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Geração de Culturas Monoclonais a partir de Wolbachia-infectada com Drosophila melanogaster JW18

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DOI:

10.3791/68207

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27 de junho de 2025

 , 
1Institute of Environmental Sciences, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences, Jagiellonian University, 3Department of Evolution, Ecology and Behaviour, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool

Neste artigo

Resumo

As linhagens celulares são úteis em estudos sobre organismos intracelulares que não podem ser cultivados fora de suas células hospedeiras. Embora as linhagens infectadas com Wolbachia tenham permitido muitas descobertas, a heterogeneidade dentro dessas linhagens pode levar a resultados experimentais variáveis. Apresentamos um protocolo para geração de clones unicelulares e culturas contínuas a partir de células JW18 infectadas com Wolbachia.

Resumo

As linhagens celulares são modelos amplamente utilizados em pesquisas biológicas. Eles são particularmente úteis em estudos de bactérias intracelulares que não podem ser propagadas com eficiência fora dos organismos hospedeiros. Wolbachia, um simbionte intracelular de muitos invertebrados, induz fortes efeitos reprodutivos e antivirais em seus hospedeiros insetos. Células de insetos infectadas com Wolbachia têm sido amplamente utilizadas para estudar fenótipos de Wolbachia. No entanto, essas linhagens celulares geralmente consistem em populações mistas de células com fenótipos e respostas potencialmente variados a tratamentos experimentais. Em particular, foi relatado que as linhagens celulares com Wolbachia exibem taxas de crescimento variáveis e prevalência variável de infecção por Wolbachia de uma passagem para outra. Para remediar isso, geramos linhagens celulares monoclonais a partir da linhagem celular JW18 derivada de Drosophila melanogaster infectada com Wolbachia. Essas linhagens clonais foram estabelecidas em diferentes momentos e mostram diferentes status de infecção por Wolbachia. Essa variabilidade sugere que qualquer tratamento aplicado a uma população parental JW18 pode levar à seleção de subpopulações, em vez de influenciar a fisiologia de toda a cultura. Aqui, apresentamos um protocolo para geração de clones unicelulares e culturas clonais contínuas a partir de células de insetos infectados com Wolbachia, permitindo experimentos mais controlados e reprodutíveis.

Introdução

As células de Drosophila melanogaster são amplamente utilizadas em estudos genéticos, pesquisa de doenças e como plataforma para triagem de medicamentos de alto rendimento1. Eles também são úteis no estudo de um dos micróbios intracelulares mais prevalentes no planeta: a Wolbachia. A Wolbachia é uma bactéria intracelular obrigatória gram-negativa encontrada em 40-70% das espécies de insetos 2,3,4, onde se espalha maternalmente e induz manipulações reprodutivas 5,6,7,8. A Wolbachia também pode fornecer aos hospedeiros infectados proteção antiviral 9,10,11,12,13,14,15 que, juntamente com as manipulações reprodutivas, está sendo explorada para controlar a transmissão de arbovírus de mosquitos para humanos16,17. Em vários sistemas, a Wolbachia demonstrou controlar a apoptose18, fornecer nutrientes essenciais19 e alterar a expressão gênica e proteica 20,21,22,23,24,25.

As linhagens celulares surgiram como um modelo para estudar Wolbachia por causa de sua biologia simples, conveniência e capacidade de se propagar em grandes quantidades. As linhagens celulares provaram ser úteis na pré-adaptação de Wolbachia à simbiose com novos hospedeiros26 e permitindo que Wolbachia acumule mutações27,28. Eles foram usados para rastrear compostos anti-Wolbachia, que podem ser úteis no tratamento de doenças filariais29 e no estudo da interação de tradução Wolbachia-hospedeiro 30. Embora as linhagens celulares sejam indispensáveis em estudos sobre simbioses de Wolbachia 29,30,31, os mecanismos subjacentes à maioria dos fenótipos de Wolbachia permanecem desconhecidos. Isso sugere que o sistema de modelo de cultura de células ainda pode ser melhorado.

