Fluxo de trabalho usando um microscópio de fluorescência coincidente criogênica, elétron e feixe de íons para moagem direcionada de células

Resumo

Esse fluxo de trabalho permite a produção de lamelas direcionadas a estruturas biológicas marcadas com fluorescência que são pequenas (<1 μm de extensão axial) e raras (1 cópia por célula) usando uma plataforma de imagem tricoincidente criogênica. Esta plataforma integra microscopia de fluorescência, fresagem de feixe de íons focalizada e microscopia eletrônica de varredura em uma única posição focal e permite microscopia de fluorescência simultânea durante a fresagem.

Resumo

A fresagem criogênica de feixe de íons focalizados com microscopia eletrônica de varredura (CryoFIB-SEM) tornou-se a abordagem dominante para a preparação de lamelas de células com menos de 200 nm de espessura para tomografia eletrônica criogênica (CryoET). Recentemente, a microscopia de fluorescência foi incorporada aos sistemas CryoFIB-SEM para orientar a produção de lamelas em direção a alvos marcados com fluorescência. No entanto, na maioria das implementações, os sistemas de imagem óptica e de feixe de íons têm planos focais distintos em diferentes regiões da câmara de vácuo - funcionando efetivamente como dois microscópios separados. Essa configuração requer registro de imagem entre as modalidades, que muitas vezes não tem a precisão necessária para direcionar de forma confiável estruturas pequenas e raras in situ. Apresentamos um fluxo de trabalho baseado em uma plataforma de imagem tricoincidente personalizada que permite imagens de fluorescência simultâneas e fresagem de feixe de íons focalizados. Isso permite feedback de fluorescência em tempo real que pode ser usado para determinar quando encerrar a fresagem, a fim de preservar estruturas marcadas com fluorescência de interesse na lamela final. Usando essa abordagem, visamos o centro organizador de microtúbulos (MTOC) em macrófagos vitrificados e alcançamos uma taxa de sucesso de >60%, confirmada por tomografia eletrônica criogênica subsequente e microscopia eletrônica e de luz correlativa.

Introdução

A tomografia eletrônica criogênica (CryoET) permite a visualização de espécimes biológicos em um estado quase nativo em resolução macromolecular 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . No entanto, a espessura das células eucarióticas - geralmente vários mícrons - excede o caminho livre médio (~ 300 nm) de 300 kV elétrons, limitando a profundidade de penetração de elétrons não espalhados e, assim, restringindo a espessura utilizável da amostra. Para resolver isso, um feixe de íons focalizado (FIB) pode ser usado para ablação da maior parte da célula criogenicamente preservada em um processo conhecido como moagem CryoFIB, produzindo lamelas finas o suficiente para imagens CryoET^{12 , 13 , 14 , 15 , 16} .

Em fluxos de trabalho relatados anteriormente, as amostras são primeiro preservadas em gelo vitrificado por meio de congelamento por imersão 17,18,19 e, em seguida, carregadas em um instrumento de feixe duplo equipado com um CryoFIB e um microscópio eletrônico de varredura (SEM). A imagem de MEV pode ser usada para identificar características subcelulares de interesse, como organelas e até mesmo algumas estruturas proteicas^20,21. Essas informações podem ser usadas para direcionar o processo de moagem CryoFIB, onde a amostra é ablacionada de maneira gradual com o objetivo de produzir uma lamela de espessura abaixo de 200 nm adequada para CryoET 13,14,22. No entanto, essa abordagem apresenta dois desafios principais que o presente protocolo aborda. Primeiro, muitas vezes é necessário obter CryoET de estruturas proteicas específicas, mas o SEM pode ser prejudicial, e a maioria das estruturas proteicas não são discerníveis pelo SEM ao obter imagens de material biológico não corado. Como a moagem pode ser guiada com precisão para regiões subcelulares específicas ou regiões contendo biomoléculas específicas de maneira livre de danos? Em segundo lugar, mesmo após a produção de lamelas finas e subsequente CryoET, pode ser um desafio identificar biomoléculas específicas nas reconstruções finais devido à resolução insuficiente, relação sinal-ruído e/ou contraste necessários para a identificação inequívoca. Como as posições espaciais dessas biomoléculas podem ser determinadas nas reconstruções crio-ET?

