Transformação Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens em Solanum nigrum

Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado do método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir Solanum nigrum transgênico.

Resumo

Solanum nigrumé um parente órfão da batata e do tomate, e seu fruto fresco é uma baga nutritiva e deliciosa. Toda a planta de S. nigrum pode ser usada como remédio. No entanto, o S. nigrum selvagem abriga algumas características indesejáveis. Felizmente, as técnicas de engenharia genética, especialmente as tecnologias de edição de genes como CRISPR / Cas9, oferecem oportunidades valiosas para melhorar rapidamente o S. nigrum , abordando essas deficiências. Na maioria das plantas, o melhoramento das plantas por meio da tecnologia de edição de genes é obtido por meio da transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Neste artigo, detalhamos os protocolos de transformação genética mediados por A. tumefaciens em S. nigrum. Os cotilédones e hipocótilos de mudas de S. nigrum foram utilizados como explantes para transformação genética. Como o S. nigrum é resistente à canamicina, o gene DsRed foi usado como marcador visual para identificar plantas transgênicas. A transformação genética de S. nigrum pode ser concluída de forma eficiente de acordo com esses protocolos de operação. A detecção de plantas transgênicas T1 pode ser identificada diretamente pela emissão de fluorescência vermelha, sem a necessidade de identificação por PCR.

Introdução

Solanum nigrum (conhecido como erva-moura, 2n = 6x = 72) é um parente solanáceo da batata e do tomate¹. O fruto é uma baga esférica que fica preta após o amadurecimento. A fruta fresca é uma baga nutritiva e deliciosa. Toda a planta de S. nigrum pode ser usada como remédio, com os efeitos de dispersar a estase sanguínea, reduzir o inchaço, limpar o calor e desintoxicar. S. nigrum sintetiza duas classes distintas de metabólitos especializados a partir de um precursor comum do colesterol: saponinas esteróides em suas folhas e glicoalcalóides esteróides (SGAs) em suas bagas. O uttrosídeo B, uma saponina esteróide derivada de S. nigrum, foi recentemente aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA como medicamento órfão para o tratamento do carcinoma hepatocelular². O nocaute do gene GAME15 em S. nigrum resultou em plantas sem saponinas e alcalóides esteróides, e também revelou que as saponinas esteróides controlam pragas graves de insetos agrícolas². Os polifenóis em S. nigrum reduzem o peso e a gordura corporal, afetando os adipócitos e o metabolismo lipídico³. S. nigrum pode enriquecer cádmio e é usado como planta modelo para estudar o enriquecimento de cádmio ^4,5. S. nigrum é uma planta não domesticada e sua base de pesquisa é relativamente fraca. É inspirador que a pesquisa sobre S. nigrum tenha aumentado gradualmente nos últimos anos. O genoma do hexaplóide S. nigrum foi recentemente montado, e S. nigrum pode ter evoluído de seu diplóide Solanum americanum (2n = 2x = 24)^6,7. Portanto, S. nigrum é uma planta que possui valor medicinal e comestível. A pesquisa sobre S. nigrum não apenas contribui para uma compreensão mais profunda de suas aplicações potenciais no tratamento de doenças humanas, mas também fornece informações valiosas sobre o aprimoramento da produção agrícola. Assim, o estabelecimento de um sistema de transformação genética em S. nigrum é a base para o melhoramento genético por meio da tecnologia transgênica e de edição de genes.

Existem vários relatos que enfocam a transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens de S. nigrum 8,9,10,1 ¹. Em nosso trabalho anterior, estabelecemos um sistema de transformação genética mediado por A. tumefaciens LBA4404 para S. nigrum, e transformamos AcMYB110 em S. nigrum, obtendo novos germoplasmas de S. nigrum com maior teor de antocianinas¹. Plantas transgênicas e editadas por genes de S. nigrum foram obtidas com A. tumefaciens EHA105 Diferentes proteínas fluorescentes têm emissões de fluorescência verde, vermelha, amarela, laranja e azul e são amplamente utilizadas na indicação de atividades de vida celular¹². No processo de transformação genética das plantas, os genes fluorescentes vermelhos são frequentemente usados como genes repórteres para distinguir eventos geneticamente modificados de eventos não geneticamente modificados¹³. O uso do gene DsRed como gene repórter permite a discriminação conveniente de eventos transgênicos, enquanto o uso do fator de transcrição R2R3-MYB como gene repórter pode ser influenciado pelo genótipo das plantas¹⁴. Na progênie transgênica, as plantas transgênicas também podem ser facilmente distinguidas das plantas não transgênicas usando instrumentos ópticos (por exemplo, microscópios de fluorescência ou sistemas de imagem), eliminando a necessidade de identificação baseada em PCR. Ao integrar o gene repórter de proteína fluorescente com a tecnologia de edição de genes CRISPR, os genes de fertilidade no milho foram excluídos com precisão, resultando na criação de uma linha nuclear estéril e uma linha de manutenção nuclear estéril controlada¹⁵. A autopolinização e frutificação das plantas mantenedoras produzirá descendentes 1:1 de linhagens mantenedoras e estéreis. Com base em diferentes características luminescentes, a classificação não destrutiva de sementes mantenedoras e estéreis pode ser alcançada por meio de reconhecimento visual ou de máquina¹⁵. Assim, empregar o gene da proteína fluorescente como um gene repórter simplifica a identificação de sementes ou plantas transgênicas sem a necessidade de análise de PCR. Isso representa uma vantagem significativa no campo da transformação genética. Este método tem como objetivo descrever o protocolo de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens em S. nigrum, utilizando o gene fluorescente vermelho, DsRed, como gene repórter.

