Isolamento e cultura de colangiócitos primários de camundongos com doença hepática policística usando um método de digestão em duas etapas

Resumo

Este protocolo descreve um método otimizado de digestão em duas etapas para isolar colangiócitos primários de alta pureza e alta viabilidade de camundongos selvagens e camundongos com doença hepática policística.

Resumo

Neste protocolo, otimizamos um método de digestão em duas etapas para isolar colangiócitos primários de alta pureza e alta viabilidade de camundongos selvagens e camundongos com doença hepática policística (PLD). Após anestesiar os camundongos, os fígados foram perfundidos através da veia cava inferior com 50 mL de Solução A, seguido por 30 mL de Solução B a 37 °C para digerir enzimaticamente o tecido hepático. Dissociação mecânica, agitação e microdissecção foram realizadas para remover as células parenquimatosas aderentes, deixando uma árvore biliar intacta. A árvore biliar foi então finamente picada e digerida com agitação por 60 min a 37 °C. A suspensão unicelular resultante foi coletada usando um filtro de células de 70 μm. Os colangiócitos foram purificados por meio de isolamento imunomagnético. A suspensão celular foi incubada com um anticorpo anti-EpCAM sob rotação por 45 min a 4 °C, seguida pela adição de esferas de proteína G e rotação adicional por mais 45 min a 4 °C. Após três lavagens com PBS, os colangiócitos foram coletados usando um separador magnético. Os colangiócitos primários purificados foram ressuspensos em meio de cultura de colangiócitos e semeados em placas de cultura de células revestidas com 1 mg/mL de colágeno de cauda de rato tipo I. A pureza dos colangiócitos foi confirmada por imunomarcação para o marcador específico de colangiócitos citoqueratina-19 (CK19). Embora este estudo tenha se concentrado no isolamento de colangiócitos primários de camundongos do tipo selvagem e PLD, estamos confiantes de que o protocolo também pode ser aplicado a outros modelos de camundongos com doenças. Este método detalhado de digestão em duas etapas facilita estudos in vitro de colangiopatias e o desenvolvimento de terapias direcionadas.

Introdução

Os colangiócitos, as células epiteliais que revestem a árvore biliar intra-hepática, formam uma monocamada e constituem aproximadamente 3-5% da população total de células do fígado¹. Essas células se interconectam dentro do fígado para criar uma complexa rede ductal tridimensional². Em condições normais, os colangiócitos desempenham funções vitais, incluindo secreção, absorção, reparo de lesões e servindo como barreira imunológica, desempenhando assim um papel crítico na fisiologia e patologia do fígado. No entanto, a disfunção colangiocitária pode levar a várias doenças, incluindo PLD, colangite esclerosante primária, colangiocarcinoma e lesão hepática colestática ^3,4,5.

Dentre as doenças relacionadas à colangiopatia, a PLD destaca-se como uma doença hereditária marcada pela formação de numerosos cistos cheios de líquido originados de colangiócitos. O aumento progressivo desses cistos diminui significativamente a qualidade de vida dos pacientes⁶. As opções atuais de tratamento para PLD permanecem insuficientes, oferecendo eficácia limitada, embora muitas vezes associadas a altas taxas de recorrência e complicações⁷. Isso destaca a necessidade urgente de desenvolver estratégias terapêuticas seguras e eficazes para atender às demandas clínicas não atendidas no gerenciamento de PLD.

A pesquisa sobre os mecanismos das colangiopatias, incluindo PLD, tem sido significativamente prejudicada pela falta de linhagens celulares adequadas. Para resolver essa limitação, o uso de modelos de camundongos com doenças e o isolamento de colangiócitos primários desses modelos para experimentos in vitro provaram ser inestimáveis para descobrir os mecanismos moleculares subjacentes às colangiopatias e identificar possíveis estratégias terapêuticas.