Para enfrentar os dois desafios, o campo tem se voltado cada vez mais para a microscopia de fluorescência. Proteínas fluorescentes geneticamente codificadas ou corantes exógenos que se ligam a proteínas-alvo são rotineiramente usados para rotular biomoléculas específicas de interesse ^5,23,24. A microscopia de fluorescência criogênica de células vitrificadas tirada após a moagem pode ser correlacionada com os tomogramas resultantes. Essa abordagem, conhecida como microscopia eletrônica e de luz correlativa criogênica (CryoCLEM), está bem estabelecida e tem sido amplamente utilizada para localizar proteínas específicas em reconstruções de CryoET 5,12,23,24. Avanços recentes incluem o uso de biossensores fluorescentes e métodos de super-resolução para melhorar informações complementares e precisão espacial 25,26,27,28,29.

O CryoCLEM é uma maneira de superar o segundo desafio identificado acima, permitindo que a localização de proteínas específicas dentro da lamela seja determinada. No entanto, o CryoCLEM não faz nada pelo usuário se a lamela final não contiver as proteínas de interesse. Felizmente, a microscopia de fluorescência também pode ser usada para direcionar a fresagem para regiões de interesse marcadas. Embora a fresagem FIB guiada por fluorescência seja um desenvolvimento mais recente do que o CryoCLEM, fluxos de trabalho iniciais surgindo há cerca de uma década¹², ela encontrou adoção rápida e generalizada. Os primeiros protocolos dependiam de microscópios de luz externa para adquirir conjuntos de dados de fluorescência 2D ou 3D, que eram então registrados em imagens de SEM e feixe de íons após a transferência da amostra para o CryoFIB-SEM. Mais recentemente, os microscópios de fluorescência foram integrados diretamente nas câmaras de vácuo CryoFIB-SEM. Essa integração reduz a contaminação do gelo durante as transferências e permite a aquisição de imagens da lamela final com mais facilidade. Várias plataformas já foram desenvolvidas para combinar microscopia de fluorescência com CryoFIB-SEM para fresagem guiada por fluorescência. Estes têm como alvo com sucesso organelas e grandes complexos de proteínas ^5,23,24. No entanto, com poucas exceções³⁰, o caminho óptico produz um plano focal separado em uma região física diferente da câmara de vácuo do FIB-SEM. Como resultado, o registro preciso entre as imagens de fluorescência e íons ainda é necessário para direcionar a fresagem, assim como é necessário com o uso de microscópios ópticos autônomos.

Esse processo de registro é propenso a imprecisões devido a três fatores principais: incompatibilidades do índice de refração (que causam mudanças focais aparentes)^31,32, movimento da amostra durante a fresagem e erro de localização. Além disso, o registro é normalmente auxiliado por fiduciais fluorescentes de tamanho mícron que são visíveis nas modalidades de íons e ópticas e são usados como pares de pontos de alinhamento para calcular as transformações entre as imagens de íons e ópticas. No entanto, essas esferas podem obscurecer ou competir com o sinal de fluorescência da amostra, e sua localização e alinhamento em imagens ópticas e de íons são lentas e intensivas para o usuário. Juntas, essas limitações dificultaram o direcionamento rotineiro de recursos pequenos e raros. Embora seja difícil definir um limite preciso para as estruturas que podem ser preservadas atualmente em lamelas finas, as abordagens baseadas em registro são geralmente consideradas ineficazes para capturar alvos com dimensões axiais abaixo de um mícron³³.

Aqui, relatamos o uso de um sistema de imagem tricoincidente que integra FIB, MEV e microscopia de fluorescência em uma única posição focal^34,35. Essa configuração permite um fresamento guiado por fluorescência mais simples e preciso em comparação com integrações não coincidentes, eliminando a necessidade de registrar imagens ópticas e de íons. Em condições ideais de baixo fundo e alto sinal, a precisão de orientação da ordem de 10 nm pode ser alcançada³⁶. Também permite a aquisição de dados de microscopia de fluorescência criogênica multicolorida durante todo o processo de moagem, inclusive da lamela fina final, permitindo a análise correlativa e a localização de alvos limitados por subdifração³⁵. Para conseguir isso, empregamos um kit de ferramentas de transformação de imagem personalizado para alinhar com precisão essas imagens de fluorescência com microscopia eletrônica de transmissão de baixa ampliação para determinar onde coletar CryoET, agilizando a coleta de dados e garantindo a captura do alvo nas reconstruções tomográficas finais.

