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Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

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DOI:

10.3791/68196

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6 de junho de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology, Fujian Institute of Clinical Immunology, Fujian Medical University Union Hospital, 2Department of Rheumatology and Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Key Laboratory of Vascular Aging (HUST), Ministry of Education

Neste artigo

Resumo

Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Resumo

A artrite reumatóide (AR) é um distúrbio inflamatório autoimune sistêmico crônico que pode resultar em danos nas articulações, deformidades, incapacidade e até morte. Devido à sua etiologia complexa e apresentação clínica heterogênea, as estratégias de tratamento atuais permanecem inadequadas para controlar efetivamente a progressão da doença, particularmente para obter diagnóstico precoce e fornecer terapias personalizadas. Portanto, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas é crucial. Para isso, modelos animais confiáveis são essenciais para investigar a patogênese da AR. Atualmente, vários modelos animais de AR são usados, incluindo o modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), o modelo K/BxN e o camundongo SKG. Embora esses modelos possam imitar com sucesso os mecanismos imunológicos e as manifestações clínicas da AR, cada um deles tem limitações notáveis.

Neste protocolo, descrevemos o processo de estabelecimento de um modelo de camundongo AR por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG. Comparado aos modelos convencionais, este modelo oferece um tempo de estabelecimento mais curto e uma taxa de incidência mais alta (100%) em camundongos C57BL/6. É relativamente econômico, envolve procedimentos simples e replica de forma confiável as respostas imunes mediadas por células T, garantindo controle experimental e reprodutibilidade superiores. Realizamos uma avaliação abrangente do modelo, avaliando o fenótipo clínico, como sintomas articulares. Por meio da avaliação do fenótipo clínico, observamos edema articular significativo e respostas inflamatórias. Além disso, usando a tecnologia de PCR para medir os níveis de expressão dos principais fatores de transcrição, descobrimos que esse modelo simula efetivamente as respostas imunes mediadas por células T e as principais características patológicas da AR. Com este modelo, os pesquisadores podem simular melhor a resposta imune mediada por células T e as principais características patológicas da AR, fornecendo assim uma ferramenta experimental confiável e eficaz para estudar os mecanismos imunológicos e a progressão patológica e desenvolver novas terapias para AR.

Introdução

A AR é uma doença inflamatória autoimune sistêmica crônica que afeta aproximadamente 1% da população mundial, causando alta morbidade e pesada carga socioeconômica 1,2. A doença é caracterizada por inflamação sinovial persistente, destruição da cartilagem e erosão óssea, levando a deformidades articulares, incapacidades e, em casos graves, morte prematura 3,4,5. A patogênese da AR envolve a interação de fatores genéticos, ambientais e imunológicos, com características principais incluindo ativação anormal da imunidade celular, liberação excessiva de citocinas pró-inflamatórias e interrupção da tolerância imunológica 6,7. Nesse processo, as células T autorreativas, particularmente as células T CD4+, como principais impulsionadores da regulação imunológica, promovem diretamente a progressão patológica da AR por meio de múltiplos mecanismos.

As células T auxiliares (Th)1 produzem interferon-gama (IFN-γ), que ativa macrófagos e fibroblastos sinoviais, resultando na liberação do fator de necrose tumoral (TNF)-α e interleucina (IL)-6 e causando sinovite. As células Th17 secretam IL-17, que promove a ativação de células sinoviais e osteoclastos, exacerbando a destruição da cartilagem e a erosão óssea 8,9. Além disso, as células T CD4+ amplificam as respostas inflamatórias ativando as células B por meio de sinais co-estimulatórios, induzindo a produção de anticorpos proteicos anticitrulinados (ACPA) e fatores reumatoides (FR)10. Enquanto isso, defeitos na função e redução no número de células Treg são as principais razões para o desequilíbrio imunológico na AR, levando à inflamação descontrolada 11,12. Devido à etiologia complexa e à apresentação clínica heterogênea, o diagnóstico precoce é difícil e o tratamento atual da AR é insatisfatório. Portanto, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas é crucial. Modelos animais confiáveis são essenciais para investigar a patogênese da AR para obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos potenciais da AR e explorar novas estratégias de tratamento.

Modelos tradicionais de AR, como os modelos de camundongos CIA e K/BxN 13,14,15, contribuem para melhorar nossa compreensão da AR. No entanto, esses modelos mostram limitações significativas. Por exemplo, o modelo CIA em camundongos C57BL / 6 tem uma baixa taxa de sucesso e longo período de indução, o que diminui sua utilidade em certos ambientes experimentais. Da mesma forma, embora o modelo K/BxN seja valioso, é caro estabelecer e tem limitações na replicação da complexa patologia da AR humana, particularmente as interações entre células imunes e citocinas.

