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Artigo de método

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

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DOI:

10.3791/68235

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23 de maio de 2025

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1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

Neste artigo

Resumo

Uma nova técnica para entrega generalizada de vírus adeno-associado que usa infusão de vírus subaracnóideo é descrita. Este método não apenas garante a transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos em camadas superficiais, mas também resulta na expressão seletiva do transgene em neurônios piramidais da camada cinco, mesmo quando se usa um promotor não seletivo.

Resumo

Os vírus adeno-associados recombinantes são uma ferramenta flexível e poderosa para a entrega e expressão de vários genes de interesse em muitas áreas da biologia experimental, particularmente na neurociência. O método mais popular para impulsionar a expressão de um transgene desejado em uma área específica do cérebro é injetar um vetor AAV diretamente no parênquima cerebral. No entanto, este método não permite a transdução neuronal generalizada que é necessária para alguns experimentos in vivo . Neste artigo, apresentamos uma nova técnica para expressão gênica generalizada no neocórtex de camundongos com base na infusão viral no espaço subaracnóideo do cérebro. Este método de marcação neuronal não apenas garante a transdução generalizada de neurônios em camadas neocorticais superficiais de camundongos adultos, mas também resulta na expressão do transgene em uma grande população de neurônios piramidais da camada cinco com alta especificidade, mesmo quando se usa um forte promotor não seletivo, como o CAG. Além disso, como a transdução celular ocorre a uma distância significativa do local da injeção, esse método pode ajudar a preservar o tecido cerebral para registros ópticos ou eletrofisiológicos subsequentes da atividade neuronal.

Introdução

O cérebro dos mamíferos consiste em muitas células inibitórias, excitatórias e modulatórias interconectadas em circuitos por trilhões de sinapses1. Um dos desafios centrais da neurociência é decodificar o papel de tipos de células distintas na organização e função dos circuitos cerebrais e do comportamento. A manipulação de células geneticamente definidas dentro do cérebro requer métodos para introduzir e expressar transgenes. Os sistemas de entrega de genes baseados em vírus são de longe o método mais eficaz e simples para a entrega de genes no sistema nervoso central2. Os sistemas de entrega viral são baseados em vírus replicantes (adenovírus, vírus adeno-associados (AAVs), lentivírus e retrovírus) que têm a capacidade de fornecer informações genéticas a uma célula hospedeira 2,3.

Os vetores baseados em AAV tornaram-se uma das ferramentas mais amplamente utilizadas para a entrega de transgenes desejados às células do cérebro, tanto para fins de pesquisa básica em neurociência quanto para desenvolver terapia genética para doenças neurológicas. Quando comparados com outros vírus, os AAVs com defeito de replicação possuem muitos recursos que os tornam vetores ideais para esses fins. Mais notavelmente, os vetores AAV transduzem eficientemente células não divididas (diferenciadas terminalmente), como neurônios e células gliais, resultando em altos níveis de expressão de transgene in vivo2. Os vetores podem ser facilmente produzidos com um alto título funcional adequado para uso in vivo 3,4,5. É importante ressaltar que a entrega gênica mediada por vírus adeno-associado in vivo não produz alterações histopatológicas e toxicidade relacionada ao vetor6. Ao contrário dos vetores adenovirais, a administração in vivo de vetores AAV em modelos animais geralmente não provoca respostas imunes do hospedeiro contra células transduzidas, permitindo a expressão estável do transgene dentro do parênquima cerebral por longos períodos de tempo 2,7,8.

Outra razão para a popularidade dos vetores AAV é a ampla gama de sorotipos de AAV com tropismos únicos de tecido e tipo celular 9,10,11,12,13,14. Proteínas distintas do capsídeo expressas por diferentes sorotipos de AAV resultam no uso de diferentes receptores de superfície celular para entrada celular e, portanto, tropismos específicos10,14.

