de ovários para obter essa quantidade.

  1. Lise tecidual
    1. Descongele o tecido do ovário congelado. Enquanto isso, prepare 1x solução salina tamponada com Tris (TBS) dissolvendo 1 comprimido de TBS em 500 mL de TDW. Armazene-o em RT. Prepare 2% de SDS em 1x TBS como tampão de lise, diluindo 4 mL de estoque de SDS a 10% em 16 mL de 1x TBS. Armazene-o em RT.
    2. Adicione 500 μL de SDS a 2% em 1x TBS (suplementado com 1x coquetel PI) no tubo contendo ovários. Aguarde alguns minutos até que as células sejam lisadas e a solução fique pegajosa.
    3. Pipeta lisada para militubo de 1 mL contendo fibra de acústica focalizada adaptativa (AFA). Corte as pontas da pipeta antes de usar. Para garantir uma sonicação eficiente, transfira no máximo 500 μL de lisado por tubo.
    4. Realize a sonicação com as seguintes condições: potência incidente de pico 75 W, fator de trabalho 10%, ciclos por rajada 200, tempo 180 s, temperatura 6 °C.
      NOTA: Se uma amostra precisar ser submetida a sonicação várias vezes, configure alguns intervalos entre elas para evitar a geração de excesso de calor.
  2. Precipitação de acetona
    1. Mova o lisado para um tubo de baixa ligação de 5 mL e, em seguida, adicione acetona fria no tubo a 6x do volume da amostra. Por exemplo, adicione 3 mL de acetona a 500 μL de lisado.
      NOTA: A acetona deve ser pré-resfriada a -20 °C antes do uso.
    2. Tubo de vórtice, carregue-o em multi-rotador e incube durante a noite (± 16 h) a -20 °C.
      NOTA: Este é um ponto de parada, o que significa que o experimento pode ser pausado momentaneamente após esta etapa.
    3. Proteínas precipitadas pelo pellet a 15.000 x g por 15 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e centrifugar o tubo a 4 °C.
    4. Adicione 2 mL de uma solução de mistura composta por 90% de acetona fria e 10% de 1x TBS. Pipete em um movimento para cima e para baixo para misturar o pellet e a solução. Corte as pontas da pipeta antes de usar.
    5. Tubo de vórtice, em seguida, carregue-o no multi-rotador e incube por 2 h a -20 °C.
    6. Proteínas do pellet a 15.000 x g por 15 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e fazer girar o tubo a 4 °C. Abra o tubo e seque o pellet ao ar por 10 min.
      NOTA: Não seque demais o pellet, pois será difícil ressuspendê-lo mais tarde.
    7. Preparar a solução-mãe de bicarbonato de amónio (ABC) a 500 mM dissolvendo 0,7906 g ABC em 20 ml de TDW. Faça uma solução de trabalho ABC 50 mM diluindo 3 mL de solução estoque ABC 500 mM em 27 mL de TDW.
    8. Prepare a solução de ureia 8 M adicionando 0,4805 g de ureia em 1 mL de 50 mM ABC.
      NOTA: A solução de ureia deve ser preparada recentemente antes do experimento.
    9. Ressuspenda o pellet de proteína em 500 μL de ureia 8 M. O volume de ureia 8 M pode ser reduzido para aumentar a concentração de proteína.
    10. Transfira a proteína ressuspensa para um militubo de 1 mL contendo fibra AFA e, em seguida, execute a sonicação com as mesmas condições descritas na etapa 4.1.4.
    11. Realize o ensaio de BCA para determinar a concentração de proteínas. Esta etapa é um ponto de parada. Conservar a amostra de proteínas a 4 °C até nova utilização.
  3. Digestão de tripsina
    1. Misture 3 mg de proteínas com TDW (se necessário) em um tubo de baixa ligação de 5 mL para perfazer um total de 500 μL de solução.
    2. Desnaturar proteínas usando termobloco a 450 rpm por 1 h a 37 ° C.
    3. Adicione 5 μL de 1 M DTT (dissolvido em TDW) no tubo para fazer uma concentração final de 10 mM DTT e, em seguida, reduza as proteínas usando um termobloco a 450 rpm por 1 h a 37 ° C.
    4. Prepare 400 mM de iodoacetamida dissolvendo 0,0111 g de iodoacetamida em 150 μL de ABC. Adicionar 55 μL de iodoacetamida a 400 mM no tubo (concentração final de 40 mM) e, em seguida, alquilar as proteínas utilizando termobloco a 450 rpm durante 1 h a 37 °C.
