Artigo de método

Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

DOI:

10.3791/68217

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16 de maio de 2025

 ,  , 
1Department of Life Sciences, School of Agriculture, Meiji University, 2Organization for the Strategic Coordination of Research and Intellectual Properties, Meiji University, 3Plant Functional Biotechnology, Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

Resumo

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Nas sementes de Arabidopsis , o endosperma, uma única camada de células vivas localizada entre o embrião e a testa, desempenha um papel crítico na regulação da maturação, dormência e germinação das sementes. A análise microscópica das células intactas do endosperma é essencial para a compreensão das funções fisiológicas do endosperma nos níveis celular e molecular. No entanto, a preparação da amostra tem sido um desafio devido ao pequeno tamanho das sementes de Arabidopsis e à localização da camada de células do endosperma abaixo da testa. Este artigo detalha a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma adequadas para observação e análise microscópica em sementes em desenvolvimento e maduras. Este método permite a observação de grandes áreas e numerosas células intactas do endosperma sem a necessidade de fixação ou secção. Além disso, o protocolo utiliza apenas equipamentos de laboratório padrão, como agulhas de injeção, pinças de precisão e microscópios estereoscópicos. Essa abordagem permite com sucesso imagens de células vivas de alta resolução de sinais fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP), em células de endosperma intactas. Este método permite a observação da localização intracelular e do movimento de várias proteínas, bem como a morfologia das organelas, nas células do endosperma de diferentes mutantes de Arabidopsis . Este protocolo contribui para a elucidação de novas funções do endosperma e expande o potencial para estudos celulares e moleculares deste tecido essencial.

Introdução

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Como as plantas são organismos sésseis, a germinação das sementes é um evento crucial que determina seu destino. A decisão de germinar é estritamente regulada por fatores internos e ambientais, como níveis de dormência da semente primária, temperatura, intensidade de luz e comprimento de onda e concentração de nitrogênio 1,2,3,4,5,6. As sementes têm estruturas complexas que consistem em vários tipos de tecidos7. Nas sementes secas de Arabidopsis, o embrião, que se desenvolve em uma muda, é circundado por uma única camada de endosperma e as camadas mais externas, a testa. A testa é composta por várias camadas de células mortas, enquanto o embrião e o endosperma permanecem vivos mesmo em sementes secas. O endosperma é comumente considerado como um tecido de armazenamento que fornece nutrientes para o crescimento embrionário e, juntamente com a testa, confere resistência mecânica à protrusão da radícula 8,9,10,11,12,13.

Vários estudos recentes demonstraram que o endosperma desempenha um papel essencial na regulação da germinação ideal das sementes 14,15,16,17. Por exemplo, o fotorreceptor fitocromo B (PHYB) nas células do endosperma detecta luz vermelha (R) ou vermelha distante (FR), regulando as respostas de germinação15. O endosperma também funciona como um tecido sensível à temperatura, suprimindo as respostas de germinação sob altas temperaturas16. O controle de qualidade do endosperma é fundamental para a germinação ideal das sementes, particularmente em sementes armazenadas a longo prazo17.

A imagem de células vivas agora é necessária para elucidar ainda mais as funções fisiológicas do endosperma. A análise microscópica de células intactas do endosperma que expressam proteínas marcadas com fluorescência permite a investigação dos mecanismos moleculares pelos quais o endosperma regula a germinação das sementes. No entanto, preparar células de endosperma intactas para observação microscópica é um desafio, particularmente em sementes de Arabidopsis . As sementes têm aproximadamente 0,4 mm de diâmetro e o endosperma é uma camada unicelular localizada entre o embrião e a testa, dificultando a manipulação precisa. Consequentemente, apesar de seus importantes papéis fisiológicos, o endosperma raramente foi observado usando imagens de células vivas.

Este artigo apresenta um protocolo para a preparação rápida de amostras intactas da camada de células do endosperma adequadas para imagens de células vivas em sementes em desenvolvimento e maduras.