Para orientar a fresagem, exploramos a capacidade do sistema de monitorar mudanças na intensidade da fluorescência em tempo real. Em vez de tentar alinhar imagens ópticas e de íons para encontrar nosso alvo, o usuário simplesmente observa o sinal fluorescente da amostra. À medida que a fresagem progride, a fluorescência se comporta de uma maneira muito característica: primeiro fica mais brilhante à medida que o filme de suporte de carbono entre a objetiva do microscópio e a amostra marcada com fluorescência é removido, depois diminui gradualmente à medida que o material autofluorescente fora de foco é fresado e, finalmente, diminui drasticamente à medida que a própria estrutura marcada é parcialmente removida. Este sinal em tempo real determina precisamente onde se está no processo de moagem e quando parar a moagem, garantindo que o alvo de interesse seja retido dentro da lamela final³⁷. No protocolo detalhado, também discutiremos uma abordagem mais avançada que usa oscilações no brilho da fluorescência devido a efeitos interferométricos para guiar a fresagem para objetos com <300 nm de extensão axial.

Demonstramos a utilidade da plataforma visando o centro organizador de microtúbulos (MTOC)³⁸. O MTOC é uma organela crítica envolvida na divisão e diferenciação celular. Em células de mamíferos, a microscopia de fluorescência da tubulina marcada revela o MTOC como um único ponto fluorescente de aproximadamente 1 μm de diâmetro em células vivas. Essa abordagem tem sido usada para localizar com sucesso o MTOC com alta fidelidade para lamelas finas de células vitrificadas. A organização detalhada dos microtúbulos no MTOC e suas interações com outras organelas são reveladas em reconstruções tomográficas subsequentes. Esse fluxo de trabalho permite microscopia de fluorescência correlativa de alta precisão e CryoFIB-SEM sem registro, reduzindo a entrada do usuário e expandindo o acesso a estruturas celulares que antes eram proibitivamente pequenas para capturar de forma robusta com abordagens não coincidentes.

Definições e descrição do instrumento
O microscópio óptico integrado é descrito em detalhes em Boltje et ^al.35, e mais detalhes sobre o uso do microscópio integrado podem ser encontrados em um protocolo publicado recentemente³⁴. A objetiva é integrada por baixo e equipada com recursos de posicionamento x, y e z para permitir o alinhamento com o ponto coincidente FIB-SEM. Atualmente, opera com uma objetiva de 100x, 0,85 NA com um corretor de lamínula. A imagem óptica é realizada através de uma lamínula, que protege a objetiva de material pulverizado e irradiação do FIB e do SEM. A iluminação de campo amplo é fornecida por um conjunto de LEDs que abrangem vários comprimentos de onda visíveis. A detecção de fluorescência é realizada usando um detector sCMOS. Existem três posições de palco definidas: carregamento: a posição do palco onde a amostra é carregada; Revestimento: a posição do palco para o revestimento através do sistema de injeção de gás; 3-Feixe: a posição da platina para a qual todos os três microscópios (FIB, SEM e óptico) podem ser co-alinhados.

Protocolo

NOTA: O sistema tricoincidente usado aqui é um componente de imagem de fluorescência criogênica personalizado integrado a um sistema FIB-SEM de feixe duplo disponível comercialmente. O princípio e a ordem das operações podem ser geralmente adaptados a futuras implementações tricoincidentes.

1. Configuração

1. Resfrie o sistema até a temperatura criogênica. Monitore a temperatura usando dois sensores: um localizado no estágio de amostra e outro dentro da câmara. Mantenha o estágio da amostra aproximadamente 20 °C mais quente do que a câmara (por exemplo, estágio a ~-170 °C, câmara a ~-190 °C) para minimizar o acúmulo de gelo na amostra. O processo de resfriamento normalmente leva cerca de 1,5 h.

2. Carregamento da amostra

1. Use nitrogênio líquido para resfriar manualmente a estação de transferência quando a temperatura do sistema se aproximar da temperatura criogênica (aproximadamente -167.5 °C). A temperatura do sistema é exibida no canto superior esquerdo do software de microscopia de luz.
2. Carregue uma Autogrid recortada no de amostra projetado para o sistema de microscopia de luz criogênica. O consiste em uma lamínula colada e um espaçador, com o Autogrid posicionado entre eles. Feche o apertando o parafuso do anel e, em seguida, insira-o na ranhura da estação de transferência³⁴.
3. Conecte a estação de transferência ao sistema e use a câmera da câmara interna para guiar o de amostra para o estágio de amostra.