      NOTA: A iodoacetamida é sensível à luz e todas as soluções de iodoacetamida devem ser preparadas antes do experimento.
    5. Diluir a amostra adicionando 50 mM de solução ABC até que o volume total atinja 4 ml. Após a diluição, a concentração de ureia na solução é de cerca de 1 M.
    6. Faça uma solução estoque de CaCl2 1 M dissolvendo 1,1098 g de CaCl2 em 10 mL de TDW. Adicione 4 μL de estoque de CaCl1 M 2 no tubo para fazer uma concentração final de 1 mM e, em seguida, pipete para cima e para baixo para homogeneizar a solução.
    7. Prepare uma solução estoque de tripsina de 1 mg / mL adicionando 0,001 g de tripsina a 1 mL de ABC. Adicione 150 μL de tripsina ao tubo (tripsina: amostra = proporção 1:20). Digerir a proteína utilizando termobloco a 450 rpm durante 16 h a 37 °C.
      NOTA: A tripsina deve ser dissolvida antes do experimento. Esta etapa é um ponto de parada. Conservar os péptidos digeridos a 4 °C até nova utilização.
  4. Enriquecimento de peptídeos biotinilados
    NOTA: Os tampões de lavagem e eluição devem ser preparados antes do experimento.
    1. Prepare 2 M de ureia em 1x solução TBS adicionando 1,2012 g de ureia em 10 mL de 1x TBS.
    2. Use 150 μL de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina por amostra de 3 mg. Lave as esferas de estreptavidina com 1 mL de ureia 2 M em 1x TBS. Repita esta etapa 4x. Após cada lavagem, coloque o tubo em um rack magnético por 1 min e, em seguida, descarte o tampão de lavagem.
      NOTA: Os grânulos magnéticos de estreptavidina de perfuração são recomendados, pois minimizam os sinais de fundo semelhantes aos PEG nos resultados de espectrometria de massa.
    3. Pipete 1 mL de peptídeos digeridos no tubo contendo esferas, misture delicadamente e, em seguida, combine a mistura com a amostra restante em um tubo de baixa ligação de 5 mL. Coloque o tubo em um multi-rotador e incube por 1 h em RT.
    4. Transfira 1 mL da mistura para um tubo de 1,5 mL e coloque-o no rack magnético por 1 min. Descarte o sobrenadante. Repita esta etapa até que todas as contas sejam coletadas.
    5. Prepare 2 M de ureia em 50 mM ABC dissolvendo 0,7207 g de ureia em 6 mL de 50 mM ABC. Lave os grânulos com 1 mL de ureia 2 M em 50 mM 2x e com 1 mL de TDW uma vez. Após cada lavagem, coloque o tubo em um rack magnético por 1 min e, em seguida, descarte o tampão de lavagem.
    6. Prepare a solução estoque de ácido fórmico a 10% dissolvendo 1 mL de ácido fórmico em 9 mL de TDW. Preparar o tampão de eluição constituído por 80% de acetonitrilo e 0,1% de ácido fórmico em TDW. Por exemplo, misture 1,2 mL de acetonitrila, 15 μL de estoque de ácido fórmico a 10% e 285 μL de TDW para fazer 1,5 mL de tampão de eluição.
      CUIDADO: A acetonitrila e o ácido fórmico são prejudiciais devido às suas propriedades voláteis, portanto, use uma máscara e tenha cuidado ao manuseá-los.
    7. Pipetar 100 μL de tampão de eluição para o tubo, homogeneizar suavemente e, em seguida, eluir os peptídeos usando um termobloco a 300 rpm por 5 min a 60 °C. Após a eluição, coloque o tubo em um rack magnético e transfira o eluído para um novo tubo de 1,5 mL. Evite tirar contas ao transferir o eluído. Repita esta etapa 5x.
    8. Coloque o tubo contendo 500 μL de eluído em um rack magnético por 5 min e, em seguida, transfira-o para um novo tubo de 1,5 mL para garantir a remoção completa dos grânulos. As amostras eluídas podem então ser secas e usadas para análise de espectrometria de massa.
    9. Para obter informações adicionais sobre a análise de LC-MS/MS de amostras de peptídeos enriquecidos e processamento de dados de MS, consulte Nguyen et al.20.