As linhagens celulares de insetos infectados com Wolbachia são derivadas de embriões e larvas de insetos. Aa23, derivado de embriões de Aedes albopictus, foi a primeira linhagem estável infectada por Wolbachia 32, posteriormente usada para muitos estudos sobre simbiose de Wolbachia 33,34,35. A linhagem celular JW18 foi uma das primeiras linhagens naturalmente infectadas com Wolbachia geradas a partir de D. melanogaster29,36. Esta linhagem, derivada de embriões de 1 h a 15 h de moscas infectadas com wMel, também serviu como fonte de Wolbachia para outras linhagens celulares de Drosophila: 1182-4H e S2R+37. Como os embriões têm uma alta proporção de células pluripotentes, ao se adaptarem para crescer em plástico, eles podem adquirir novas características, às vezes diferentes para linhagens celulares individuais. Isso pode explicar a heterogeneidade das morfologias celulares e as frequências de infecção por Wolbachia observadas nessas células a qualquer momento e ao longo de gerações29.

A diversidade celular dentro da cultura JW18 levanta preocupações, pois estudos em linhagens de células de mosquitos, como Aag2, mostraram que linhagens celulares monoclonais e parentais podem responder de maneira diferente aos tratamentos devido a variações nas características celulares38. Consequentemente, a administração de tratamentos a uma população de células mistas pode produzir resultados enganosos. Para estudar a resposta de uma população de células homogênea a um tratamento (não seleção para tipos de células individuais), geramos culturas monoclonais a partir da linhagem celular parental JW18. Não houve tentativas anteriores de gerar culturas monoclonais a partir dessas células. O protocolo envolve o isolamento de células únicas da linhagem celular JW18 parental, seguido de sua manutenção e transferência para frascos para estabelecer culturas clonais contínuas. Verificamos o status de infecção por Wolbachia de linhagens individuais, mostrando que elas diferem nessa característica principal. Culturas de células homogêneas são essenciais para garantir a precisão e reprodutibilidade de experimentos futuros.

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho com células vivas e seus meios deve ser realizado em um gabinete de segurança biológica para evitar contaminação.

1. Preparação de mídia

  1. Prepare o meio de cultura fresco suplementando o meio Shield e Sang Insect com 10% de soro fetal bovino (FBS).
  2. Mídia gasta e condicionada
    1. Cultive células JW18 em um frasco de 25 cm2 contendo meio fresco de escudo e inseto Sang suplementado com 10% de FBS a 25 ° C. Incubar até que as células atinjam a confluência (~ 1 semana).
    2. Filtre o meio de cultura de células usado de 1 semana usado para cultivar as células, para remover Wolbachia, detritos celulares e outros contaminantes: use um filtro estéril de 5 μm e, em seguida, um filtro estéril de 0,2 μm instalado em uma seringa de 50 mL.
    3. Prepare o meio condicionado suplementando o meio fresco com 20% do meio gasto. Prepare meio condicionado suficiente para uma placa de 96 poços (~ 30 mL); usando pipeta sorológica, misture 6 mL do meio filtrado com 24 mL de meio fresco Shield e Sang Insect suplementado com 10% de FBS.

2. Preparação da placa de 96 poços

  1. Preparação da suspensão celular JW18
    1. Raspe as células de um frasco confluente de 1 semana usando um raspador de células e ressuspenda-as usando uma pipeta sorológica.
    2. Conte as células usando uma câmara de Neubauer e dilua-as com meio condicionado para atingir uma concentração final de 2 x 103 células / mL.
  2. Adicionando meio condicionado à placa
    1. Transferir o meio condicionado preparado para um reservatório de reagente.
    2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de meio condicionado a cada poço da placa de 96 poços, exceto o poço A1.
  3. Diluição em série da suspensão celular
    1. Adicionar 200 μL da suspensão celular ao poço A1.
    2. Usando uma pipeta monocanal, transfira 100 μL do poço A1 para o poço B1 e misture suavemente (evite bolhas) como na Figura 1A.
    3. Repetir a diluição em série para baixo na coluna 1, rejeitando os 100 μL finais do último alvéolo.
  4. Diluição na placa
    1. Adicionar 100 μL de meio condicionado a cada alvéolo da primeira coluna, até um volume total de 200 μL. Misturar suavemente.
    2. Usando a pipeta multicanal, transfira 100 μL da primeira coluna para a segunda. Misture delicadamente.
    3. Repita esse processo para todas as colunas (1-12) na placa (Figura 1A).
    4. Após a ressuspensão, rejeitar 100 μL da última coluna. Neste ponto, cada poço contém 100 μL de suspensão celular.
    5. Adicione mais 100 μL de meio de cultura a todos os poços, elevando o volume final em cada poço para 200 μL.