3. Sistema de injeção de gás (GIS) para revestimento de amostra

1. Abra o software de controle de microscopia de luz e mova o estágio de amostra da posição de carregamento para a posição de revestimento .
2. Insira a agulha GIS usando o software de controle FIB-SEM clicando no ícone Floco de neve. Em Controle GIS, escolha a opção inserir agulha GIS.
3. Permitir a deposição de GIS durante 30 s, abrindo o fluxo de gás.
   NOTA: Isso varia de 20 s a 1 min com base no tipo de amostra. O objetivo desta etapa é proteger suficientemente a amostra durante o procedimento de moagem FIB subsequente.
4. Retraindo a agulha GIS, mova o sample stage de volta para a posição de carregamento predefinida.

4. Alinhamento do sistema de três feixes

NOTA: Esta seção é adaptada de Wang³⁹.

1. No software de microscopia de luz, mova o sample stage da posição de carregamento para a posição predefinida de 3 feixes .
2. No software FIB-SEM, clique na janela superior esquerda e defina o SEM com uma ampliação de 100x.
3. Na guia Alinhamento do software de microscopia de luz, clique na função View para adquirir um atlas SEM da grade. Esta imagem do atlas usa parâmetros definidos anteriormente.
4. Identifique uma área quadrada com filme de carbono quebrado e clique duas vezes nela para mover o estágio de amostra para esse local.
5. Retorne ao software de controle FIB-SEM e ajuste o SEM para uma ampliação maior para focar na área quadrada selecionada, centralizada no campo de view.
6. Repita as etapas 4.4 e 4.5 conforme necessário até que o SEM esteja focado em um padrão distinguível, como a borda afiada de um filme de carbono quebrado.
7. Ligue o microscópio de fluorescência e ajuste as coordenadas x, y, z para corresponder ao SEM view.
8. Frese um pequeno padrão com o FIB, por exemplo, um pequeno retângulo ou círculo.
9. Confirme se o padrão é visível nas visualizações FIB e do microscópio fluorescente. Se necessário, ajuste o alinhamento seguindo as etapas 4.3-4.7, se necessário.
   NOTA: O alinhamento e o registro dos microscópios ópticos e iônicos estão concluídos.

5. Localização e fresagem do alvo

NOTA: Esta seção é adaptada de Wang³⁹.

1. Vá para a guia Localização no software de microscopia de luz e configure canais fluorescentes ativando as condições adequadas de excitação e filtragem. Atribua cada fluoróforo como um canal separado e inclua um canal adicional para luz transmitida (ou campo claro).
2. Identifique o alvo de interesse ajustando a potência do LED e o tempo de exposição para cada canal fluorescente. Como referência, ao criar imagens de SiR-tubulina, use uma exposição de 1.2 s com uma configuração de potência de LED constante de 30 mW.
   NOTA: Os parâmetros podem variar entre os fluoróforos. A intensidade óptica deve permanecer abaixo de ~25-50 W/^cm2 na amostra. Maior intensidade do que isso pode resultar em aquecimento significativo e desvitrificação da amostra^37,40.
3. Uma vez satisfeito com os parâmetros, adquira uma pilha z fluorescente pré-fresadora passando pela direção axial. Em seguida, marque o alvo como um ROI.
4. Mude para o software FIB-SEM para desenhar uma lamela no ROI.
5. Realize o fresamento de desbaste para remover a maior parte do material aproximadamente 3 μm acima e abaixo do ROI. Enquanto isso, mantenha o microscópio de fluorescência ligado durante a fresagem para monitorar qualquer diminuição no sinal fluorescente.
6. Dilua o ROI para ~2 μm usando o modo de seção transversal de limpeza.
7. Abra o kit de ferramentas interferométricas baseado em Python do terminal para monitorar o sinal fluorescente enquanto afina a lamela (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Para fresamento e polimento subsequentes, siga uma das duas abordagens descritas abaixo nas etapas 5.9 ou 5.10 para direcionar o fresamento com base nas dimensões dos alvos selecionados.
   1. Extensão axial do alvo > 300 nm
      NOTA: Aqui usaremos uma abordagem semidestrutiva para fresagem direta.
      1. Na GUI do Python, selecione o alvo de interesse na micrografia de fluorescência. O software começará automaticamente a plotar o brilho em função do tempo a cada novo quadro.
      2. Monitore a intensidade da fluorescência por meio do kit de ferramentas Python. Triture a amostra no modo de seção transversal de limpeza por baixo para remover qualquer material de filme de suporte restante, se aplicável.
         NOTA: Quando o filme de suporte é removido, um aumento na fluorescência deve ser observado.
      3. Use quedas rápidas na intensidade da fluorescência - indicando perda de material fluorescente - como uma dica para quando mudar as direções de fresagem. Por exemplo, se for observada fresagem de baixo para cima e uma diminuição acentuada na fluorescência, pare a fresagem e mude para a fresagem de cima para baixo.
         NOTA: Se uma estrutura for removida muito rapidamente, reduza a corrente de fresagem no software FIB-SEM para retardar a remoção do alvo.
   2. Extensão axial do alvo ≤ 300 nm
      NOTA: Aqui, usaremos o efeito interferométrico para direcionar o fresamento³⁶.
      1. Na GUI do Python, selecione o alvo de interesse na micrografia de fluorescência. O software começará automaticamente a plotar o brilho em função do tempo a cada novo quadro.
      2. Comece fresando de cima para baixo através de um alvo de teste. Monitore o contraste da franja antes de fresar o alvo por meio da intensidade de fluorescência. O alvo de fluorescência é continuamente ajustado a um gaussiano 2D, com o ajuste sendo usado para obter uma intensidade integrada que é então plotada.
      3. Depois que o alvo for fresado, ajuste as oscilações no rastreamento de intensidade para a seguinte função de modelo usando o Python-GUI:
         