Protocolo

1. Cultivo asséptico de mudas

NOTA: As etapas a seguir são executadas em uma bancada super limpa.

1. Colete sementes selvagens de S. nigrum na cidade de Liaocheng, China, e nomeie-as Snlc1. Pegue 50 sementes selvagens de S. nigrum e coloque-as em um tubo de centrífuga de 2 mL. Após imersão em 1 mL de giberelina a 5% por 30 min, descarte a solução de giberelina.
2. Adicione 1 mL de etanol a 75%, agite por 1 min e descarte o etanol.
3. Adicione 1 mL de solução de hipoclorito de sódio a 2% e desinfete a superfície das sementes por 10 min. Agite bem o tubo da centrífuga para esterilizar a superfície da semente. Após 10 min, descarte o hipoclorito de sódio.
4. Lave as sementes 5x com água esterilizada para remover o hipoclorito de sódio residual. Colocar as sementes em placas de Petri com um diâmetro de 90 mm contendo 1/2 MS de meio sólido. Cultivar as placas numa câmara de crescimento vegetal sob um fotoperíodo de 16 h de luz / 8 h de escuridão a 25 °C (figura 1A).

2. Cultura de A. tumefaciens LBA4404

1. Transforme o vetor binário pRed1305¹⁶ abrigado com um gene fluorescente vermelho, DsRed2, em A. tumefaciens LBA4404 por eletroporação com MicroPulser com parâmetros: Tensão 1800 V, Capacitância 25 μF, Resistência 200 Ω, Cubeta 1 mm. Cultivar as bactérias em meio LB sólido com 50 mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina a 28 °C durante 48 h.
2. Pegue um clone de LBA4404 contendo pRed1305 e cultive-o em 1 mL de meio LB líquido com 50 mg / L de canamicina e 50 mg / L de rifampicina em um tubo de centrífuga de 15 mL em um concentrador de mesa com 180 rpm a 28 ° C por 12 h.
3. Adicionar 50 ml de LB líquido com o mesmo antibiótico a 1 ml de solução bacteriana e, em seguida, cultivar num concentrador de mesa a 200 rpm a 28 °C durante 6 h.
4. Pare de cultivar quando o OD₆₀₀ do meio de cultura bacteriano for 0,4 e, em seguida, centrifugue a solução bacteriana a 2200 x g por 10 min a 25 ° C.
5. Ressuspender as bactérias centrifugadas com solução de infecção (IS: M519 4,43 g/L, sacarose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) e ajustar a concentração da solução bacteriana para OD₆₀₀ = 0,6 com um espectrofotômetro.

3. Infecção por explante com A. tumefaciens

NOTA: As etapas a seguir são executadas em uma bancada super limpa.

1. Cultive as sementes por 7 dias até que os cotilédones da muda se desdobrem (Figura 1B). Corte os dois cotilédones e o hipocótilo com um comprimento de aproximadamente 1 cm das mudas com um bisturi esterilizado e afiado em uma placa de cultura com papel de filtro umedecido com IS bacteriano e descarte as raízes primárias. Tenha cuidado ao usar um bisturi.
2. Infundir os explantes na solução de infecção por 30 min. Coloque os explantes em papel de filtro seco para permitir que a solução bacteriana na superfície do explante seja absorvida.
3. Colocar os explantes em meio sólido IS (0,7% Agar; Figura 1C). Colocar os explantes numa câmara de crescimento sem luz a 19 °C e cultivar durante 3 dias.

4. Diferenciação de explantes

NOTA: As etapas a seguir são executadas em uma bancada super limpa.