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Resultados

Os exemplos de resultados são representados na Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 foram publicados anteriormente por Nguyen et al.20. A Figura 1 ilustra o procedimento experimental de PL baseado em TurboID no ovário de Drosophila. Primeiro, foi gerada uma construção combinando Zuc e TurboID (Zuc-V5-TurboI...

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Discussão

Aqui, fornecemos um procedimento abrangente para rotulagem de proximidade (PL) baseada em TurboID no ovário de Drosophila , desenvolvido por meio de extensa solução de problemas para superar vários desafios. Uma questão-chave envolveu construções genéticas, pois diferentes layouts de fusão afetaram significativamente a expressão de proteínas e a eficiência da biotinilação. Por exemplo, o NES-V5-TurboID exibiu expressão e biotinilação mais fracas em comparação com outros transgen...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório por suas discussões e ajuda. Este trabalho foi apoiado pela National Research Foundation (NRF) financiada pelo governo coreano (MSIT) (RS-2024-00345327 para M.L.; RS-2023-00219563 para M.L.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpos
Cabra anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra, HRPInvitrogen31430Grau analítico,
anticorpo secundário anti-coelho de cabra sensível à luz (H+L) altamente adsorvido de forma cruzada, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra (H+L) de grau analítico, sensível à luz, HRPInvitrogen31460Grau analítico,
anticorpo HSP90 sensível à luz (coelho)Tecnologia de sinalização celular4874Anticorpo policlonal
Pierce Proteína estreptavidina, HRPThermo Fisher Scientific21126Grau analítico
Estreptavidina, Alexa Fluor 594 conjugadoInvitrogenS11227Sensível à luz, grau analítico
Anticorpo V5-tag (camundongo)InvitrogenR960-25Anticorpo monoclonal
V5-tag (coelho) (D3H8Q)Tecnologia de sinalização celular13202Anticorpo monoclonal
Fly LinesCompany<strong>Número de catálogoComentários/Descrição
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Estoque
moscas pUASp Abobrinha V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Estoque de moscas
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Estoque de moscas
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Estoque de
moscasEquipamentos e consumíveisCompanyNúmero de catálogo<strong>Comentários/Descrição
Balança AnalíticaMettler ToledoME2040,1 mg de resolução
Membranas de Western Blotting de Nitrocelulose Amersham Protran 0.45 NC (300 mm & vezes; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-175-CCo-polímero
MARCA  Vidro de Cobertura (22 mm x 22 mm)deVidro BorosilicatoSigma-Aldrich
(10 µ L)Vertex4110N00
Pontas de Pipeta a Granel de Propileno (1000 µ L)PontasGranel de PropilenoVertex 4330N00
(200 µ L)Vertex4230N00
Placa de cultura de células de propileno (96 poços)SPL300096poliestireno, centrífuga tipo fundo plano
(com rotor de 1,5-2 mL do tamanho de um tubo)Eppendorf5424 RCentrífuga refrigerada de ângulo fixo
(com rotor de 5 mL do tamanho de um tubo)Eppendorf5425 RColher química refrigerada de ângulo fixo
-- Sistema de imagem
ChemiDocimagem de Western blotBiorad12003153
CO2 fly pad--Placa anestésica
CO2 tanque & regulador-Cuidado de gás de alta pressão & tontura
Incubadora compactaJSRJSGI-10TCuidado de alta
Microscópio de varredura a laser confocalde temperatura ZeissLSM 710Cuidado com feixe de laser intenso
Tubo cônico (15 mL)SPL50015Polipropileno /Polietileno de alta densidade 
Tubo cônico (50 mL)SPL50050Polipropileno /Polietileno de alta densidade 
Balança digital---
Temporizador digital---
Prato de dissecação--
Pinça de #5SF de silicone Dumont Ferramentas de Ciência Fina11252-00Pontas super finas, cuidado com objeto pontiagudo
Ímã DynaMag-2Invitrogen12321DPara tubos de microcentrífuga de 1,5-2 mL Tamanho
Fisherbrand  Lâminas de microscópio Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Cuidado com objetos pontiagudos
Garrafas de comida para moscas (com plugue de papel)Hansol TechFFB-21010-Fly
(com tampa de algodão)Hansol TechFFV-11010-Ultrasonicator
CovarisM220Cuidado com a onda ultrassônica
Faca de gelInvitrogenEI9010Aço inoxidável com cabo de plástico
Grau 3MM Papel mata-borrão Chr (46 cm e 57 cm)Cytiva3030-917Papel Whatmann
Homogeneizador manual e pilão de plásticoKimble749540-0000Motor sem fio
Bloco de calorPCR fino ALB6400Cuidado com alta temperatura
Tecido sem fiaposYuhan-Kimberly41112-
Nitrogênio líquido-Cuidado com queimaduras e queimaduras
Espectrofotômetro de microplacasAgilent TechnologiesEpochÓptica baseada em monocromador
Microondas-Cuidado com
miliTUBE de alta temperatura 1 mL AFA fibraCovarisPN 520135Mini
tanque de gel ThermoFisher ScientificA25977Cuidado com
os géis de proteína NuPAGE Bis-tris mini de alta temperatura, 4– 12%, 1,0– 1,5 mm, 10 poçosInvitrogenNP0323BOXContém poliacrilamida, cuidado de toxicidade