Para resolver essas limitações, desenvolvemos um novo modelo de camundongo RA transferindo células T CD4 + de camundongos SKG com fundo C57BL / 6 para camundongos C57BL / 6 imunocompetentes, em combinação com ativação imune induzida por manano. Este modelo replica efetivamente as principais características da AR, incluindo respostas imunes mediadas por células T e características patológicas essenciais, como inflamação sinovial e erosão articular, ao mesmo tempo em que oferece vantagens em reprodutibilidade, simplicidade e custo-benefício. Delineamos uma metodologia detalhada para estabelecer este modelo, que inclui a geração de camundongos SKG no fundo C57BL / 6, isolamento de células T CD4 + de camundongos SKG, sua transferência adotiva e a subsequente indução por manana. Além disso, descrevemos os critérios clínicos e histológicos utilizados para avaliar a gravidade da artrite, garantindo sua confiabilidade e reprodutibilidade. Ao imitar consistentemente as respostas imunes mediadas por células T e as características patológicas fundamentais da AR, este modelo serve como uma ferramenta experimental robusta e eficiente para investigar os mecanismos imunológicos, a progressão da doença e o desenvolvimento de novas terapias para AR.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais neste estudo seguiram rigorosamente as diretrizes estabelecidas pelo "Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", incluindo criação de animais, operações experimentais e eutanásia, e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Faculdade de Medicina de Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong.

1. Animais

  1. Geração de mouses SKG (fundo C57BL/6)
    1. Estratégia de edição de genes
      1. Projete um RNA guia específico (gRNA) direcionado ao gene ZAP70 (sequência de gRNA: 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3') e conduza a edição de genes com o sistema CRISPR/Cas9. Projete um DNA de doador com a mutação ZAP70 (W163C) para garantir a incorporação precisa da mutação (aqui, CAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
        CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTG
        C        TATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
        GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA).
        NOTA: O gRNA direciona a proteína Cas9 para o local específico do gene ZAP70 para um corte preciso. A base sublinhada na sequência de DNA do doador indica bases mutantes. Essa mutação corresponde à mutação W163C (TGG→TGC) na proteína ZAP70, que está localizada em um domínio funcional crítico.
    2. Injeção de microsseringa
      1. Use microinjeção para introduzir mRNA Cas9, gRNA e DNA de doador em óvulos fertilizados de camundongos C57BL/6. Co-injete a proteína Cas9 e o gRNA para que eles clivem o gene ZAP70 e insiram a mutação ZAP70 (W163C) por meio de recombinação homóloga. Transplante os óvulos fertilizados injetados em camundongos fêmeas pseudográvidas, aguarde aproximadamente 20 dias e designe os camundongos nascidos como a geração F0. Identifique genótipos por meio de amplificação e sequenciamento por PCR (consulte a etapa 1.1.5.3).
    3. Genotipagem de camundongos da geração F0
      1. Realize PCR e sequenciamento em camundongos da geração F0 para confirmar a aquisição da mutação ZAP70 (W163C) (consulte a etapa 1.1.5.3).
        NOTA: Os camundongos da geração F0 são quiméricos devido à rápida clivagem embrionária. Eles podem não ter transmissão genética estável. Implemente a reprodução em série para estabelecer linhas estáveis.
    4. Aquisição e identificação genotípica de camundongos da geração F1
      1. Cruze camundongos positivos para F0 com camundongos C57BL / 6J do tipo selvagem para obter camundongos da geração F1 e realize genotipagem via PCR e sequenciamento para obter camundongos SKG (histórico C57BL / 6; consulte a etapa 1.1.5.4).
    5. Métodos de genotipagem baseados em PCR para as gerações F0 e F1
      1. Extirpar um pedaço de 0,5 cm da cauda com uma tesoura estéril.
      2. Extraia DNA de camundongo usando um kit de extração de DNA genômico animal.
      3. Para F0, prepare o seguinte sistema de reação de PCR: 13,2 μL de ddH2O, 2 μL de tampão de PCR, 2 μL de 2,5 mM dNTP, 0,5 μL de cada um dos primers direto (5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGGTTCC-3') e reverso (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,8 μL de DNA polimerase e 1 μL de DNA genômico (50-100 ng/μL) extraído de caudas de camundongos, para um volume de reação final de 20 μL. Realizar a amplificação gênica usando o seguinte programa de PCR: 94 °C por 3 min; 98 °C por 15 s, 58 °C por 15 s e 68 °C por 1 min, por 35 ciclos; 68 °C por 5 min; manter a 12 °C.
      4. Para F1, prepare o seguinte sistema de reação de PCR: 14,9 μL de ddH2O, 2 μL de tampão de PCR Taq 10x, 1 μL de 2,5 mM dNTP, 0,5 μL de cada um dos primers direto (5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGGTTCC-3') e reverso (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,1 μL de Taq DNA polimerase e 1 μL de DNA genômico (50-100 ng/μL) extraído de caudas de camundongos, para um volume de reação final de 20 μL. Realizar a amplificação gênica usando o seguinte programa de PCR: 94 °C por 5 min; 94 °C por 30 s, 58 °C por 30 s, 72 °C por 1 min, repetido por 35 ciclos; 72 °C por 5 min; manter a 12 °C.
      5. Execute a eletroforese para confirmar produtos do tamanho esperado.
      6. Sequencie os produtos de PCR para verificar o genótipo e a mutação específica.
  2. Seleção de camundongos doadores e receptores
    1. Selecione camundongos SKG com 6 a 8 semanas de idade (machos ou fêmeas) como camundongos doadores.
    2. Selecione camundongos C57BL / 6 com 6-8 semanas de idade (de preferência fêmeas para resultados experimentais consistentes) como camundongos receptores.
    3. Camundongos domésticos C57BL/6 e SKG (6-8 semanas de idade) sob condições de FPS em gaiolas ventiladas individualmente. Forneça acesso gratuito a ração de grau FPS e água estéril em um ciclo claro/escuro de 12 h. Aclimate os camundongos por 1 semana antes de iniciar os experimentos.