O tropismo do AAV é determinado não apenas pelas proteínas do capsídeo, mas por muitos outros fatores14. Foi demonstrado que os sorotipos 1, 2, 6, 7, 8 e 9 do AAV transduzem neurônios e astrócitos em cultura primária15,16, mas exibem forte tropismo neuronal após injeção intraparenquimatosano cérebro 17,18. O método utilizado para a preparação do vetor AAV também pode influenciar o tropismo das células nervosas, mesmo para o mesmo sorotipo. Por exemplo, o AAV8 purificado com CsCl possuía forte tropismo astroglial após injeção intraparenquimatosa no cérebro, enquanto o AAV8 purificado com iodixanol, injetado em condições idênticas, transduzia apenas neurônios19. O tropismo do AAV também pode ser afetado pela dose e volume injetados14. Por exemplo, rAAV2 / 1 de alto título transduziu eficientemente neurônios excitatórios e inibitórios corticais, mas o uso de títulos mais baixos expôs uma forte preferência pela transdução de neurônios inibitórios corticais20.

Assim, não é possível alcançar uma especificidade robusta do tipo de célula com base apenas no sorotipo do capsídeo. Promotores específicos do tipo celular podem ser usados para superar o amplo tropismo natural do capsídeo AAV. Por exemplo, a sinapsina I humana é usada para direcionar neurônios21, o promotor CaMKII pode conduzir a expressão transgênica em neurônios excitatórios glutamatérgicos com alta especificidade20, o promotor ppHcrt tem como alvo os neurônios que expressam hipocretina (HCRT) no hipotálamo lateral22, o promotor PRSx8 tem como alvo os neurônios noradrenérgicos e adrenérgicos que expressam dopamina beta-hidroxilase23 e o promotor GFAP pode conduzir a expressão específica do astrócitos24. No entanto, alguns promotores específicos de células têm atividade transcricional fraca e não podem conduzir níveis suficientes de expressão transgênica25. Além disso, os promotores curtos que se encaixam nos vetores virais AAV muitas vezes não retêm a especificidade do tipo celular 1,26. Por exemplo, foi demonstrado que uma construção CaMKII também transduziu neurônios inibitórios12.

Além da especificidade do tipo de célula (tropismo), outra característica significativa dos AAVs é a eficiência da transdução. Os vários sorotipos de AAV têm diferentes propriedades difusionais. AAV2 e quatro vetores virais difundem-se menos facilmente através do parênquima cerebral e, portanto, medeiam a transdução em uma área menor17,27. A transdução neuronal mais difundida é observada com os sorotipos 1, 9 e rh.10 do AAV.11,17,18,19,28.

O método mais popular para impulsionar a expressão de um transgene desejado em uma área específica do cérebro é injetar o vetor AAV diretamente na região cerebral de interesse (parênquima)3. Após a injeção intraparenquimatosa, mesmo os sorotipos de AAV com difusão mais eficaz através do cérebro transduzem tipicamente apenas uma área local ao redor do local da injeção 12. Além disso, a injeção intraparenquimatosa é um procedimento invasivo e leva a danos teciduais adjacentes à região de interesse. Assim, este método de injeção de vírus é inadequado para algumas tarefas experimentais. Por exemplo, a marcação extensiva de células é altamente desejável em experimentos destinados a estudar as funções dos neurônios corticais em animais que se movem livremente, inclusive com o uso de microscopia de um ou dois fótons 29,30,31,32.

Aqui, descrevemos uma nova técnica de injeção de vírus adeno-associado que usa infusão de vírus subaracnóideo para fornecer transdução generalizada de neurônios neocorticais em camundongos adultos e preservar o tecido cerebral para registros ópticos ou eletrofisiológicos subsequentes da atividade neuronal. Este método não apenas garantiu a transdução generalizada de neurônios nas camadas neocorticais superficiais, mas resultou na expressão do transgene em uma grande população de neurônios piramidais da camada cinco com alta especificidade, mesmo quando se usava um forte promotor não seletivo como o CAG.

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Protocolo

Os experimentos foram realizados em camundongos C57Black/6 adultos, de 2 a 4 meses de idade, de ambos os sexos (Pushchino Breeding Center, Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS). Os camundongos foram alojados em um biotério com temperatura controlada (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h, luzes acesas às 08:00 h) com comida e água ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes ARRIVE e a Diretiva 2010/63/UE para experimentos com animais. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da IHNA RAS (protocolo N1 de 01.02.2022). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e garantir a confiabilidade dos resultados.

1. Preparação para a cirurgia

  1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes do início da cirurgia. Limpe a área cirúrgica com etanol 70%.
  2. Verifique o nível de isoflurano no sistema de anestesia e encha-o, se necessário. Coloque uma toalha de papel limpa no fundo da câmara de indução.
  3. Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotáxica. Cubra a almofada com uma toalha de papel limpa.
  4. Prepare um frasco com alvejante a 2% para coletar pontas de micropipeta, tubos, cotonetes e outros itens que entram em contato com o vírus.
  5. Retire uma alíquota de AAV do congelador a -80 °C e coloque-a sobre gelo para descongelar.