NuPAGE Bis-tris mini géis de proteína, 4– 12%, 1,0– 1,5 mm, 15 poçosInvitrogenNP0321BOXContém poliacrilamida, cuidado com a toxicidade
Pincel (Ø 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMicropipeta monocanal com ejetor de metal
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMicropipeta monocanal com ejetor de metal
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMicropipeta de canal único com ejetor de metal
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMicropipeta de canal único com ejetor de metal
Fonte de alimentaçãoCiência principalMP-310Cuidado com eletricidade de alta tensão
Rotador programávelBiosanRS-24-Protein
LoBind  tubosEppendorf30108302-Lâmina
de barbearDorco304020Aço inoxidável, cuidado com objeto pontiagudo
Rolo---Pipeta
sorológica (10 mL)SPL91010de poliestireno
(25 mL)SPL91025de poliestireno
(5 mL)SPL91005de poliestireno
(50 mL)SPL91050
Tubos de microcentrífuga de baixa retenção de poliestireno Snap cap (1,5 mL)polipropilenoThermo Scientific3451PK
InvitrogenEI9052-Microscópio
estéreoZeissStemi 508-Microscópio
estéreo Leica
ThermoMixer  CEppendorf5382000015Com blocos de 1,5 e 5 mL
PinçaAven Tools18526Plástico, pontas planas
Misturador de vórticeScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Módulo de borrãoInvitrogenEI9051Cuidado com a alta temperatura
XCell  Minicélula SureLockInvitrogenEI0001Cuidado com alta temperatura
Produtos químicosEmpresaNúmero de catálogoComentários/Descrição
AcetonaSigma-Aldrich650501Grau analítico
AcetonitrilaSupelco1.00029.1000Grau LC-MS, cuidado com a toxicidade por inalação e
ampolas padrão de albumina inflamáveis (contendo albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg/mL em solução salina a 0,9% e azida de sódio a 0,05%)Parte Thermo Scientific23209dos kits de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Albumina, soro bovinoBioshopALB001
Bicarbonato de amônioSigma-Aldrich09830Biotina de grau analítico
Sigma-AldrichB4639Grau de cultura de células e tecidos
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Grau de cultura de células
Clareza substrato de ECL ocidentalBiorad1705060Grau analítico
DAPISigma-AldrichMBD0015luz, grau analítico
Fisher ScientificR0861Grau analítico
Soro fetal bovinoCorning35-015-CVGrau de cultura de células
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507Grau de reagente, cuidado de toxicidade por inalação Meio de inseto
de GraceGibco11595030Grau de cultura de células
Fermento seco instantâneoNão MarcaN1019-
IodoacetamidaSigma-AldrichI1149de grau analítico sensível à luz
Carlo Erba41484Esmalte de unhas de grau analítico
Tampão de amostra Novex Tris-glicina SDSInvitrogenLC2676Grau analítico
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)InvitrogenNP0001PageRuler
De grau analítico Escada de proteína pré-fabricadaThermo Fisher Scientific26616Grau analítico
Fluoreto de fenilmetanossulfonil Thermo Fisher Scientific36978Grau analítico
Tampão fosfato salinoSigma-AldrichP4417Grau analítico
Pierce 16% Formaldeído (w/v)Thermo Fisher Scientific28908Grau analítico, sensível à luz
Pierce BCA kits de ensaio de proteína ThermoScientific23225Grau analítico
Reagente Pierce BCA A (contendo carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ácido bicinconínico e tartarato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 M)Parte Thermo Scientific23228dos Kits de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Reagente B Pierce BCA (contendo 4% de sulfato cúprico)Parte 1859078 Thermo Scientificdos Kits de Ensaio de Proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Ácido propiônicoSigma-Aldrich402907Conjunto
de cocktail de inibidor de protease deCalbiochem539134Grau de cultura de células e tecidos
SlowFade Gold Antifade Mountant InvitrogenS36936de
sódio (NaCl)BioneerC-9025Grau analítico
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750Grau analítico
Dodecil sulfato de sódioSigma-Aldrich71736de grau molecular
(NaOH)BiosesangSR2018-100-00Grau analítico
Água tripla destilada-Ultrapuro (tipo 1)
Solução salina tamponada com TrisSigma-Aldrich94158Tampão
de transferência de trisglicinaKoma BiotechK0341001Grau analítico
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Grau analítico
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Grau molecular
TripsinaThermo Fisher Scientific20233Grau de cultura de células
Tween 20Sigma-AldrichP9416Grau molecular
Ureia Sigma-AldrichU5378Molecular & Grau de cultura de células
de Pontas de Pipeta a Granel BR470055 de Pipeta a de aço inoxidável Sistema de -Frascos de comida para moscas focado Pipeta sorológica Pipeta sorológica Pipeta sorológica Esponja de de grau analítico Ditiotreitol (DTT)Thermo sensível à Metanol - de tipo transparente (2X) grau ACS III Cloreto Hidróxido de sódio de grau analítico

Referências

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