2. Isolamento e purificação de células T CD4+ de camundongos SKG

  1. Eutanasiar os camundongos SKG sob uma capa de fluxo laminar estéril usando asfixia por CO2 . Mergulhe os ratos em álcool 75% por 5 min para desinfetar. Localize o baço na cavidade abdominal, bem como os gânglios linfáticos (inguinal e poplíteo) nas regiões inguinal e poplítea. Disseque cuidadosamente o baço e os gânglios linfáticos usando pinças e tesouras estéreis e transfira-os imediatamente para PBS pré-resfriado.
  2. Coloque o baço e os gânglios linfáticos em placas de Petri separadas. Pressione os tecidos através de um filtro de células de 70 μm usando o êmbolo de uma seringa estéril e adicione gradualmente 10-12 mL de PBS pré-resfriado para formar uma suspensão celular uniforme. Passe a suspensão celular pelo mesmo filtro de células de 70 μm para um tubo de centrífuga de 15 ml e, em seguida, centrifugue a 300 × g por 7 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e reter o sedimento celular.
  3. Realize a coloração com azul de tripano para avaliar a viabilidade celular. Conte as células e confirme se a viabilidade é de ≥90%.
  4. Ajuste a concentração celular para 1 × 108 células/mL com o tampão fornecido no kit de isolamento de células T CD4+ .
  5. Transferir 100 μL da suspensão celular (107 células) para um novo tubo. Adicione 10 μL de Biotina-Anticorpo-Coquetel, misture bem e incube no gelo por 15 min.
  6. Ressuspenda as contas por vórtice na velocidade máxima. Adicione 10 μL da suspensão de esferas de estreptavidina, misture bem e incube no gelo por 15 min.
  7. Adicione 2,5 mL do tampão fornecido no kit de isolamento de células T CD4+ e coloque o tubo no ímã por 5 min.
  8. Deite cuidadosamente o líquido (células-alvo) do tubo para um novo tubo estéril e, em seguida, centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e reter o sedimento celular.
  9. Adicione uma quantidade suficiente de solução estéril de PBS para ajustar a concentração celular para 2 × 106 células / mL e mantenha a suspensão congelada para uso posterior.
  10. Use citometria de fluxo para avaliar a pureza das células classificadas (Figura Suplementar S1). Calcule a pureza celular como: (Número de células T CD4 + / Contagem total de células) × 100%. Confirme se a pureza é ≥90%16.

3. Transferência adotiva de células T CD4+

  1. Anestesiar camundongos C57BL/6 com 2%-3% de isoflurano, atingindo uma profundidade de anestesia em que os camundongos perdem toda a mobilidade, mas mantêm a respiração espontânea normal.
  2. Limpe suavemente o canto interno (canto do olho) do camundongo com um cotonete estéril para remover secreções e pelos, expondo a veia.
  3. Imobilize o mouse com a mão. Aspire 200 μL de suspensão de células T CD4+ (2 × 105-5 × 105 células por camundongo) em uma seringa de 1 mL. Insira a agulha em um ângulo de 10-15° na veia cantal interna, garantindo um posicionamento preciso. Injete a suspensão celular lenta e uniformemente por 10-15 s.
  4. Depois de retirar a agulha, pressione suavemente a área interna do cantal com um cotonete estéril por 3-5 s para evitar sangramento.
  5. Coloque o mouse em uma gaiola silenciosa, seca e limpa para monitoramento até que ele recupere totalmente a consciência, com respiração estável e sem comportamento anormal (como espasmos ou morte súbita). Mova o mouse para uma gaiola de alojamento padrão após confirmar o estado pós-operatório estável.
    NOTA: Como a veia cantal interna é pequena, o manuseio suave e a velocidade de infusão controlada são cruciais para evitar a ruptura da veia ou o bloqueio celular causado por velocidade excessiva.
  6. Registre os detalhes da infusão e rotule os camundongos do modelo e do grupo de controle (quatro animais por grupo) para evitar confusão em experimentos subsequentes. Administre células T CD4 + para camundongos modelo e deixe os camundongos controle sem tratamento. Certifique-se de que todos os mouses sejam camundongos receptores.