Em nosso estudo recente⁸, estabelecemos com sucesso um modelo de camundongo PLD usando camundongos Pkd1 nocaute condicional (KO). Os cistos hepáticos foram observados 1 mês após a deleção de Pkd1 e aumentaram progressivamente de tamanho ao longo do tempo. Embora os protocolos para isolamento de colangiócitos de ratos e humanos sejam bem documentados ^9,10, o isolamento de colangiócitos primários de camundongos permanece particularmente desafiador devido ao seu pequeno tamanho e à intrincada arquitetura da veia porta e do sistema biliar. Os métodos existentes enfrentam limitações significativas, incluindo baixa pureza celular, baixa viabilidade, procedimentos complexos e altos custos^11,12.

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para isolar colangiócitos primários de alta pureza de camundongos usando um método de digestão em duas etapas. Essa abordagem otimizada visa apoiar estudos in vitro , facilitando a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes às colangiopatias e avançando no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais e de cuidados com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Tianjin (Doc. No: TMUa-MEC 2022016).

1. Preparação de equipamentos e soluções

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças e cabos de bisturi) autoclavando pelo menos 1 dia antes do isolamento celular.
2. Pelo menos 1 dia antes do isolamento celular, prepare o meio de cultura de colangiócitos usando os reagentes listados na Tabela 1. Esterilize o meio de cultura de colangiócitos filtrando-o através de um filtro de 0,22 μm.
3. Pelo menos 1 dia antes do isolamento celular, prepare a Solução A e a Solução B usando os reagentes listados na Tabela 2 para perfusão hepática de camundongos. Esterilize a Solução A e a Solução B autoclavando ou filtrando através de um filtro de 0,22 μm e ajuste seu pH para 7,35 usando NaOH estéril sob agitação suave.
   NOTA: O meio de cultura de colangiócitos, a solução A e a solução B podem ser armazenados a 4 ° C por pelo menos um mês.
4. Antes de iniciar o experimento, adicione o pó de colagenase II à Solução B e misture suavemente para atingir uma concentração final de 0,5 mg / mL. Pré-aqueça a solução A e a solução B em banho-maria a 37 °C antes de usar.
5. Imediatamente antes de iniciar o experimento, prepare pratos de 6 cm cheios de PBS estéril e coloque-os no gelo para mantê-los frios durante o procedimento.

2. Perfusão da digestão do tecido hepático

1. Anestesie o camundongo usando uma overdose de inalação de isoflurano. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal e prenda-o com fita adesiva para facilitar o procedimento.
2. Abra a cavidade abdominal do camundongo após esterilizar o abdômen com etanol a 75% e, em seguida, amarre um nó corrediço ao redor da veia cava inferior usando uma agulha estampada. Enxágue um cateter intravenoso de 24 G com a Solução A usando uma seringa de 20 mL.
3. Insira o cateter intravenoso na veia cava inferior abaixo do nó corrediço, prenda o nó corrediço e fixe o cateter no lugar com fita adesiva.
4. Perfunda o fígado com 50 mL de solução A através da veia cava inferior usando uma seringa de 20 mL e faça uma incisão na veia porta hepática para drenar a solução de perfusão. Mantenha a taxa de perfusão em 10 mL / min.
5. Continue a perfusão com 30 mL de solução B contendo colagenase II a uma taxa de fluxo de 3,5 mL / min usando uma bomba peristáltica.
   NOTA: Esta etapa destina-se à digestão do tecido hepático.
6. Remova o tecido hepático perfundido com sucesso e coloque-o em um prato de 6 cm cheio de PBS estéril frio.

3. Isolamento de colangiócitos

NOTA: Como o número de colangiócitos em camundongos normais é relativamente baixo, recomenda-se o uso de um grupo de 2 a 6 camundongos para o procedimento. No entanto, para modelos de doença de camundongo com proliferação anormal de colangiócitos, como PLD, os colangiócitos de um único camundongo são suficientes. A menos que especificado de outra forma, amostras e reagentes precisam sempre ser mantidos em gelo e todos os procedimentos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica.

