Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .
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Artigo de método
In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de cálcio é uma ferramenta importante para monitorar os mecanismos de sinalização que influem Ca2+ no citosol ou liberam Ca2+ dos estoques intracelulares de Ca2+ . O uso de camundongos Pirt-GCaMP3, que têm o sensor Ca2+ GCaMP3 inserido a jusante da região promotora de Pirt e expresso em quase todos (>95%) neurônios sensoriais primários, permite o monitoramento simultâneo da atividade de >3.000 neurônios via imagem Ca2+ de neurônios sensoriais primários do gânglio trigêmeo (TG). Isso permite que os investigadores estudem as respostas das redes neurais a estímulos nocivos e respostas somatossensoriais e hormonais in vivo, que de outra forma seriam muito difíceis de detectar usando outros métodos.
Especificamente, a capacidade de monitorar a área TG que inerva a face e outras áreas da cabeça separadamente permite monitorar os neurônios sensoriais primários ativados por estímulos da área facial antes das camadas posteriores do processamento de neurônios. O número de neurônios que geram transientes de Ca2+ e a amplitude dos transientes de Ca2+ , que indicam sua sensibilidade a diferentes modalidades sensoriais, também podem ser observados. Além disso, os investigadores podem medir o diâmetro dos neurônios, que é um indicador do tipo de fibra ativada (fibras mecânicas não nocivas vs. fibras nociceptivas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Portanto, a imagem de cálcio Pirt-GCaMP3 de TG seria uma ferramenta poderosa para dissecar modalidades sensoriais específicas e tipos de células neuronais para estudar a dor de origem do trigêmeo (dor orofacial e craniofacial, dor de dente ou dente, dor de cabeça, enxaqueca, dor na articulação temporomandibular, neuralgia do trigêmeo), coceira e toque e quaisquer outras sensações somatológicas, bem como respostas hormonais.
Introdução
Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente os tecidos, incluindo a pele, e transmitem sinais sensoriais para o sistema nervoso central (medula espinhal ou tronco cerebral). Os neurônios do gânglio trigêmeo (TG) inervam a cabeça e respondem a estímulos sensoriais, incluindo dor nos dentes, região periorbital, regiões orofaciais e craniofaciais, articulação temporomandibular 1,2 e meninges 3,4,5. Os neurônios TG variam em tamanho, nível de mielinização e perfis de expressão g....
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Protocolo
Todos os procedimentos aqui descritos são realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. A cirurgia é de não sobrevivência. As secções 1 e 2 deste procedimento devem ser efectuadas imediatamente após o início. A secção 3 pode ser realizada numa data posterior.
1. Fixação e cirurgia do mouse para imagens TG do lado direito
NOTA: Os camundongos Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J18 precisam ter tamanho corporal adulto (geralmente 8 semanas ou mais), independentemente do sexo. A imagem TG bilateral é po....
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Resultados
Imagem de um grande número de neurônios e ramos específicos do trigêmeo por varredura confocal do gânglio trigêmeo Pirt-GCaMP
Após a exposição cirúrgica ao TG em camundongos Pirt-GCaMP3, a microscopia confocal permite a obtenção de imagens de mais de >3.000 neurônios simultaneamente (Figura 4). Isso fornece a poderosa vantagem de observar milhares de neurônios TG simultaneamente em seu contexto fisiológico normal. Os transientes espontâneos de Ca2+ podem ser.......
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Discussão
Os distúrbios dolorosos da articulação temporomandibular e da periodontite apical afetam aproximadamente 5%36 e 30-70%37,38 da população geral, respectivamente. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, mucosa oral, dentes e regiões periorbitais, e sua plasticidade contribui para a dor persistente. A cultura de células e os explantes podem ser usados para estudar neurônios, mas .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde Grants R01NS0128574 e R01DE031477 (para YSK) e um Prêmio STAR em Ascensão do sistema da Universidade do Texas (YSK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Injeção Anasada (Xilazina) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| Flurar 5x/0.25 M27 obejctive | Cal Zeiss | 420130-9900-000 | |
| Aplicadores com ponta de algodão | McKesson | 24-106-1S | |
| Hemostático curvo | Ferramentas de Belas Ciências | 13007-12 | |
| Controlador de temperatura DC | FHC | 40-90-8D | |
| Almofada de aquecimento do controlador de temperatura DC | FHC | 40-90-2-05 | |
| Fórceps Revestido de Cerâmica Dumont | Ferramentas de Belas Ciências | 11252-50 | |
| Controlador de temperatura FHC DC | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (isoflurano) | MWI Saúde Animal, Grupo Piramal | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Ferramentas de Belas Ciências | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| ImagemJ | Institutos Nacionais de Saúde | ij153 | |
| Ketaset (cetamina) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Suporte de cabeça de anestesia a gás de camundongo modelo 923-B (camundongo adulto) | Instrumentos Kopf | 923-B | |
| Fita de palco verde luminescente | JSITON/ Amazônia | B803YW8ZWL | |
| Sistema de peça de mão de laboratório elétrico compacto M35 | Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc. | M35 | |
| Vaporizador de isoflurano Matrx VIP 3000 | Marca intermediária | 91305430 | |
| Micro tesoura de dissecação | Roboz | RS-5882 | |
| Tesoura de mola de micro dissecação | Ferramentas de Belas Ciências | 15023-10 | |
| Tesoura de mola de micro dissecação | Roboz | RS-5677 | |
| Mini sonda de termistor retal | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Tesoura de operação | Roboz | RS-6812 | |
| Camundongos Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J | Universidade Johns Hopkins | N/A | Ambos os sexos podem ser visualizados igualmente bem. Os camundongos devem ter pelo menos 8 semanas de idade devido à expressão fraca ou intermitente do promotor de Pirt em camundongos mais jovens. |
| Cloreto de potássio | Fisher Científico | BP366-500 | |
| Quadro estereotáxico | Kopf Modelo 923-B | 923-B | |
| Máscara estereotáxica (ativa) para camundongos < 30g com bisnagas | RWD Ciências da Vida | 68663 | |
| Fresa TNT de fissura cônica (31P) | Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc. | 31P-OURO | |
| Camundongos td-Tomato C57BL/6J | Laboratório Jackson | 7909 | |
| Placa superior, 6 pol x 10 pol. | Newport | 290-TP | |
| Pipeta de transferência, 3mL | Cole Parmer | UX-06226-23 | |
| Camundongos TrpV1-Cre C57BL/6J | Laboratório Jackson | 17769 | |
| Microscópio confocal Zeiss LSM 800 | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Edição Azul) 2.6 |
Referências
- Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
- Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S.
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Reimpressões e permissões