1. Retirar os explantes da câmara de crescimento vegetal a 19 °C. Lave os explantes com água esterilizada 5x e coloque-os em papel de filtro seco e esterilizado.
2. Coloque os explantes em meio de diferenciação de brotos (SD) (SD: M519 4,43 g / L, sacarose 30 g / L, 6-BA 2 mg / L, ZT 0,5 mg / L, Cef 100 mg / L, Carb 100 mg / L, 0,7 g / L Agar, pH 5,8) e cultive a 25 ° C por 4 semanas ( Figura 1D , E ).
3. Cortar os calos/botões dos explantes que apresentem fluorescência vermelha sob a luz verde de excitação de uma lâmpada fluorescente portátil utilizando um bisturi e, em seguida, transferi-los para um novo meio SD e continuar a cultura durante 4 semanas a 25 °C (figura 1F,G).

5. Enraizamento e transplante

1. Corte os botões que apresentam fluorescência vermelha com uma lâmpada fluorescente portátil, transfira-os para o meio de enraizamento (RM: M519 4,43 g/L, sacarose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) e cultive-os por 2-4 semanas a 25 °C para promover a produção de raízes.
2. Transplante as mudas com fluorescência vermelha com comprimento de raiz superior a 2 cm para o solo (Figura 1H-K). Antes do transplante, remova o ágar das raízes com a mão para evitar o crescimento excessivo de bactérias nas raízes.

6. Testando plantas T0 geneticamente modificadas com amplificação por PCR

1. Extrair o ADN genómico de uma linha transgénica independente utilizando o método do brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB)¹⁷.
2. Amplificar o gene DsRed com conjunto de primers, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') e RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') usando 10 ng de DNA genômico como modelo em um volume de reação de 15 μL contendo 7,5 μL de 2x PCR Master Mix e 0,3 μL de cada primer (10 μmol/L). O fragmento de DNA esperado era de 393 pb. Submeta os produtos de PCR a eletroforese em gel de agarose a 1% para determinar se são plantas transgênicas.

7. Identificação de plantas transgênicas da geração T1 com lâmpada fluorescente

1. Colha o fruto das plantas transgênicas T0 de S. nigrum que ficaram completamente preto-púrpura e, em seguida, esprema as sementes dentro da fruta com a mão. Seque naturalmente as sementes ao ar livre em temperatura ambiente por cerca de 1 semana.
2. Cultive as sementes secas em meio 1/2 MS de acordo com as etapas 1.1 a 1.4 deste protocolo e coloque em uma câmara de crescimento de plantas por 1 semana. Distinga mudas transgênicas e não transgênicas com uma lâmpada fluorescente portátil.

Resultados

Transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens para produção de S. nigrum transgênico.
Depois de infectar os cotilédones e hipocótilos de plântulas de S. nigrum com A. tumefaciens, pudemos determinar se a infecção por Agrobacterium foi bem-sucedida, uma vez que o DsRed foi usado como gene repórter. A fluorescência vermelha apareceu no ...

Discussão

Até o momento, métodos de transformação genética para S. nigrum mediada por A. tumefaciens foram estabelecidos em diferentes laboratórios 8,9,10,11. A maioria desses métodos de transformação usa canamicina como substância de seleção 8,9,10,11.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2X SanTaq PCR Master Mix (com corante azul)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B532061	A mistura de PCR 2X SanTaq inclui MgCl?, dNTPs, Taq DNA polimerase, tampão de PCR, corante de carga e intensificador de PCR.
6-BA	Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.	C14819266	Citocininas artificiais
Agar	Tianjin Damao Reagente Químico Parceria Empresa (Parceria Limitada)	CAS NO: 9002-18-0	Sólidos
AS	Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.	K914BA0002	Induzir a expressão eficiente de Agrobacterium
Carb	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Antibiótico
Cef	Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.	I526BA0010	Antibiótico
giberelina	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	K514BA0009	Promove a germinação de sementes
kanamycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	I614BA0013	Antibiótico
LB meio	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113	Cultive a bactéria
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)	Bio-Rad, US	617BR1 06783	Gene Pulser Xcell
MS solid medium	phytotech Co., Ltd., US	HCA0519228A	Murashige & Skoog Basal Medium com vitaminas, caixa de plástico M519
	LiaoSu, China	T909H	Caixa de plantio de
plantas rifampicina	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	S180305	Antibiótico
sacarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Nº CAS: 57-50-1	Como fonte de carbono
Tanon-5200Multi máquina	Tanon Co., Ltd., China	5200Multi	Separação acelerada
selvagem Solanum nigrum			coletado na cidade de Liaocheng
ZT	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	J921BA0014	Reguladores de crescimento vegetal