3. Identificação de células individuais

  1. Cubra a placa, sele-a com Parafilm e rotule-a adequadamente.
  2. Observe a placa ao microscópio, verificando cuidadosamente cada poço em busca de células individuais (Figura 1B). Certifique-se de escanear os poços e as bordas minuciosamente para confirmar a presença de apenas uma célula.
    NOTA: Esta é uma das etapas mais críticas do protocolo.
  3. Registre o número de poços de células individuais em um mapa de placas de 96 poços (em papel).
    NOTA: É mais provável que células únicas sejam encontradas em poços à direita e ao fundo da placa.
  4. Uma vez identificadas e marcadas as células individuais, conservar a placa numa incubadora a 25 °C. Monitore as células a cada 2 dias.

4. Manutenção e transferência de células

  1. Monitoramento de células
    NOTA: As células JW18 normalmente levam 3 dias para começar a se dividir a partir de uma única célula, e as populações clonais podem crescer em taxas diferentes (Figura 2).
    1. Monitore os poços a cada 2-3 dias quanto à contaminação bacteriana e para garantir que o meio não seque. Se os poços parecerem estar secando, complete-os com meio fresco, conforme necessário.
  2. Expansão celular
    1. Assim que as células atingirem a confluência na placa de 96 poços, transfira-as para uma placa de 24 poços (Figura 1D).
    2. Em seguida, transfira as células para uma placa de 6 poços e, finalmente, para um frasco (Figura 1E, F).
      NOTA: Essa expansão gradual aumenta a probabilidade de estabelecer uma linha celular clonal contínua.
  3. Congelamento de células
    1. Uma vez estabelecida uma cultura clonal, congele uma parte das células para uso futuro.
      1. Raspar as células do balão com um raspador de células e transferi-las para um tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugue a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
      2. Prepare um meio de congelamento 2x (Shield and Sang Insect Medium suplementado com 20% de FBS e 10% de DMSO).
      3. Após centrifugação, rejeitar uma parte do sobrenadante, deixando metade do volume final desejado. Adicione um volume igual do meio de congelamento 2x ao sobrenadante restante e ressuspenda suavemente o pellet usando uma pipeta.
      4. Alicote 1 mL da suspensão em cada 1,5 mL criovial e coloque os frascos no gelo. Armazene os frascos a -80 ° C durante a noite e transfira-os para um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.

5. PCR para confirmar o status de Wolbachia

  1. Extrair o ADN das amostras de cultura monoclonal utilizando o método fenol-clorofórmio39.
    1. Coloque 1 mL de células raspadas e ressuspensas confluentes em meio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue as células a 290 x g por 5 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante (meio de cultura celular) e colocar o tubo no gelo.
    2. Adicione 250 μL de solução A, que consiste em 0,1 M Tris HCl (pH 9,0), 0,1 M EDTA e 1% de SDS. Ressuspender as células e incubar a 70 °C durante 30 min num bloco de aquecimento.
    3. Após a incubação, adicione 35 μL de acetato de potássio 8 M, agite o tubo suavemente (evite vórtices) e incube no gelo por mais 30 min.
    4. Gire a 13.000 rpm por 15 min a 4 ° C, transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicione um volume igual de fenol-clorofórmio. Agite bem e gire novamente, repetindo esta etapa uma vez.
    5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione 150 μL de isopropanol, agite e gire a 10.000 rpm por 5 min. Remova o sobrenadante com cuidado, lave o pellet com 1 mL de etanol a 70% e gire a 13.000 rpm.
    6. Depois de secar o pellet por 10 min à temperatura ambiente, ressuspendê-lo em 100 μL de tampão TE. Quantificar o ADN e conservar a -20 °C.
  2. Realize uma PCR convencional com o DNA extraído das amostras de cultura monoclonal para detectar Wolbachia usando a mistura mestre de PCR DreamTaq Green. Use os primers wsp 81F e wsp 691R40 para Wolbachia e Drosophila rpl32 primers41 para controle de qualidade do DNA.
    1. Adicione 7,5 μL de master mix, 0,5 μL de cada primer a 10 μM, 1 μL de DNA diluído 1:50 e 5,5 μL de água de grau molecular para obter 15 μL da mistura de reação.
    2. Use o seguinte programa de PCR: 94 °C por 4 min, 30 ciclos x (94 °C por 40 seg, 55 °C por 40 seg, 72 °C por 30 seg), 72 °C por 10 min. Pós-PCR, salvar as amostras a 4 °C.
  3. Realizar eletroforese em gel de agarose em gel de agarose a 2% em tampão TAE a 90 V com os produtos de PCR obtidos para visualizar as bandas. Adicione uma escada de DNA ao lado para identificar as bandas para wsp (632 pb) e rpl32 (194 pb).