         Onde A é a amplitude da oscilação, λ o comprimento de onda de excitação, k um termo de amortecimento representando o comprimento de coerência da fonte de luz, um fator de fase Φ e d é a distância até o objeto de captura. A partir do alvo de teste, todos os termos podem ser previstos dentro de limites razoáveis, de modo que a distância, d, é a única variável livre usada para dizer ao usuário onde o objeto fluorescente está em relação à sua fresagem. Ver Sica et al. para mais detalhes³⁶.
         NOTA: Para alvos subsequentes, o kit de ferramentas ajustará ao vivo o rastreamento de intensidade com a mesma função de modelo e estimará onde parar a fresagem de cima para baixo. Todas as conexões são feitas simultaneamente com a fresagem. O objetivo é interromper a fresagem quando o alvo estiver a uma profundidade igual à metade da espessura desejada da lamela abaixo da superfície superior.
      4. Após a conclusão do fresamento de cima para baixo, finalize a lamela fresando de baixo para cima no modo de seção transversal de limpeza até que a espessura desejada seja alcançada.
9. Tire uma imagem de fluorescência pós-fresagem.

6. Microscopia de luz correlativa e coleção da série da inclinação

1. Depois de transferir a amostra para o CryoTEM, colete uma visão geral do atlas da grade em 182x para permitir cobertura suficiente de todas as grades.
2. Em uma ampliação intermediária apropriada variando de 6.500x a 11.000x, colete uma série de imagens de montagem da lamela final com inclinação de 0°.
3. Leia as imagens de fluorescência multicanal pós-fresagem e a imagem de projeção da etapa 6.2 em um software de transformação projetiva personalizado para registro de ROI (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Escolha um total de 8 a 10 pares de pontos de referência para calcular com precisão a transformação da imagem projetiva.
   NOTA: Esses pontos podem ser características óbvias (por exemplo, bordas de lamelas, contaminação visível por gelo ou orifícios de grade aberta) que estão presentes na microscopia óptica de campo claro e na microscopia eletrônica.

7. Coleção de série de inclinação de alta ampliação

1. Use esta imagem de microscopia eletrônica de fluorescência e transmissão sobreposta como referência para que os usuários selecionem uma área de imagem dentro do limite do tamanho do quadro da câmera para coleta de séries de inclinação de alta ampliação.
2. Selecione a ampliação e os parâmetros da série de inclinação com base na questão biológica.
   NOTA: Para a demonstração, coletamos dados de 54 ° com incrementos de 2 ° em um tamanho de pixel de 3,5 Å 41,42,43.