1. Dissocie mecanicamente e agite o tecido hepático usando uma pinça curva. Posteriormente, realizar microdissecção sob microscópio de dissecação para remoção das células parenquimatosas aderentes, deixando uma árvore biliar intacta. Remova o tecido da vesícula biliar antes de prosseguir para a próxima etapa.
   Lave o lenço 2x com PBS.
2. Pique finamente a árvore biliar usando uma lâmina cirúrgica e digeri-la em 3 mL de solução de digestão (Tabela 3) por camundongo com agitação (90 rpm) a 37 ° C por 60 min. Na marca de 30 minutos, pipete suavemente a mistura usando uma ponta de pipeta para misturar bem.
   NOTA: A solução de digestão deve ser preparada na hora antes do uso.
3. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm. Use o êmbolo de uma seringa de 5 mL ou 10 mL para pressionar suavemente a suspensão celular através do filtro. Lave o filtro com PBS.
4. Centrifugar a suspensão da célula a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Lave as células 3x com meio RPMI.
5. Centrifugue novamente a 500 x g por 5 min a 4 °C.
6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 900 μl de meio RPMI contendo 40 U/ml de DNase I. Adicionar 2 μg de anticorpo anti-EpCAM e incubar a suspensão num rotador (20 rpm) a 4 °C durante 45 min.
7. Centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio RPMI contendo 40 U / mL DNase I. Pré-lave as esferas de proteína G com 1 mL de meio RPMI. Adicione 20 μL de grânulos de proteína G à suspensão celular e incube com rotação (20 rpm) a 4 ° C por mais 45 min.
   NOTA: O anticorpo anti-EpCAM também pode ser pré-incubado com grânulos de proteína G para criar um complexo de grânulos-anticorpo antes de introduzir a suspensão celular.
9. Lave as células 3x com PBS usando um separador magnético.
10. Realize a contagem de células e a avaliação da viabilidade celular usando a coloração com Trypan Blue (0,04%, 3 min) em um hemocitômetro.
    NOTA: Não há necessidade de remover as esferas dos colangiócitos, elas se desprenderão naturalmente assim que a cultura começar e não interferirão na cultura de células.

4. Cultura de colangiócitos

NOTA: Prepare placas frescas de cultura de células revestidas de colágeno de cauda de rato tipo I antes da cultura de colangiócitos. Pré-resfrie todos os reagentes no gelo.

1. Seguindo as instruções do fabricante, misture ddH_{estéril 2}O, 10x PBS, 1 N NaOH e colágeno de cauda de rato tipo I para atingir uma concentração final de 1 mg/mL de colágeno de cauda de rato tipo I em 1x PBS. Cubra uniformemente as placas de cultura de células com a mistura e coloque-as em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂ por 30 min para permitir que o colágeno se solidifique.
2. Lave as placas de cultura de células revestidas com colágeno de cauda de rato tipo I com PBS pré-aquecido.
3. Ressuspenda os colangiócitos em meio de cultura de colangiócitos pré-aquecido. Semear a suspensão celular em placas de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato tipo I de 1 mg/ml e incubar a 37 °C com CO₂ a 5%. Substitua o meio a cada 2 dias.

5. Passagem e criopreservação de colangiócitos

1. Lave os colangiócitos duas vezes com PBS e, em seguida, incube as células em tripsina a 0,25% a 37 ° C por 5-10 min.
2. Adicione um volume igual de meio de cultura de colangiócitos para neutralizar a tripsina e, em seguida, centrifugue a 500 x g por 5 min.
3. Prepare placas de cultura de células revestidas com colágeno de cauda de rato tipo I conforme descrito na Etapa 4.1.
4. Siga as etapas 4.2 e 4.3.
5. Se a criopreservação for necessária, ressuspenda os colangiócitos em meio de armazenamento (9:1 FBS: DMSO) e armazene em um freezer a -80 °C ou nitrogênio líquido. Descongele as células conforme necessário para uso futuro.

6. Validação de colangiócitos

NOTA: A pureza dos colangiócitos foi avaliada pela coloração do marcador de colangiócitos CK19.