2. Preparação da seringa

  1. Limpe uma microsseringa Hamilton de 5 μL com uma agulha RN romba 33G. Aspire e depois dispense etanol a 70%. Repita 3x com etanol fresco. Enxágue a seringa com água destilada para remover o excesso de etanol. Repita 3x.
  2. Retire o êmbolo e encha o barril com óleo de vaselina através do flange usando uma seringa de insulina. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na microsseringa.
    NOTA: O ar retido é compressível e afeta a exatidão e a precisão da seringa.
  3. Coloque o êmbolo de volta na microsseringa e dispense uma gota de óleo. Coloque a seringa no injetor estereotáxico de modo que a escala fique visível para monitorar o volume da solução dispensada.

3. Preparação de camundongos para cirurgia

  1. Pese um rato. Coloque o camundongo na câmara de indução de anestesia conectada ao isoflurano. Ligue o vaporizador de isoflurano ajustado para 5% e ajuste a taxa de fluxo para 250 mL/min. Uma profundidade adequada de anestesia é alcançada dentro de 5 a 7 min.
  2. Para verificar o nível cirúrgico da anestesia, verifique a ausência de batida e reflexo de retirada durante um beliscão doloroso da pata traseira e a ausência de piscar ao contato visual.
  3. Mude a válvula de saída do vaporizador da câmara de indução para a máscara estereotáxica. Reduza o isoflurano para 1,8%-2,0% e defina a taxa de fluxo de acordo com o peso do camundongo (70-90 mL / min para camundongos pesando entre 25 a 35 g).
  4. Remova o mouse da câmara de indução e coloque-o no aparelho estereotáxico em cima de uma almofada de aquecimento (37 ° C) para evitar hipotermia durante a anestesia cirúrgica. Coloque os dentes da frente na barra de dentes e, em seguida, monte a máscara animal.
  5. Posicione cuidadosamente o animal nas barras auriculares. A posição correta da cabeça no aparelho estereotáxico permite o movimento vertical, mas não lateral, da cabeça. Certifique-se de que o posicionamento do animal não cause sofrimento. Monitore cuidadosamente a profundidade da anestesia, a respiração do animal e a temperatura corporal durante toda a operação.
  6. Raspe a cabeça dos olhos para trás das orelhas. Limpe a superfície raspada da cabeça esfregando com etanol a 70%, seguido de esfregaço com uma solução alcoólica de iodo a 5%.
  7. Aplique gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos. Aplique solução de lidocaína a 4% topicamente e dexametasona (0,02 mL a 4 mg/mL) por via subcutânea para evitar dor relacionada à cirurgia e reduzir a possível resposta inflamatória.
  8. Com uma lâmina de bisturi estéril e uma tesoura, faça uma incisão de 4-5 mm de comprimento ao longo da linha média da cabeça para abrir o couro cabeludo. Comece com uma pequena incisão entre as orelhas e depois expanda-a usando uma tesoura para evitar danos ao crânio.
  9. Limpe a superfície do crânio com uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio a 3% para visualizar os marcos estereotáxicos: bregma e lambda. Pare a reação com solução salina de NaCl a 0,9% imediatamente. Raspe os tecidos no topo do crânio com um raspador de osso.
  10. Monte o injetor motorizado pré-preparado com a seringa Hamilton no braço estereotáxico. Direcione uma fonte de luz cirúrgica para o crânio exposto e focalize o microscópio no bregma.
  11. Olhando através do microscópio, manipule o braço do aparelho estereotáxico para centralizar a parte superior da agulha diretamente sobre o bregma.
  12. Usando a ponta da agulha, alinhe o bregma e o lambda horizontalmente e, em seguida, mova o braço de volta para o bregma e registre as coordenadas. Use essas coordenadas bregma e as coordenadas do atlas da região de interesse para calcular as coordenadas relativas da área alvo.
  13. Mova a agulha para a área alvo. Baixe a agulha nas novas coordenadas e marque esta posição. Selecione o local para microinjeção viral próximo à área-alvo, considerando a propagação do vírus.
    NOTA: Isso evitará danificar o tecido na região de interesse. Foram utilizadas as seguintes coordenadas para a região de interesse: AP-3.4, ML -2.0, e para microinjeção viral: AP-2.0, ML -1.4. As coordenadas acima são ideais se os neurônios do córtex visual primário forem infectados.
  14. Se possível, evite regiões com grandes vasos sanguíneos. Sob um microscópio cirúrgico, iluminação de luz fria e brilhante e imersão em solução salina de NaCl a 0,9%, grandes vasos sanguíneos no crânio e na superfície do cérebro devem se tornar aparentes.