6. Coloração FISH para visualizar a infecção por Wolbachia em linhagens celulares

  1. Realize hibridização fluorescente in situ (FISH) conforme descrito no protocolo Stellaris FISH para que as células aderentes corem Wolbachia com o conjunto de sondas FISH de 16s marcado com Quasar 670. Manchar os ácidos nucleicos com Hoechst 33342.
    NOTA: Este conjunto de sondas foi projetado com base na sequência wMel 16S rDNA e corresponde ao conjunto de sondas publicado em Schneider et al.42 (consulte a Tabela Suplementar S1).
    1. Prepare os reagentes (tampão de fixação, tampão de hibridização, tampão de lavagem A e B, conjunto de sondas personalizadas reconstituídas) seguindo as instruções do fabricante43.
    2. Cultive células aderentes em vidro de cobertura redondo de 18 mm esterilizado com etanol a 70% em placa de cultura de 24 poços. Assim que as células atingirem a confluência desejada, aspire o meio de crescimento e lave com 1 mL de 1x PBS. Adicione 1 mL de tampão de fixação e incube em temperatura ambiente por 10 min. Lave as células duas vezes com 1 mL de 1x PBS.
    3. Permeabilizar imergindo a lamínula com células em 1 mL de etanol a 70% e incubar durante a noite a 4 °C; Armazene as amostras em etanol a essa temperatura por até 1 semana antes da hibridização. Aspirar o etanol e adicionar 1 ml de tampão de lavagem A; Incube em temperatura ambiente por 2-5 min.
    4. Prepare uma câmara umidificada colocando uma toalha de papel saturada de água e uma camada de Parafilm em uma placa de cultura de 150 mm. Pipetar 100 μL de tampão de hibridização contendo 1 μL de estoque de sonda de 12,5 μM no Parafilm. Inverta suavemente a lamínula, colocando as células voltadas para baixo na gota do tampão de hibridização. Cobrir e selar a câmara com Parafilm e, em seguida, incubar no escuro a 37 °C durante pelo menos 4 h (até 16 h, se necessário).
    5. Após a hibridização, transfira cuidadosamente as células de vidro de cobertura para um poço fresco contendo 1 mL de tampão de lavagem A e incube a 37 ° C por 30 min. Aspire o tampão e adicione 0,5 μL de estoque Hoechst 20 mM a 700 μL de tampão de lavagem A; incubar a 37 °C durante 30 min no escuro.
    6. Remova a solução Hoechst e adicione 1 mL de tampão de lavagem B; Incube em temperatura ambiente por 2-5 min. Finalmente, coloque uma pequena gota (10 μL) de meio de montagem em uma lâmina de microscópio e monte as células de vidro de cobertura com o lado voltado para baixo na gota. Absorva suavemente o excesso de meio de montagem e sele o perímetro da tampa de vidro com esmalte transparente.
    7. Armazene as lâminas a 4 °C e proceda à imagem o mais rápido possível.
    8. Processe as imagens usando ImageJ44. Divida os canais e altere a paleta de cores conforme necessário.

Resultados

Visualizamos o processo de estabelecimento de culturas monoclonais com microscopia de luz desde o dia de preparação da suspensão e plaqueamento unicelular (dia 0) até o estabelecimento de linhagens celulares contínuas (dia 45 ou 77, Figura 2). Os primeiros sinais de divisão celular foram observados no dia 3 (4 dias após o plaqueamento, pois o plaqueamento foi realizado no dia 0) quando já havia quatro células por poço (Figura 2). No dia 14, os clones cresceram como uma monocamada (JW18-B9, C7 e E5) ou uma esfera (JW18-G4), que foi interrompida durante a passagem. No dia 28, as diferenças no crescimento entre as linhagens celulares foram mais óbvias. A cultura JW18-C7 foi confluente no dia 45, enquanto as demais culturas clonais foram estabelecidas apenas no dia 77. Também visualizamos as quatro culturas diferentes 30 passagens pós-estabelecimento para capturar diferenças nas morfologias celulares (Figura 3).