1. Lave os colangiócitos 2x com PBS e, em seguida, fixe as células em paraformaldeído a 4% por 15 min.
2. Lave os colangiócitos com PBS e, em seguida, permeabilize as células com Triton X-100 a 1% por 8 min.
3. Lave os colangiócitos com PBS e, em seguida, bloqueie as células em 5% de BSA por 1 h.
4. Lave os colangiócitos com PBS e, em seguida, incube as células com o anticorpo primário contra CK19 (diluição 1:12 com 2% de BSA) durante a noite a 4 ° C.
5. Lave os colangiócitos 2x com PBS e, em seguida, incube as células com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 anti-rato de burro (diluição 1:1.000 com PBS) por 1 h em temperatura ambiente.
6. Lave os colangiócitos com PBS, cove com 4',6-diamidino-2-fenilindol por 15 min e observe ao microscópio.

Resultados

O diagrama de fluxo de trabalho para o processo de digestão em duas etapas usado para isolar colangiócitos é mostrado na Figura 1. Todo o procedimento leva ~5 h. Primeiro, o fígado é perfundido com a Solução A através da veia cava inferior para remover o sangue, conforme indicado pelo fígado ficando pálido. O fígado é então perfundido com a Solução B contendo colagenase II para iniciar a digestão do tecido. Esta etapa inicial da digestão é sensível ao tempo, ...

Discussão

Este protocolo fornece um método detalhado para isolar colangiócitos primários de alta pureza de camundongos usando um processo de digestão em duas etapas, permitindo o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes às colangiopatias. Várias etapas críticas são essenciais para garantir o isolamento bem-sucedido dos colangiócitos.

O primeiro passo crítico é garantir perfusão e digestão eficazes usando a Solução A e a Solução B. A perfusão bem-sucedida com a Solu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 μ m filtro	PALL	4612
0,25% Tripsina	Gibco	25200-056
Seringa de 10 mL	KONSMED	10 mL 1,2*30TWLB
Seringa de 20 mL	KONSMED	20 mL 1,2*30TWLB
24 G cateter intravenoso	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T5516	1.7 mg/mL estoque
4% paraformaldeído	Solarbio	P1110
seringa de 5 mL	KONSMED	5 mL 0,7*30TWLB
pratos de 6 cm	Thermo Scientific	150462
70 µ filtro de células m	Corning	352350
anticorpo anti-CK19	DSHB	TROMA-III
anticorpo anti-EpCAM	DSHB	G8.8
BSA	Solarbio	A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	estoque de 2 M
Concentrado lipídico quimicamente definido (100x)	Gibco	11905-031
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase XI	Sigma	C7657	3,2 mg/mL estoque
Dexametasona		Sigma D1756	10 mg/mL estoque
Microscópio de dissecação	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μ L stock
Burro anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpo secundário	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (PH = 8) estoque
Fator de crescimento epidérmico (1 mg / mL)	Sigma	SRP3196
Etanolamina	Sigma	E9508
Soro bovino fetal	VivaCell biosciences	C04001-500
Forskolin	Sigma	F3917	20 mM estoque
Solução de gentamicina/anfotericina (500x)	Gibco	R01510
Hemocitômetro	QIUJING	XB. K.25.
HEPES	Sigma	H4034
Hialuronidase	Sigma	H3506	10 mg/mL estoque
Insulina-transferrina-selênio (100x)	Gibco	41400045
Isoflurano	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-Glutamina (200 mM)	Sigma	G7513
Separador magnético	Promega	Z5342
MEM aminoácidos não essenciais (100x)	Gibco	11140050
MEM solução vitamínica (100x)	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	estoque de 1,5 M
Na Pyruvate  (100 mM)	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N stock
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
Penicilina-Estreptomicina (100x)	Gibco	15140-122
Bomba peristáltica	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Grânulos de proteína G	Invitrogen	10004D
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
Inibidor de tripsina de soja	Sigma	T6522	10 mg/mL estoque
Agulha estampada	Jinhuan Medical	HM601
Triton X-100	Solarbio	T8200
Trypan blue	Sigma	T6146	10 mg/mL estoque
Tipo I rabo de rato colágeno	BD	354236