4. Injeção de vírus

  1. Pegue uma broca dentária estéril (0,5 - 0,8 mm de diâmetro). Visualizando a superfície do crânio através do microscópio cirúrgico, perfure uma pequena craniotomia manualmente (manualmente) ou usando uma microbroca. Tome cuidado para não colocar pressão excessiva no crânio.
  2. Mova o braço para fora do caminho para evitar danos à agulha da microsseringa durante a perfuração da craniotomia (orifício). Aplique imersão em solução salina de NaCl a 0,9% e faça uma pausa intermitente para evitar aquecer o osso e danificar a dura-máter. Use ar pressurizado para soprar a poeira óssea.
    NOTA: Os seguintes tipos de brocas dentárias de metal duro são adequados: em forma de pêra (de preferência), cilindro arredondado e redondo.
    1. Ao afinar o osso com a broca, certifique-se de que o desbaste seja uniforme em toda a circunferência. Isso facilitará a remoção do osso sem danificar a dura-máter. Para fazer isso, use uma broca com ponta redonda inicialmente e depois uma broca com ponta plana. Mantenha a broca perpendicular ao osso; caso contrário, um lado será mais fino que o outro.
      NOTA: Além disso, quanto menor o tamanho da broca e menor a craniotomia realizada, mais complexa será a manipulação. Recomenda-se que uma craniotomia de menor diâmetro (0,5-0,6 mm) seja realizada ao usar o animal para trabalho in vivo . Se estiver planejando usar o cérebro do animal para trabalho ex vivo , um diâmetro de craniotomia maior é aceitável para simplificar o procedimento.
  3. Quando o osso afinado estiver macio e transparente, pare de perfurar. Quando uma reentrância suficientemente grande se forma no osso, interrompa frequentemente a rotação e monitore a espessura do osso. O aparecimento de rachaduras no osso indica que o afinamento é suficiente.
  4. Banhe o buraco com soro fisiológico estéril e, em seguida, remova o excesso de soro fisiológico com um cotonete. Remova a camada restante de osso usando uma agulha 27G com ponta em forma de gancho e/ou usando uma pinça de ponta fina. Evite danificar a dura-máter.
  5. Cubra a superfície do crânio com um pedaço estéril de papel toalha umedecido com solução salina. Coloque um pedaço de filme limpo e transparente na superfície do crânio do rato acima do papel.
  6. Mova o braço estereotáxico para trás e posicione a agulha da microsseringa no lugar diretamente acima do filme. Dispense o excesso de óleo até atingir um volume de 2 μL.
    NOTA: O volume final do óleo pode variar de acordo com o volume da microseringa. Utilizou-se uma microseringa 75-RN Hamilton de 5 μL.
  7. Pipetar um volume de vírus igual ao volume injectado + 2 μL sobre um pedaço de película transparente.
  8. Olhando pelo microscópio cirúrgico, abaixe o braço até que a ponta da agulha esteja no centro da gota do vírus. Carregue o vírus na microsseringa usando um injetor motorizado. Descarte a ponta da micropipeta e o filme transparente no frasco com alvejante a 2%.
  9. Retire o papel umedecido com soro fisiológico da superfície do crânio e seque-o com um cotonete. Use o braço estereotáxico para posicionar a agulha acima do local de inserção.
  10. Dispense uma gota do vírus para se certificar de que a agulha não está entupida. Faça um pequeno corte na dura-máter usando uma agulha de 30 G com uma ponta em forma de gancho.