4. Estimulação e indução de manano

  1. Realize a indução de manano no dia 4 (72 h após a infusão de células T CD4+ ). Aplique as mesmas condições de indução a todos os camundongos experimentais e de controle.
    1. Pesar o pó de manano e dissolvê-lo em PBS estéril até uma concentração de 100 mg/ml.
    2. Segure o mouse corretamente para expor seu abdômen. Desinfete a pele com álcool 75% e identifique o local da injeção (~1 cm ao lado da linha média abdominal).
    3. Misture bem a solução de manano e aspire o volume apropriado (20-30 mg por camundongo) em uma seringa de 1 mL. Insira a agulha em um ângulo de 45° na cavidade peritoneal e injete a solução lentamente para garantir uma distribuição uniforme. Retire a agulha lentamente e pressione suavemente o local da injeção com um cotonete estéril por alguns segundos para evitar vazamento ou infecção.
  2. Coloque o camundongo injetado em uma gaiola silenciosa e limpa e monitore de perto por 5 a 10 minutos para garantir que não haja vazamento no local da injeção, distensão abdominal ou respiração anormal.
  3. Registre os detalhes da injeção para cada mouse em detalhes.

5. Medições

  1. Observação do fenótipo clínico
    1. Pontuação dos sintomas de artrite
      1. Realize avaliações conjuntas a cada 3 dias após a indução do manano. Inspecione todas as articulações dos membros anteriores e posteriores, prestando atenção especial às articulações do joelho, tornozelo, punho e dedo do pé. Pontuar a gravidade da artrite usando critérios padrão (Tabela 1)17. Registre e compare as pontuações totais em cada ponto de tempo para avaliar a progressão da artrite.
  2. Registro de características patológicas teciduais
    1. Após um mês de indução de manano, eutanasiar os camundongos sob uma capa de fluxo laminar estéril usando asfixia por CO2 (seguindo as diretrizes do comitê de ética), prender o camundongo em uma placa de espuma e expor os membros posteriores. Incise a pele começando no tornozelo e descasque para cima para expor os músculos e articulações. Identifique a articulação do tornozelo (entre tíbia/fíbula e tálus) e as articulações metatarsofalângicas (entre metatarsos e falanges proximais) e disseque essas articulações para análise histológica e prepare cortes de parafina.
    2. Fixe os tecidos excisados em formalina a 4% por 72 h e, em seguida, transfira-os para ácido etilenodiaminotetracético a 10% (EDTA, pH 7,4) por 4 semanas de descalcificação para garantir a descalcificação completa.
    3. Após a descalcificação, lavar os tecidos com PBS para remover qualquer fixador residual e, em seguida, desidratar os tecidos através de uma série graduada de etanol (75%, 80%, 95%, 100%).
      NOTA: A formalina pode irritar os olhos, a pele e o trato respiratório. Deve ser manuseado em um exaustor.
    4. Incorpore o tecido em parafina usando uma máquina de inclusão de parafina. Use um micrótomo para seccionar o tecido embutido em fatias de 4 μm de espessura. Flutuar as secções num banho-maria a 40 °C contendo água destilada.
    5. Transfira e seque as seções. Coloque as seções em lâminas de vidro. Seque-os durante a noite em temperatura ambiente (RT). Guarde as lâminas em RT para coloração.
    6. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
      1. Coloque as lâminas em um forno a 60 °C por 2 h para remover a parafina.
      2. À temperatura ambiente, mergulhe as lâminas na seguinte sequência por 5 min cada: xileno → xileno → etanol 100% → etanol 100% → etanol 95% → etanol 80% → etanol 75%. Enxágüe em água destilada por 2 min.
      3. Pinte as lâminas sequencialmente em solução de hematoxilina por 5 min, enxágue em água deionizada por 2 min, depois trate com 0,1% de amônia por 1 min, enxágue por 3 x 2 min em água deionizada, mante com eosina por 1 min e, finalmente, enxágue em água deionizada por 2 min.
      4. Mergulhe as lâminas por 5 min cada em etanol a 80% → etanol a 95% → etanol a 100% → xileno → xileno.
      5. Seque as lâminas naturalmente e monte com resina neutra.
    7. Coloração Safranin O-Fast Green
      1. Desparafinize as seções de parafina para regá-las e corá-las usando um kit de coloração de Van Gieson. Monte as lâminas com resina neutra após a coloração e capture as imagens ao microscópio (preparado na etapa 5.2.5).
  3. Alterações nas células T e citocinas
    1. Remova o baço do camundongo usando ferramentas cirúrgicas estéreis.
      1. Extraia o RNA total do tecido do baço usando um kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Quantifique a concentração e a pureza do RNA usando um espectrofotômetro e certifique-se de que a proporção A260/A280 esteja entre 1,8 e 2,0.
      2. Sintetize o cDNA do RNA extraído usando um kit de transcrição reversa. Siga o protocolo do fabricante para a configuração da reação e as condições de ciclagem. Armazene o cDNA a -20 °C para análise subsequente de qPCR.
      3. Realizar qPCR: Medir os níveis relativos de expressão de mRNA de Tbx21, Gata3, Il-17 e Foxp3 no tecido do baço foi medido usando qPCR à base de SYBR Green em reações de 10 μL contendo: 5 μL de 2x SYBR Green master mix, 0,2 μL de primers diretos e reversos (10 μM; sequências na Tabela 2), 0,5-1 μL de cDNA (50-100 ng/μL), e água livre de nuclease para volume. Utilizar as seguintes condições de ciclagem térmica: desnaturação inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 10 s e 60 °C durante 30 s, com análise da curva de fusão (65-95 °C). Normalize os níveis de expressão para Gapdh usando o método 2(-ΔΔCt ).
    2. Isolamento sérico e análise de matriz de esferas citométricas (CBA)
      1. Colete sangue do camundongo usando a coleta de sangue orbital pelo método de enucleação, transfira o sangue para um tubo de coleta revestido com anticoagulante e deixe-o repousar em temperatura ambiente por 30 minutos. Centrifugue o sangue coagulado a 4 °C, 1.000 × g por 15 min, colete cuidadosamente o sobrenadante (soro) e armazene-o a -80 °C até a análise.
      2. Determine os níveis de expressão de IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-γ no soro usando um kit CBA de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Pontuação clínica do inchaço articular e taxa de incidência em camundongos
A Figura 1 mostra a pontuação clínica do inchaço articular e a taxa de incidência em camundongos modelo. Os resultados indicam que todos os camundongos do grupo modelo desenvolveram a doença (n = 4), com uma taxa de incidência de 100%. As pontuações no grupo modelo aumentaram significativamente, mostraram breve alívio na segunda semana e, posteriormente, aumentaram ao longo de um período de 6 semanas.