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Protocolo

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Neste estudo, dois procedimentos diferentes foram estabelecidos para a preparação de amostras vivas da camada de células do endosperma: um para o desenvolvimento de sementes e outro para sementes maduras. Abordagens ligeiramente diferentes são necessárias dependendo da solidez do testa. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de amostras de endosperma intactas de sementes em desenvolvimento

  1. Coleção de siliques
    1. Cultive plantas de Arabidopsis no solo ou lã de rocha até florescer.
    2. Marque as flores totalmente abertas com fios coloridos (0 dias após a floração, 0 DAF).
      NOTA: Evite usar fios verdes, amarelos ou marrons para marcar flores, pois essas cores são difíceis de distinguir de plantas e sílicas em crescimento ou maduras.
    3. Corte as silílicas em desenvolvimento marcadas no pedicelo (indicadas na Figura 1 (1)) e colete-as em tubos de 1,5 mL.
      NOTA: Siliques em desenvolvimento de 12-16 DAF são adequados para preparação usando este protocolo.
  2. Dissecação de sementes em desenvolvimento
    NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em papel de filtro úmido para proteger as amostras da dessecação. As manipulações devem ser feitas sob um microscópio estereoscópico.
    1. Separe uma válvula (indicada na Figura 1(2)) do replum (indicado na Figura 1(1)) usando duas pinças: uma com pontas grossas para segurar e outra com pontas afiadas para rasgar).
    2. Pegue suavemente as sementes em desenvolvimento das sílicas usando uma pinça com as pontas fechadas para evitar danificar as sementes (Figura 1 (2)).
    3. Segurando a semente com uma pinça sem bater na semente, faça uma cicatriz de aproximadamente 0,2 mm de tamanho na testa e no endosperma ao redor do embrião usando uma agulha de injeção (27 G, 0,40 mm × 19 mm) (Figura 1 (3)).
      NOTA: O local ideal para fazer a cicatriz é na junção dos cotilédones e da radícula.
    4. Empurre o embrião beliscando a semente com uma pinça (Figura 1 (4)). Não esmague o envelope vazio da semente, que consiste na testa e no endosperma, e tente manter sua forma redonda.
    5. Insira a agulha de injeção no envelope vazio da cicatriz, perfurando-o de dentro para fora (Figura 1 (5)).
    6. Mantenha a agulha na posição, risque a superfície da testa com uma pinça com as pontas fechadas e corte um lado do envelope vazio para permitir que ele se abra (Figura 1 (6)).
    7. Abra o envelope de sementes vazio em uma folha usando uma pinça com pontas afiadas (Figura 1 (7)). A amostra deve agora ser isolada como uma folha de bicamada consistindo nas camadas de endosperma e testa (Figura 1 (8)).
      NOTA: Se a amostra tende a enrolar quando a água é usada como meio de montagem na etapa 3 abaixo, divida a amostra em forma de folha em duas partes. Sementes colhidas de siliques em torno de 18 DAF (nesta fase, a testa é marrom, mas ainda não completamente seca) também podem ser processadas usando este protocolo, embora as sementes devam ser embebidas por vários minutos antes do preparo.

2. Preparação de amostras de endosperma intactas de sementes maduras

  1. Embebição de sementes maduras
    1. Adicione 1 mL de água bidestilada a um tubo de 1,5 mL contendo sementes secas de Arabidopsis .
    2. Mantenha as sementes embebidas por pelo menos 40 min em temperatura ambiente (Figura 2 (1)).
      NOTA: Sementes secas e sementes dentro de 40 minutos após a embebição são difíceis de cicatrizar no testa e no endosperma e remover o embrião de dentro da semente sem danificar o envelope vazio da semente nas etapas 2.2.1 e 2.2.2, enquanto um tempo de embebição mais longo facilita a manipulação.
    3. Use uma micropipeta de 1000 μL para transferir as sementes embebidas para papel de filtro úmido.
  2. Dissecção de sementes maduras
    NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em papel de filtro úmido para proteger as amostras da dessecação. As manipulações devem ser realizadas sob um microscópio estereoscópico.
    1. Segurando a semente com uma pinça sem bater na semente, faça uma cicatriz de aproximadamente 0,2 mm de tamanho na testa e no endosperma ao redor do embrião usando uma agulha de injeção (Figura 2 (2)).
    2. Empurre o embrião beliscando a semente com uma pinça (Figura 2 (3)). Não esmague o envelope vazio da semente, que inclui a testa e o endosperma. Tente manter sua forma redonda.
    3. Corte os lados superior e inferior do invólucro vazio de sementes com uma agulha de injeção para moldá-lo em um cilindro (Figura 2 (4)).
    4. Corte o envelope vazio de sementes de forma cilíndrica ao longo de seu eixo central para separá-lo em dois pedaços (Figura 2 (5)). As amostras devem ser isoladas como lâminas de bicamada constituídas pela camada de endosperma e pela camada de testa (Figura 2 (6)).