    NOTA: É importante fazer o menor corte possível na dura-máter, permitindo que a agulha entre sem deixar um espaço entre a agulha e a dura-máter, de onde o vírus pode vazar.
  11. Abaixe a agulha da seringa até a dura-máter e faça os cálculos apropriados para a profundidade. Estime a profundidade cortical da inserção em relação ao ponto em que a agulha tocou pela primeira vez a superfície do córtex.
  12. Insira lentamente a ponta da agulha no córtex a uma profundidade de 300 μm. Aguarde 2-3 min para permitir que a dura-máter adira à agulha e, em seguida, retraia lentamente a agulha a uma profundidade de 200 μm. Espere mais 2-3 minutos para permitir que o tecido cerebral se estabilize. Isso faz com que a agulha puxe a dura-máter para cima, criando um espaço subdural para o vírus se espalhar.
    NOTA: Para minimizar os danos corticais, use uma agulha de 33 G ou agulhas G inferiores. Lembre-se de que quanto menor o diâmetro interno da ponta, maior a chance de o refluxo do tecido entupi-la. É importante usar uma agulha romba em vez de chanfrada porque uma agulha romba expele uma gota mais controlada de solução viral.
    1. Se a agulha não passar pela dura-máter quando abaixada para 150-200 μm e, em vez disso, dobrá-la, pare de abaixar. Levante a agulha e faça uma incisão um pouco maior na dura-máter e, em seguida, tente abaixar a agulha novamente.
    2. Se o líquido cefalorraquidiano começar a vazar ativamente da incisão enquanto abaixa a agulha, espere até que pare de vazar; caso contrário, é difícil controlar a passagem da agulha pela dura-máter. Seque o excesso de líquido cefalorraquidiano com uma ponta de tecido. Assim que o fluido parar de fluir, levante a agulha e tente novamente.
  13. Comece a injetar a suspensão viral a uma taxa de 0,06 μL / min enquanto monitora o volume dispensado. Injete 1 μL de vírus. Injete o vírus em uma única profundidade para não quebrar o selo entre a agulha e o tecido do córtex.
    1. Solução de problemas: No início da injeção, pode ocorrer refluxo do vírus para a superfície do cérebro. Pare de injetar, aguarde 2-3 minutos e continue a injeção do vírus. Repita essas ações (etapas) até que o refluxo do vírus pare. O vírus e o líquido cefalorraquidiano grudam na agulha e impedem o refluxo.
    2. Outra maneira de interromper o refluxo do vírus, coloque uma pequena quantidade de agarose na superfície do córtex. Ele suprimirá a pulsação do córtex e também ajudará a selar a agulha. Mas certifique-se de que a pipeta não esteja entupida pela agarose.
    3. Como a agulha pode não passar completamente pela dura-máter quando abaixada, mas apenas parcialmente, um lado da agulha pode não se encaixar firmemente na dura-máter, o que pode causar refluxo do vírus. Nesse caso, retire lentamente a agulha do tecido e tente abaixá-la novamente.
  14. Quando a infusão estiver concluída, mantenha a agulha no local alvo por mais 10 minutos. Isso permite que o vírus se disperse para longe do local da injeção. Retraia a agulha para fora do cérebro lentamente para evitar que o vírus volte para fora do trato da agulha.
  15. Assim que a retirada da agulha for concluída, verifique se ela não está entupida dispensando uma pequena gota de vírus. Feche a incisão na pele usando suturas absorvíveis ou não absorvíveis 5-0.