Resultados

Marcamos células de macrófagos diferenciados com o marcador de tubulina SiR-tubulina antes do congelamento. Seguindo o protocolo, identificamos o MTOC como um único ponto fluorescente de ~ 1 μm de diâmetro sob o microscópio de fluorescência (Figura 1A). Além disso, observamos estruturas fluorescentes semelhantes a fibrilas irradiando do MTOC em direção à periferia da célula, consistentes com a rede de microtúbulos (Figura 1A). Instantâneos de fresagem passo a passo em diferentes espessuras de amostra são mostrados na Figura 1B. Notavelmente, quando a lamela atingiu uma espessura de aproximadamente 800 nm, o único punctum MTOC se resolveu em duas manchas adjacentes, cada uma com cerca de 700 nm de diâmetro. Análises subsequentes confirmaram que cada mancha correspondia a um centríolo individual.

A imagem e a fresagem simultâneas nos permitiram monitorar as mudanças na intensidade da fluorescência em tempo real. Notavelmente, observamos um aumento na fluorescência após a remoção do material não fluorescente a granel e do filme de suporte absorvente (Figura 1B-D). À medida que a lamela foi afinada, de 2 μm para 800 nm, a intensidade da fluorescência diminuiu drasticamente, refletindo a remoção progressiva das estruturas marcadas. Esse declínio continuou à medida que a lamela foi diluída abaixo de 200 nm (Figura 1B-D). A imagem de fluorescência correlacionada e o atlas de microscopia eletrônica demonstram que nosso fluxo de trabalho permite um direcionamento preciso para fresamento (Figura 2A). Tomografias reconstruídas e modelos segmentados revelam que os centríolos são compostos por trigêmeos de microtúbulos, consistente com relatos anteriores 42,43,44,45 (Figura 2A,B). Nos casos em que apenas uma mancha fluorescente é preservada na lamela final, observamos um único centríolo no tomograma correspondente (Figura 2B).

Figura 1: Fluxo de trabalho do CryoFM-FIB-SEM tricoincidente para localização precisa do centro organizador dos microtúbulos. (A) (esquerda) Microscopia de células vivas e (direita) CryoFM do MTOC. Barra de escala = 10 μm. (B) Instantâneos passo a passo de CryoFM e CryoFIB para fresagem direcionada. A visualização FM em close-up é indicada como caixas tracejadas amarelas. Os centríolos são marcados como setas amarelas. Barra de escala = 5 μm. (C) Intensidade de fluorescência do MTOC durante a moagem CryoFIB. (D) Perfil da linha de fluorescência ao longo do MTOC obtido em diferentes estágios durante a moagem CryoFIB. Abreviaturas: CryoFM-FIB-SEM = Microscopia de fluorescência criogênica com fresagem de feixe de íons focalizado e microscopia eletrônica de varredura; MTOC = centro organizador de microtúbulos; ROI = região de interesse. Esta figura é adaptada de Wang³⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detalhes moleculares do MTOC revelados pelo fluxo de trabalho CryoFM-FIB-SEM tricoincidente. (A) FM, EM e modelo de segmentação correlacionados do MTOC. (a) Imagem FM pós-fresagem. Esta é a mesma imagem do último painel da Figura 1B marcada como 180 nm, mas girada para corresponder à reconstrução e segmentação do CryoET. Barra de escala = 5 μm; (b) Vista ampliada da área tracejada em amarelo a partir de (a). (c) Projeção FM e MET correlacionada da área tracejada em ciano indicada em (2). Barra de escala = 1 μm. (d) Modelo segmentado de reconstrução tomográfica na região de interesse (amarelo, centríolo; verde, microtúbulo). Barra de escala = 100 nm. (B) Imagens FM representativas e cortes tomográficos de duas lamelas diferentes apresentando diferentes orientações centríolas. FM: Barra de escala = 5 μm. Corte tomográfico: Barra de escala = 200 nm. Abreviaturas: CryoFM-FIB-SEM = Moagem criogênica por feixe de íons focalizados com microscopia eletrônica de varredura; MTOC = centro organizador de microtúbulos; FM = microscopia de fluorescência; ET = transmissão de elétrons; TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Esta figura é adaptada de Wang³⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nossos resultados destacam a utilidade da plataforma de imagem tricoincidente, que permite imagens de fluorescência e fresagem simultâneas. Aproveitando esse feedback, demonstramos duas estratégias de fresagem guiadas por fluorescência - semidestrutiva e interferométrica - que evitam a necessidade de abordagens complicadas e baseadas em registro que enfrentam limitações fundamentais de precisão relacionadas à incompatibilidade do índice de refração e movimento durante a fresagem 12,33,46. Além disso, uma vez que a orientação precisa depende da microscopia de fluorescência em vez do MEV, a radiação óptica não leva a danos detectáveis, desde que a intensidade seja mantida abaixo do limite que leva à desvitrificação^37,47. Os recursos demonstrados aqui expandem as amostras biológicas acessíveis para incluir alvos de interesse raros e pequenos (<300 nm em extensão axial), simplificando o fluxo de trabalho.