Manifestação de inchaço articular em camundongos
As articulações dos camundongos do grupo modelo exibem espessamento e inchaço significativos, com inchaço e espessamento perceptíveis também observados nos membros anteriores e posteriores (Figura 2).

Resultados patológicos das articulações do tornozelo de camundongos
Os resultados patológicos indicam que, em comparação com o grupo controle, os camundongos do grupo modelo apresentam espessamento significativo da sinóvia nas articulações do tornozelo, descontinuidade no osso e agregação acentuada de células inflamatórias (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

Fatores inflamatórios séricos relacionados às células T
Em comparação com o grupo controle, os camundongos do grupo modelo apresentaram aumentos significativos nos níveis séricos de IL-10 (7,51 vs 2,15 pg/mL), TNF (78,83 vs 13,11 pg/mL), IL-17 (101,6 vs 12,64 pg/mL) e IFN-γ (5,15 vs 1,90 pg/mL) (p < 0,05). A IL-6 também aumentou significativamente em comparação com o grupo controle (15,59 vs 6,27 pg/mL) (p = 0,05, Figura 6).

Alterações nas subpopulações de células T Th1/2/17 e Tregs no baço
Os níveis de expressão de mRNA de Tbx21 (Th1), Gata3 (Th2), Il-17 (Th17) e Foxp3 (Tregs) foram medidos para avaliar alterações em subconjuntos de células T no baço. Esses genes codificam os principais fatores de transcrição e citocinas que definem a diferenciação e a função de seus respectivos subconjuntos de células T. Em comparação com o grupo controle, os camundongos do grupo modelo mostraram expressão de mRNA significativamente aumentada de Tbx21 (1,68 vs 0,61) e Il-17 (26,30 vs 0,75) no baço (p < 0,05) em relação ao gene de referência Gapdh.

figure-results-1
Figura 1: Pontuação clínica do edema articular. (A) Camundongos de grupo modelo; (B) Incidência cumulativa nos camundongos do grupo modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Manifestações de inchaço articular em camundongos controle e modelo (n = 4). (A-C) Imagens representativas dos escores de inchaço da pata e das articulações (0,2,4) nos grupos controle e modelo de camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Alterações histológicas nas articulações do tornozelo de camundongos do grupo controle e modelo observadas com coloração de hematoxilina-eosina. (A) Articulação do tornozelo de camundongo controle; (B) Descontinuidade no osso da articulação do tornozelo do camundongo do grupo modelo; (C) Proliferação sinovial na articulação do tornozelo de camundongo do grupo modelo. Barras de escala = 50 μm (primeira coluna), 100 μm (segunda e terceira colunas). As imagens nas Fig. 3B e 3C são do mesmo camundongo, demonstrando diferentes fenótipos patológicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Diferenças na espessura sinovial das articulações do tornozelo entre os camundongos do grupo controle e do grupo modelo (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Alterações histológicas nas articulações do tornozelo de camundongos do grupo controle e modelo observadas com a coloração Safranin O-Fast Green. (A) Articulação do tornozelo do camundongo do grupo controle; (B) Proliferação sinovial na articulação do tornozelo do camundongo do grupo modelo. Barras de escala = 50 μm (primeira coluna), 100 μm (segunda e terceira colunas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Alterações nos fatores inflamatórios relacionados às células T e subconjuntos em camundongos do grupo controle e modelo. (A) Expressão de fatores inflamatórios relacionados a células T no soro de camundongos do grupo controle e modelo e (B) as alterações nos subconjuntos de células T Th1/2/17 e Tregs no baço. *p < 0,05, **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PontuaçãoInchaço (intervalo 0-4)Eritema (intervalo 0-2)
0NenhumNenhum
1Qualquer dígitoligeiro
2PataExtremo
3Pulso/tornozelo
4Membro inteiro

Tabela 1: Critérios de pontuação de artrite. Para pontuar a artrite, cada membro é pontuado de acordo com o inchaço e o eritema, com uma pontuação de 0 a 6 atribuída a cada membro. As pontuações para todos os quatro membros são somadas para gerar a pontuação total de artrite para cada camundongo.