5. Cuidados pós-operatórios

  1. Depois de fechar a incisão, aplique pomada antibacteriana topicamente. Injete uma mistura de solução salina (5 mL/kg) e glicose a 5% (5 mL/kg) por via subcutânea para evitar a desidratação e facilitar a recuperação após a anestesia. Injete cetoprofeno por via intramuscular (2,5 mg / kg) para reduzir a dor.
  2. Coloque o animal em uma gaiola nova em cima de uma almofada de aquecimento e monitore até que ele se recupere da anestesia. Depois que o rato estiver reativo, coloque o animal em sua gaiola doméstica.

6. Histologia

  1. Não antes de 21 dias após a injeção do vírus, anestesiar profundamente os camundongos com isoflurano, conforme descrito na etapa 3.
  2. Faça uma incisão na linha média (10 -15 mm) ao longo da região torácica usando uma tesoura estreita e exponha a cavidade torácica. Separe cuidadosamente o diafragma e abra o peito usando uma tesoura.
  3. Insira uma agulha 22G 1 1/2 no ventrículo esquerdo e faça uma incisão no átrio direito com uma tesoura. Perfundir com 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 100 mM pré-resfriada, seguida de 100 mL de formalina tamponada a 10% pré-resfriada.
  4. Extraia cuidadosamente todo o cérebro do camundongo. Para fazer isso, faça uma incisão sagital ao longo do centro do couro cabeludo usando uma tesoura. Em seguida, remova o osso craniano peça por peça usando um alicate ósseo com pontas planas, começando na interseção das suturas sagital e lambdoide e avançando até o osso nasal. Quando o cérebro estiver exposto, corte os bulbos olfatórios, alivie o cérebro com uma espátula curva e coloque-o em um tubo de 50 mL contendo 10% de formalina tamponada.
  5. Conserte o cérebro durante a noite. Monte o tecido cerebral em uma plataforma de metal de um vibratomo usando adesivo tecidual. Corte seções frontais com uma espessura de 50 μm usando lâminas de aço carbono.

7. Imunocoloração

  1. Dia 1
    1. Lave as fatias de cérebro 3x por 5 min cada com 1x PBS contendo 0,3% de Triton X-100 (PBS-T). Incube as seções em PBS-T por 20 min em temperatura ambiente (RT).
    2. Bloqueie a ligação inespecífica por 1 h em RT usando um tampão de bloqueio composto por 5% de soro de cabra normal (NGS) e 0,3% de Triton X-100 em 1x PBS.
    3. Incubar as seções durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra parvalbumina ou calbindina diluída a 1:500 no tampão de bloqueio (5% NGS e 0,3% Triton X-100 em 1x PBS).
  2. Dia 2
    1. Lave as seções 3x por 10 min em PBS-T. Incubar no escuro por 2 h em RT com anticorpos secundários (anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) anticorpo anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 546) diluído a 1:500 no tampão de bloqueio (5% NGS e 0,3% Triton X-100 em 1x PBS).
    2. Lave as seções 3x por 5 min cada em 1x PBS. Transfira as fatias de cérebro para lâminas de vidro usando uma escova macia.
    3. Adicione imediatamente 0,1 mL de meio de montagem antidesbotamento a cada seção. Cubra as fatias com uma lamínula de 22 mm x 50 mm.
    4. Configure o microscópio confocal para uma ampliação de 20x ou 60x (A/1.4, óleo). Use lasers de comprimento de onda de 488 nm e 594 nm para adquirir imagens multicanal das regiões cerebrais de interesse.

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Resultados

Em uma série piloto de experimentos, usamos o método tradicional de injeção intracortical para transduzir neurônios piramidais da camada cinco no neocórtex de camundongos por AAV2 carregando o gene da channelrodopsina rápida (oChIEF) fundido com a proteína fluorescente EGFP sob o promotor CaMKII. Consistente com o aspecto característico da AAV212, obtivemos uma área de infecção relativamente pequena, não excedendo 1 mm de largura (Figura 1A). No entanto, em a...

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Discussão

Desenvolvemos um novo método para transduzir neurônios neocorticais de camundongos injetando uma suspensão de partículas virais AAV2 no espaço subaracnóideo do cérebro. Isso fornece ampla distribuição do vírus, quase quatro vezes maior do que o volume de tecido infectado quando a mesma quantidade de vírus é injetada diretamente no parênquima cerebral.