Para determinar o status de infecção por Wolbachia das culturas monoclonais, realizamos PCR (Figura 4) e FISH (Figura 5). Observamos que todos, exceto um clone (JW18-C7), produziram uma banda para o gene wsp , indicativo de uma infecção por Wolbachia . FISH corroborou os resultados da PCR: os clones JW18-B9, JW18-E5 e JW18-G4 retiveram a infecção por Wolbachia , enquanto o clone JW18-C7 não apresentou Wolbachia. No geral, a partir de uma população mista de células JW18, fomos capazes de estabelecer quatro culturas clonais, três das quais mantiveram a infecção original por Wolbachia . Os dados brutos podem ser acessados no Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.

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Figura 1: Fluxo de trabalho para geração de cultura monoclonal. (A) Diluições primárias e secundárias na placa de 96 poços. (B) Células individuais pós-diluição serial. (CE) Progressão na multiplicação de células e transferência de placas de 96 poços para 24 e 6 poços, respectivamente. F) Culturas contínuas em balões de 25 cm para cultura de2 células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Progressão das linhagens clonais JW18 de cultura unicelular para multicelular. Imagens de campo claro de linhas clonais do dia 0 (dia do plaqueamento) ao dia 77, quando todas as linhas foram estabelecidas com sucesso em um frasco de cultura de2 células de 25 cm. Barras de escala = 25 μm (dia 0), 50 μm (dia 3), 150 μm (dia 14), 300 μm (dias 28, 45, 77). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Morfologia de linhagens clonais individuais de JW18. Imagens de campo claro de linhas clonais mostrando morfologias celulares na passagem 30 após o estabelecimento. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Status de Wolbachia de culturas clonais examinadas por PCR. PCR para Wolbachia na linhagem de células parentais JW18 e linhas clonais JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 e JW18-G4 na passagem 11 após o estabelecimento. A banda Wolbachiawsp confirma a presença de Wolbachia, enquanto a banda Drosophilarpl32 é uma PCR de controle de qualidade de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Status de Wolbachia de culturas clonais examinadas por FISH. Linha de células parentais JW18 e clones JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualizados por coloração FISH na passagem 13 após o estabelecimento. A Wolbachia é corada com a sonda 16s rRNA Stellaris FISH marcada com Quasar 670 em magenta, e os ácidos nucléicos são corados com Hoechst 33342 em ciano. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Sondas de oligonucleotídeos projetadas contra Wolbachia wMel 16S rDNA e sua comparação com as sondas publicadas por Schneider et al.42. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Aqui, descrevemos um método padronizado para gerar clones de célula única a partir da linha celular JW18 D.melanogaster, que pode ser aplicado a outras linhagens celulares de Drosophila e insetos. O protocolo envolve a diluição em série de uma suspensão celular preparada em uma placa de 96 poços para isolar células individuais. Essas células são então incubadas em condições ideais para estabelecer culturas contínuas. O protocolo também inclui a adição de 20% de meios condicionados para promover a sobrevivência celular e a divisão de uma única célula45,46.

Uma etapa crítica do protocolo é verificar a presença de uma única célula em cada poço após a diluição em série. Esta etapa requer atenção meticulosa, pois é essencial para o sucesso de todo o protocolo. Para facilitar a confirmação futura da origem unicelular, recomenda-se capturar imagens dos poços selecionados de vários ângulos.

Outra etapa importante envolve a transferência de células entre placas de cultura. Para garantir o estabelecimento bem-sucedido de uma cultura contínua, as células só devem ser transferidas depois de atingirem a confluência. Se o crescimento celular estagnar por mais de duas semanas, a atualização do meio pode promover um maior crescimento. A transferência prematura de células antes da confluência pode resultar em morte celular.

Embora esse protocolo seja mais demorado e trabalhoso do que outros métodos comumente usados, como a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) 38 , 46 , ele oferece várias vantagens. Isso inclui custo-benefício, risco mínimo de danos às células, sem necessidade de marcadores fluorescentes, equipamentos caros e tempo de otimização. No geral, este protocolo é adequado para gerar populações homogêneas de células de insetos a partir de linhas celulares contínuas.