Sequências de primers
Nome do oligoSequência 5' a 3'
Tbx21-AvançarAGCAAGGAGCGAATGTT
Tbx21-ReversoGGGTGGACATATAAGCGGTTC
Gata3-AvançadoCTCGGCCATTCGTACATGGAA
Gata3-ReversoGGATACCTCTGCACCGTAGC
Il-17A-AvançadoTTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
IL-17A-ReversoCTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3-ForwardCCCTTGACCTCAAAACCAAG
Foxp3-ReversoGTGTGACTGCATGACTAACTTTGA
Gapdh-ForwardGGTTGTCTCCTGCGACTTCA
Gapdh-ReversoTGGTCCAGGGTTTCTTACTCC

Tabela 2: Lista de sequências de primers.

Figura suplementar S1: Estratégia de gating para classificação de células T CD4+ por citometria de fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O desenvolvimento da AR está intimamente associado à infiltração anormal de células imunes no tecido sinovial, onde a ativação desregulada dessas células imunes leva à liberação de várias citocinas pró-inflamatórias, que contribuem ainda mais para o dano das estruturas sinoviais e articulares18,19. Vários modelos animais de AR foram amplamente avaliados, incluindo o modelo CIA, o modelo K/BxN e camundongos SKG 13,20,21. Embora esses modelos repliquem com sucesso os mecanismos imunológicos e as manifestações clínicas da AR, todos eles têm limitações significativas. Por exemplo, o modelo CIA em camundongos C57BL / 6 tem uma taxa de sucesso mais baixa, um período de início mais longo e é significativamente influenciado por condições ambientais e experimentais, tornando-o menos prático em certos ambientes experimentais. Os camundongos SKG representam um modelo de camundongo AR baseado em uma mutação do gene ZAP-70, que causa uma anomalia abrupta na sinalização do receptor de células T (TCR) e induz artrite autoimune22. No entanto, este modelo é caro e a reprodutibilidade dos resultados experimentais é facilmente afetada pelas condições de indução. K/BxN é um modelo de artrite hereditária desencadeado pela atividade cooperativa de células T e B, exibindo uma resposta imune pronunciada23. No entanto, a construção desse modelo é cara e sua especificidade é restrita, levando a uma resposta imune limitada que não pode capturar inteiramente o processo patológico multifacetado da AR humana. Portanto, é de grande importância desenvolver um modelo animal que possa replicar as principais características patológicas da AR, atender a vários requisitos experimentais e garantir alta reprodutibilidade.

Neste estudo, apresentamos um método para estabelecer um modelo de AR por meio da transferência adotiva de células T CD4+ adaptativas de camundongos SKG. A construção deste modelo baseia-se na seleção de células T CD4+ de camundongos SKG com fundo C57/BL6 e na indução de manano, um processo que garante o sucesso do modelo. É amplamente conhecido que camundongos SKG em um fundo BALB / c carregam uma mutação espontânea no gene ZAP70 (W163C), que causa seleção anormal de sinalização TCR, levando a células T altamente auto-reativas24. Isso resulta em ativação excessiva de células T e início de sinovite e destruição articular, mimetizando assim os principais processos patológicos da AR, como reparo sinovial e ativação de células imunes25,26. As características clínicas dos camundongos SKG se assemelham muito às dos pacientes humanos com AR.

Para introduzir essa mutação no fundo C57BL / 6, empregamos a tecnologia CRISPR / Cas9 para gerar com sucesso um modelo de camundongo SKG de fundo C57BL / 6 carregando a mutação ZAP70 (W163C). O CRISPR/Cas9 oferece alta precisão e eficiência, permitindo a introdução direcionada da mutação desejada, mantendo uma baixa taxa de inserção fora do alvo ou modificações genéticas indesejadas associadas aos métodos tradicionais de indução aleatória, garantindo assim a estabilidade e exclusividade do modelo27,28. Mais importante, essa técnica também reduz significativamente o tempo necessário para a construção do modelo, aumentando a controlabilidade e a eficiência do desenvolvimento do modelo. Usando este modelo, podemos replicar com precisão a sinovite mediada por células T e a destruição conjunta da AR contra um fundo C57BL / 6. Em comparação com o fundo BALB/C em camundongos SKG tradicionais, os camundongos modelo em um fundo C57BL/6 têm aplicabilidade mais ampla na pesquisa imunológica e podem ser mais facilmente combinados com outros modelos transgênicos (por exemplo, Rag1-/- ou IL17-/-). Isso os torna adequados para investigar o papel da mutação ZAP70 na AR e outras doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico ou esclerose múltipla.