A injeção de vetores virais diretamente no líquido cefalorraquidiano (LCR) por diferentes vias (por exemplo, i...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O trabalho foi realizado com apoio financeiro da Fundação Russa de Ciência, concessão 20-15-00398P.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
10 µ L Seringa à prova de gás modelo 1701 RN (5 uL 75 RN microsseringa Hamilton)Companhia HamiltonParte/REF # 7634-01, Hamilton ou cat no. HAM7634-01, Merck
Agulha 33 G RN, ponta 3Companhia HamiltonParte/REF # 7803-05, Hamilton
Microscópio binocularNikon ou MicromedModelo MC-4 ZOOM
Microscópio confocal de varredura a laser baseado em CernaThorLabs
Fonte de luz friaRWDModelo 76312
Leica VT1000 S Micrótomo de lâmina vibratóriaLeica Biosystems76001-014
Sistema de anestesia de baixo fluxo com kit inicialCorporação Científica Kent13-005-111 (Modelo SomnoSuite)
Pipeta Mecânica 0.1 - 2,5 µ L Eppendorf Research plusEppendorf3123000012
Pipeta Mecânica 10 - 100 µ L Eppendorf Research plusEppendorf3123000047
Ratos ShaverRWDModelo CP-5200
Microbroca com brocas (0,5 mm, redonda)RWD78001, 78040
ou instrumento estereotáxico de Desctop Digitas, máscara da anestesia do rato, barras da orelha do rato (60 graus)RWDModelos 68027, 68665, 68306
Compressor de arBambiBB8
Pipeta manual de canal único 0,5-10 µ LRAINN17008649
Instrumento estereotáxico para pequenos animaisKOPFModelo 962
Injetor estereotáxicoStoelting10-000-004
Instrumentos Cirúrgicos (Ferramentas)
Agulha dentária de 30 G (Ni-pro)Biodent Co. Ltd.Para cortar a dura-máter
Raspador ósseoFerramentas de Belas Ciências10075-16
Alicate de ossoFerramentas de Belas Ciências16025-14Para remover o osso craniano
Espátulas curvasFábrica de suprimentos médicos MozhaiskPara remover o cérebro da abóbada craniana
Broca dentáriaDRENDEL + ZWEILINGPara craniotomia; Forma: cilindro em forma de pêra / extremidade redonda / redondo; Diâmetro da ponta: 0,55-0,8 mm de diâmetro
Porta-agulha (Halsey Micro Needle Holder)Ferramentas de Belas Ciências12500-12
Sutura Cirúrgica de Polipropileno ou Sutura Cirúrgica Vicryl (5-0, absorvível)Produtos Walter (Ethicon)S139044 (W9442)
Cabo de bisturi (#3) com lâminas de bisturi (#11)Ferramentas de Belas Ciências10003-12, 10011-00
Tesoura (tesoura extra estreita)Ferramentas de Belas Ciências14088-10para cortar a pele
Tesoura (tesoura fina)Ferramentas de Belas Ciências14094-11para cortar a sutura
Sutura cirúrgica PROLENE (polipropileno)A Ethicon (Johnson & Johnson)
Pinças (fórceps #5)Ferramentas de Belas Ciências11252-20
Pinças (pinças de inox polido)Ferramentas de Belas Ciências11210-20
Descartáveis
Seringa de insulina de 1 mlSITEKMEDPara carregar óleo de vaselina em uma microsseringa, para administrar drogas
Placa de cultura celularCiência da Vida SPL
Cotonetes
Óculos de coberturaFisher Científico12-545E
Agulha de seringa de insulina (27 G)SITEKMEDPara remover detritos de um orifício (craniotomia)
Toalhetes sem fiapos CLEANWIPERNetLink
Lâminas de microscópioFisher Científico12-550-15
Toalhas de papelLusco
ParafilmeLaboratório de estatísticasSTLPM996
Luvas cirúrgicas estéreisDermagrip
Filtro de Seringa Estéril (0.2 μ m)Corning431229
Drogas/Produtos Químicos (Reagentes)
10% de formalina tamponada ou 4% de paraformaldeídoProdutos Químicos TermocientíficosJ61899. AK
Solução alcoólica de iodo (5%))Renovação
Pomada antibiótica Baneocin (bacitracina + neomicina)SandozAgente antibacteriano para uso externo
Aqua PolymountPoliciências18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (gel oftálmico)BAUSCH+LOMB (Santen)
Microesferas FluoSphere modificadas com carboxilato (vermelho)Thermo Fisher CientíficoF-8801
Dexametasona (4 mg/mL)Ellara (KRKA)Glicocorticóide sintético
H2O destilado
Etanol (70%)
Flexoprofeno 2,5% (cetoprofeno)VICAnti-inflamatórios não esteróides (AINEs)
Solução de glicose 5%Solopharm
Cabra anti-coelho IgG (H + L) adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546Thermo Fisher CientíficoA-11010
IsofluranoKarizoo
solução de lidocaína (2% / 4%)Solopharm
Soro de cabra normal (NGS)AbcamAB7481
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Eco-servis
Anticorpo anti-parvalbumina de coelhoMerck MilliporeAB15736
Anticorpo monoclonal recombinante anti-Calbindina de coelhoAbcamAB108404
Solução salina (NaCl a 0,9% em H2O)Solopharm
Tritão X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Óleo de vaselinaGenel

Referências

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