Propriedades das culturas monoclonais

Nossos resultados mostram que as culturas monoclonais diferem em termos de velocidade de estabelecimento e status de infecção por Wolbachia (Figura 2, Figura 4 e Figura 5). O clone JW18-C7 livre de Wolbachia foi o mais rápido a atingir a confluência em nosso protocolo de isolamento de célula única. A Wolbachia pode ter estado sempre ausente desta linhagem celular ou pode ter sido perdida devido à incapacidade de acompanhar a taxa de divisão da célula hospedeira. Também pode ter sido perdido devido à baixa densidade celular inicial em nosso protocolo de clonagem. No entanto, como isso não aconteceu para as outras linhagens celulares clonais, consideramos isso improvável. A infecção experimental de JW18-C7 com Wolbachia (ao lado de outros clones tratados com tetraciclina) poderia responder se essa linha é permissiva ao simbionte.

A heterogeneidade celular não é exclusiva da linhagem celular JW18 e já foi relatada antes para outras linhagens celulares infectadas com Wolbachia 32,47,48,49,50,51,52. Uma tentativa anterior de sua melhoria envolveu uma transferência de Wolbachia de ovos de D. simulans ou células Aa23 para uma linha celular C7-10 A. albopictus 53. C7-10 foi clonado muitos anos antes das transferências de Wolbachia 54,55, e as transferências não constituem a infecção natural que pretendemos estudar.

A diferença no status de infecção por Wolbachia e no tempo de estabelecimento da cultura monoclonal (indicativo de diferenças na taxa de divisão celular) para clones individuais de JW18 pode ter implicações profundas para estudos anteriores que ligam o título de Wolbachia e a taxa de crescimento de células de insetos em resposta a tratamentos específicos. Números de células alterados, densidades de simbiontes ou mudanças na expressão gênica após o tratamento podem resultar da seleção de tipos de células com propriedades específicas, em vez de mudanças no estado de todas as células em uma população mista. A administração de tratamentos a uma população de células mistas com a variabilidade nas principais características pode, portanto, produzir resultados tendenciosos e irreprodutíveis.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a William Sullivan (Universidade da Califórnia, Santa Cruz, EUA), Laura Serbus (Universidade Internacional da Flórida, EUA) e Luis Teixeira (Universidade Católica Portuguesa, Lisboa, Portugal) pela linhagem celular JW18 e sugestões úteis sobre como trabalhar com ela. Somos gratos a Nidhi Krishna Shrivastava (Universidade Jaguelônica, Cracóvia, Polônia) por sugestões úteis sobre o protocolo. Agradecemos a Yuliya Chykunova (Universidade Jaguelônica, Cracóvia, Polônia) pela revisão do manuscrito.

A Figura 1 foi criada com BioRender (Chrostek, E. (2024) https://BioRender.com/o69b306).