Com base no papel central29,30 das células T CD4+ na ativação da AR, nós as selecionamos como mediadores-chave. As células T são os principais impulsionadores das respostas imunes na AR e podem induzir diretamente danos sinoviais ativando subconjuntos efetores Th1 / Th1731, dependendo de fatores inflamatórios como IL-6, IL-17 e TNF-α 32,33. Como mediadores fundamentais da regulação imunológica, as células T CD4+ secretam citocinas pró-inflamatórias, desencadeando e mantendo a cascata inflamatória, que leva à proliferação sinovial e dano articular, promovendo diretamente a progressão patológica da AR. Eles são fundamentais para auxiliar as células B na produção de anticorpos específicos (por exemplo, ACPA) 34 . Enquanto isso, a característica histopatológica típica da sinóvia da AR é a agregação de células T CD4+. Certos genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II, especialmente os "epítopos compartilhados" relacionados ao isotipo DR do antígeno leucocitário humano (HLA-DR), são considerados intimamente ligados à patogênese da AR35. Além disso, a estratégia de bloqueio da coestimulação de células T com antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA4)-Ig demonstrou eficácia clínica significativa na AR36. Além disso, a indução de manano serve como um potente ativador para o modelo, promovendo a ativação de componentes imunes inatos, como células dendríticas e macrófagos37. Esta etapa facilita ainda mais a ativação das células T CD4+ e as respostas imunes, aumentando significativamente o ataque do sistema imunológico aos autotecidos, simulando assim as características patológicas de desregulação imunológica e dano sinovial na AR.

Após completar a indução do modelo, realizamos uma verificação sistemática do grupo modelo usando vários parâmetros, incluindo pontuação clínica de inchaço articular, validação patológica (observando sinovite, patologia tecidual e características de destruição articular) e validação imunológica (expressão de Th1/2/17 e células Treg no soro e baço). Os resultados mostraram que nosso modelo replicou com sucesso a sinovite mediada por células T e a destruição articular na AR, induzindo ativação imune característica e alterações patológicas sinoviais consistentes com os principais mecanismos fisiopatológicos da AR, com uma taxa de prevalência de 100%. Vale ressaltar que, em nosso modelo, o escore clínico da articulação inchada de camundongos atinge o pico em 1 semana, mostra uma redução acentuada na segunda semana e, em seguida, aumenta gradualmente novamente em estágios posteriores, o que não está totalmente de acordo com o curso típico da doença observado em modelos animais convencionais de artrite38. Isso pode ocorrer porque, 1 semana após a indução, o sistema imunológico nos camundongos modelo está em uma fase inicial intensamente ativada pela injeção de manano, resultando em um pico de inflamação articular. Na segunda semana, a regulação imunológica e os mecanismos de auto-recuperação levam a um alívio temporário dos sintomas clínicos. À medida que a doença progride, a tolerância imunológica diminui gradualmente e a resposta imune é intensificada, manifestada por um agravamento gradual da condição em estágios posteriores.

Embora este modelo seja relativamente simples em comparação com outros modelos, ainda existem vários pontos-chave que precisam ser abordados durante o processo de modelagem. Primeiro, a atividade e a pureza das células T CD4 + de camundongos SKG formam a base para o sucesso do modelo. A pureza das células deve exceder 90% para garantir a consistência e confiabilidade dos resultados experimentais. Em segundo lugar, a velocidade de injeção na veia cantal medial deve ser cuidadosamente controlada para evitar a ruptura da veia por injeção muito rápida ou vazamento de células por injeção muito lenta. Além disso, a seleção da dose celular é crítica. Uma dose muito baixa pode levar à falha do modelo, enquanto uma dose muito alta pode desencadear respostas inflamatórias inespecíficas. Portanto, durante o processo de modelagem, a condição geral dos camundongos deve ser monitorada de perto e quaisquer sintomas anormais devem ser registrados imediatamente para garantir o bom andamento do experimento e a validade científica dos dados.