A etapa principal neste protocolo é determinar quando interromper a fresagem com base nas mudanças no brilho fluorescente de um alvo de interesse. Atualmente, isso envolve uma intervenção manual rápida para interromper a moagem nos momentos desejados. Este método provou ser suficiente para os alvos atuais que foram explorados, mas modificações futuras podem integrar ainda mais o kit de ferramentas Python ao sistema FIB para interromper diretamente a fresagem. Essa modificação pode ser necessária se forem necessárias taxas de moagem mais rápidas, pois isso dará menos tempo para intervenção manual. Alternativamente, se taxas de moagem mais lentas puderem ser toleradas, isso dará mais tempo para intervenção manual, se necessário.

Após a geração de estruturas biológicas de interesse contendo lamelas, nosso software de transformação de imagem personalizado permite a correlação no nível CryoTEM, usando visões gerais do atlas das lamelas para orientar a coleta de dados do CryoET. No geral, o protocolo apresentado aqui é essencial para a imagem de alvos biológicos pequenos e raros marcados com fluorescência por tomografia eletrônica criogênica em amostras celulares eucarióticas espessas. Em comparação com os sistemas Cryo-FIB não coincidentes existentes, como o Aquilos 2 com iFLM, nosso fluxo de trabalho atinge uma taxa de sucesso mais alta no direcionamento desses recursos.

Essa alta precisão de mira tem o custo da eficiência. Como a fresagem é manual e não automatizada, o rendimento da geração de lamelas é limitado. Em uma sessão de moagem de 8 h, normalmente produzimos de 6 a 8 lamelas, com aproximadamente cinco contendo um alvo de interesse. No entanto, acreditamos que esse fluxo de trabalho pode ser automatizado no futuro para melhorar o rendimento. A automação exigiria scripts personalizados para monitorar continuamente as áreas de fresagem ativas na imagem FIB e rastrear a intensidade da fluorescência em tempo real para garantir a retenção do alvo. Os principais desafios permanecem, incluindo o estabelecimento de comunicação eficaz entre todos os scripts personalizados e o software de controle para o CryoFIB-SEM e o microscópio de fluorescência.

Olhando para o futuro, há muito trabalho a ser feito para incorporar outras técnicas avançadas de microscopia de fluorescência discutidas anteriormente, incluindo biossensores fluorescentes, imagens de super-resolução e microscopia confocal. No entanto, prevemos que as geometrias tricoincidentes se tornarão padrão em instrumentos futuros e que a imagem de fluorescência simultânea durante o fresamento se tornará rotina. Nesse caso, este protocolo pode servir como um guia valioso para pesquisadores que desejam capturar detalhes em escala molecular das estruturas biológicas pequenas e raras, que, apesar de seu tamanho e abundância, são centrais para a biologia celular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Criofibrilação Aquilos 2	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1&; gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Caixa de grade criogênica compatível com Autogrid	Ciências da Microscopia Eletrônica		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Anéis de autograde e C-clips	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
Suíte de Software CLEM	Grupo de Pesquisa Dahlberg em Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Dragonfly 2022.1	Sistemas de Pesquisa de Objetos		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Delmic B. V.		O sistema ENZEL é um instrumento personalizado e atualmente não está disponível comercialmente
IMOD 4.12	Universidade do Colorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 dewar de nitrogênio líquido	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Ferramenta manipuladora de tampa de pinos	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Kit de ferramentas Python	Grupo de Pesquisa Dahlberg em Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, malha 200, grade EM Au	Ciências da Microscopia Eletrônica		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Serial EM	Universidade do Colorado Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Embarcação padrão Spearlab (transferência dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Pinça	Ciências da Microscopia Eletrônica		https://www.emsdiasum.com/style-3sa