Este trabalho é apoiado pela ERC Starting Grant (Grant agreement ID: 101040311) concedida à EC e bolsa de doutorado da Escola de Doutorado em Ciências Exatas e Naturais (Jagiellonian University) concedida à NF. As opiniões expressas são, no entanto, apenas dos autores e não refletem necessariamente as da União Europeia ou da Agência de Execução do Conselho Europeu de Investigação. Nem a União Europeia nem a autoridade que concede o auxílio podem ser responsabilizadas por eles.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ M Seringa Fliter   TPP99722Estéril
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific70011044Estéril
Cobertura de lamínula redonda de 12 ou 18 mm Qualquer marca
Tubos Falcon de 15 mLGenoplast601052Estéril
Placa de 24 poçosCytoOneCC7682-7524Cultura de tecidos tratada
5 µ Filtro de seringa MO que homem10462000Estéril
Placa de 6 poçosCytoOneCC7682-7506Cultura de tecidos tratada
Placa de 96 poçosCytoOneCC7682-7596Cultura de tecidos tratada
AgaroseThermoFisher ScientificJ66501.30
Balão de cultura de células de 25 cm2Greiner Bio-one391-3103Estéril
Raspadores de células Greiner Bio-one391-3010Estéril
Esmalte transparente Qualquer marca
Frascos CryoPureSarstedt72.379Estéril
DMSO, grau de cultura celularMerckD2650-100MLEstéril
DreamTaq PCR Master MixThermoFisher ScientificK1081
EDTAMerck324503-100GMEstéril
Fonte de alimentação de eletroforeseMerckPS 251-2
Eppendorf  Concentrador PlusMerckEP5305000509Concentrador de vácuo de qualquer marca pode ser usado em seu lugar. 
EtanolMerck1009861000
Sistema de imagem EVOS M5000ThermoFisher ScientificAMF5000Microscópio invertido de qualquer marca pode ser usado para monitorar a progressão do clone. O microscópio fluorescente é necessário para visualizar o FISH. 
Soro fetal bovinoMerckF9665Inativado por calor
Formaldeído ThermoFisher Scientific047377.9L
Formamida MerckF7503-100ML
Tanques de eletroforese em gelCutelo CientíficoMSMIDI
Gerador de imagens em gelBioRad12009077Sistema de imagem em gel GelDoc Go
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermoFisher ScientificSM0243
Bloco de aquecimentoThermoFisher Scientific88870005
Gabinete de Segurança Biológica Herasafe 2025 Classe IIThermoFisher Scientific51033314O armário de segurança biológica de qualquer marca pode ser usado desde que mantenha o ambiente estéril no interior.
Solução Hoechst 33342 (20 mM) 5 mLThermoFisher Scientific62249Armazene no escuro.
Ácido clorídricoMerck258148-2.5L
Integra Biosciences Corp  PIPETBOY acu 2 Pipet AidFisher CientíficoNC0085686Pode ser usado um controle de pipeta sorológica de qualquer marca. 
IsopropanolMerckI9516-1L
Freezer de laboratório  Liebherr LGUex 1500 MediLineQualquer freezer capaz de manter a temperatura constante é adequado. 
Tanque de nitrogênio líquidoThermoFisher ScientificCY50985
Lâminas de microscópioMerckCLS294875X25-72EA
Água de grau molecular
Pipeta multicanalEppendorf3125000036
NanodropPeqlabND-1000
Hemocitômetro NeubauerMerckBR717810-1EA
Parafilme  Filme de vedação MMerckHS234526B-1EA
Incubadora refrigerada a peltierMemmertIPP55plusAlguma incubadora capaz de manter 25 constantes? C é adequado. Nenhum controle de CO2 é necessário para a linhagem celular JW18 ou seus clones.
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)ThermoFisher Scientific327115000
Conjunto de pipetasEppendorfEP2231300008
Acetato de potássioMerckPág. 1190-500GEstéril
Quasar  Sonda 16s rRNA FISH marcada com 670 pôrTecnologias de BiopesquisaSequências personalizadas das sondas podem ser encontradas na Tabela 1. 
MicroCentrífuga RefrigeradaContato LabnetC2500-R
rpl32 primer para a frente 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'Genômica da EurofinsFeito sob medida com base na referência citada no artigo
rpl32 primer reverso 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'Genômica da EurofinsFeito sob medida com base na referência citada no artigo
SDSThermoFisher ScientificAM9823Estéril
Pipetas sorológicasCorning357771
Escudos e Sang M3 Inseto MédioMerckS8398Estéril
Tampão de Hibridização Stellaris RNA FISH   Tecnologias de BiopesquisaSMF-HB1-10Estéril
Tampão de Lavagem Stellaris RNA FISH A     Tecnologias de BiopesquisaSMF-WA1-60Estéril
Buffer de Lavagem de Peixe RNA Stellaris B     Tecnologias de BiopesquisaSMF-WB1-20Estéril
Reservatórios de Reagentes Estéreis ThermoFisher Scientific8094Estéril
Tampão TAEMerck10617410001x 
Buffer TE Merck93283Estéril
TermocicladorSyngen BiotechTermobloco 96Termociclador de qualquer marca pode ser usado em seu lugar. 
Base TrisMerck10708976001Estéril
Congelador de temperatura ultra baixaCorporação PHC MDF-DU502VH-PEQualquer freezer de laboratório capaz de manter -80? C pode ser usado.
Meio de Montagem Vectashield     Laboratórios de vetoresH-1000-10
wsp primer para a frente 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'Genômica da EurofinsFeito sob medida com base na referência citada no artigo
wsp primer reverso 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'Genômica da EurofinsFeito sob medida com base na referência citada no artigo

Referências

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