3. Observação microscópica

  1. Coloque as amostras de endosperma em forma de folha em uma lâmina de vidro e monte-as em água ou perfluorodecalina (PFD).
    NOTA: Se as bolhas de ar permanecerem entre a amostra e a lamínula, a perfluorodecalina (PFD), que foi relatada como particularmente útil para imagens de amostras contendo bolsas de ar, como folhas18,19, seria útil. O PFD é conhecido por ter a menor tensão superficial, permitindo que ele preencha facilmente os espaços de ar na superfície da amostra. Para imagens de lapso de tempo, no entanto, recomenda-se o uso de água como meio de montagem, pois o teor de água nas sementes maduras deve ser abundante para manter a liquidez celular.
  2. Coloque uma lamínula suavemente sobre a amostra. Certifique-se de que a camada de endosperma esteja voltada para a lamínula.
    NOTA: Esmalte ou graxa podem ser usados para selar as bordas da lamínula para evitar a dessecação da amostra e do meio de montagem.

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Resultados

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Utilizando o protocolo mostrado na Figura 1, amostras de endosperma foram preparadas a partir de sementes em desenvolvimento colhidas de siliques a 14 DAF (nesta fase, a testa ainda está verde). Numerosas células do endosperma em uma grande área e suas estruturas intracelulares foram observadas (Figura 3A). Neste experimento, foram utilizadas sementes expressando PHYB fundidas com GFP no terminal C (PHYB-GFP). É bem sabido que o PHYB se transloca para o núcleo a...

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Discussão

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Os papéis do endosperma na germinação de sementes foram revelados por meio de análises genéticas e bioquímicas usando tecidos separados de sementes, como análise de expressão gênica e quantificação de lipídios e fitohormônios 9,14,25,26,27. Um ensaio de acamamento do tegumento de sementes in vitro, combinando o envelo...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos aos Drs. Matsushita e Oka da Universidade de Kyoto por fornecerem o mutante phyB que expressa PHYB-GFP impulsionado pelo promotor 35S. Este estudo foi parcialmente apoiado por uma Bolsa de Auxílio para Pesquisa Científica em Áreas Inovadoras, Pesquisa em uma Área de Pesquisa Proposta (19H05713 para K.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLWatoson Bio Lab131-815C
Lamínula (18 x 18 mm)Matsunami Glass Ind.,Ltd.
DDWÁgua para montagem
Papel de filtro nº 526 (400 x 400 mm)ADVANTEC VIETNAM CO., LTD.02453400 
Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 (55 L)Katakura & Co-op Agri CorporationSolos para Crescimento de
Plantas Lâmina de vidro (26mm x 76 mm)Matsunami Glass Ind.,Ltd.S1215
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm CubosGrodanRockwools para Crescimento de Plantas
Íris  TesouraPremium Plus  Japão Co., Ltd.FC-0212
Pinça de joalheiro, Dumont No. 5 (4 1/4 pol.)Fórceps DumontF6521para Tearing
Leica Application Suite X (LAS X) Software Leicapara Sterallis 8
Leica Microsystems  Óleo de Imersão para MicroscópiosÓleo de Imersão de Autofluorescência Muito BaixaTHMOIL-10LF
Pinça de precisão LIOR 110mm  SL-14KENIS Ltda.KN33450438Fórceps para Segurar 
NAIL HOLICKOSEAgulhas de esmalte
27G 3/4 (19 mm) RB Misawa Medical Industry Co., Ltd.Uma Agulha de Ingestão para Corte
Nichipet Air 1000 uLNichiryo00-NAR-1000A 1000 µ L Micropipeta
PerfluorodecalinaAPOLLO SCIENTIFICPC5960Reagentes para montagem
de luz vermelha/luz vermelha distante painel de LEDTOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.
Schappe girou #60Fujix Co., Ltd.Lubrificante
Thread SPINKOTE 2 ozBECKMAN COULTER306812Graxa
Sterallis 8LeicaConfocal Laser Scanning Microscopia
Estereomicroscópio Stemi 305 cam WCarl Zeiss NTS Ltd.491903-0017-000
diodo emissor de luz branco PANASONICFL40SSW/37
C21818110147599

Referências

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