Comparado aos modelos convencionais, este modelo tem um período de estabelecimento mais curto, atinge uma taxa de incidência mais alta em camundongos C57BL/6 e permanece relativamente econômico e fácil de operar. A adoção da transferência de células T CD4+ autorreativas reproduz com precisão as respostas imunes mediadas por células T e captura as principais características patológicas da AR, como inchaço e danos nas articulações. Além disso, suas manifestações clínicas se alinham bem com as da AR humana, oferecendo um reflexo mais autêntico dos processos clínicos e patológicos da AR. Além disso, a combinação de infusão de veia cantal medial e indução de manano melhora ainda mais a controlabilidade e a estabilidade experimental do modelo, tornando-o altamente reprodutível e oferecendo excelente controle experimental. Claro, este modelo ainda tem limitações. Ele se concentra principalmente nas respostas imunes impulsionadas por células T; a simulação dos papéis colaborativos das respostas de anticorpos mediadas por células B e outras células imunes (como células natural killer (NK) e células Treg) é insuficiente, tornando desafiador representar totalmente os mecanismos patológicos multicelulares da AR. No entanto, este modelo de camundongo AR continua sendo um modelo animal estável e confiável, fornecendo aos pesquisadores uma plataforma melhor para simular as respostas imunes mediadas por células T e as principais características patológicas da AR. Este modelo permite que os pesquisadores se aprofundem nos mecanismos imunológicos e na progressão patológica da AR, fornecendo importantes evidências experimentais e ferramentas para o desenvolvimento de novas terapias, particularmente na compreensão da desregulação imunológica impulsionada por células T e na identificação de alvos terapêuticos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82270903, 82401588 e 81974254) e da Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China (2024M751019).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseYeasen10208ES60Preparando gel de agarose para uso em experimentos de eletroforese de DNA
Etanol anidroShanghai HuShi Laboratory Instruments Co., Ltd.100009218Agente desidratante e fixador
ZAP 70 primersTsingkePrimers usados para detectar a expressão do gene ZAP70, comumente usados em experimentos de PCR para genotipagem de camundongos
0,5 M Solução de EDTA (pH = 7,4)BiosharpR00521Usado para descalcificação para garantir a qualidade das seções de tecido e coloração para tecidos contendo cálcio, mantendo a integridade estrutural do tecido
Tubos ep sem enzimas de 1,5 mLLABSELECTMCT-001-150-SUsado para uma variedade de experimentos, como armazenamento de amostras, separação centrífuga, etc
2x Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal)ToloBio22204Usado para realizar reações qPCR altamente específicas e altamente sensíveis.
2x Magic Green Taq SuperMixTOLOBIO21502-04Solução tampão para pré-eletroforese
de formaldeído (paraformaldeído) a 4%BiosharpBL539AUsado como fixador para preservar a estrutura do tecido e a morfologia celular, fornecendo amostras estáveis e bem preservadas para as etapas de coloração subsequentes
Kit de isolamento de RNA total de tecido/célula animalServicebioMPC2409122Extração de RNA total de tecidos/células animais
BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine KitBD Biosciences560485Medir a expressão de citocinas Th1/2/17 no soro de camundongo.
Placa de cultura celularLABSELECT12211Um recipiente para fluido celular do baço e gânglios linfáticos
DimetilbenzenoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagents Co., Ltd.10023418Usado como agente de desparafinização e limpeza
Câmara de contagem de células de seis portas EasyfiveCytoEasyN3EF110Usado para contagem de células
Solução de coloração Safranin O-Fast Green aprimorada para cartilagem.SolarbioG1371Mancha cartilagem e tecidos ósseos para observar alterações patológicas na área articular.
Lâmina de vidroCITOTEST188105Suporte básico para fatiamento de tecidos
Solução de coloração de hematoxilinaServicebioG1005-1moribunda
ServicebioG1001Morrendo
Centrífuga refrigerada de baixa velocidadeCenceF14300021010004É usado para centrifugação e precipitação
MananSigmam7504Ativador para o modelo. Dissolva em PBS estéril a 2 mg / mL, misture bem e filtre através de um 0,22 μ m para eliminar quaisquer partículas ou possíveis fontes de contaminação.
MojoSort MagnetBiolengend480019Usado para isolar e purificar células T CD4 + do baço, gânglios linfáticos de camundongos
Kit de isolamento de células T CD4 de camundongos MojoSort480033Usado para isolar e purificar células T CD4 + do baço, gânglios linfáticos de camundongos. Use um método de seleção negativa que se liga diretamente à molécula CD4 para isolar células T CD4+, preservando a integridade dos antígenos de superfície sem afetar a funcionalidade da molécula CD4, tornando-o adequado para experimentos de infusão de células T CD4+.
Nano-300ALLSHENGAS-11020-00Detecção precisa de ácidos nucleicos, proteínas e soluções celulares Agente de
montagem de resina neutraBiosharpBL704AFixar e preservar seções de tecido manchado
Micrótomo de parafinaKEDEEKD-3389Usado para seções de parafina
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)PricellaWHB824P281Usado como tampão solvente ou agente de limpeza,
filtro de célula estéril (70 µ m)BiosharpBS-70-CSRemova grandes impurezas ou aglomerados de células agregadas da suspensão celular para garantir a pureza da amostra e a uniformidade celular
Seringa estéril (1 mL)Lingyang Medical Apparatus20241020Injeção na veia canthal interna
Centrífuga microrefrigerada de mesa de alta velocidadeSCILOGEXS1010EUsado para centrifugação e precipitação
TEA Buffer (50x)Yeasen60116ES76Estabiliza o pH, ajuda a proteger e preservar moléculas como DNA e RNA, usadas em experimentos de eletroforese
ToloScript All-in-one RT EasyMix para qPCRToloBio22107Usado para converter modelos de RNA em cDNA, facilitando a análise subsequente da expressão gênica, qPCR e outros experimentos de biologia molecular.
Pipetas TranseferBIOFIL240515-133-AUsado para transferir soluções
Solução de corante azul de tripanoBiosharp7009529Comumente usado para ensaios de viabilidade celular, ajuda a diferenciar células vivas de células mortas
Solução Solução de coloração de hematoxilina Mouse

Referências

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