Artigo de método

Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica com fibrose

DOI:

10.3791/68294

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18 de julho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) com disfunção metabólica, alterações na expressão gênica hepática e alterações histopatológicas hepáticas que se assemelham à MASLD humana, incluindo fibrose que progride para fibrose avançada estágio 3. Esse modelo pode ser usado em estudos de fisiopatologia da MASLD e em estudos pré-clínicos de novas terapias.

Resumo

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A fibrose hepática é o preditor mais importante de desfechos adversos na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD). Em estudos pré-clínicos de MASLD, os camundongos são o modelo de doença mais comumente usado. No entanto, nesses modelos, a fibrose hepática é difícil de induzir. Este protocolo descreve um modelo de camundongo de MASLD no qual camundongos Ay hiperfágicos são alimentados com uma dieta rica em gordura e frutose, que se assemelha à dieta média nos EUA. Os camundongos desenvolvem esteatose hepática, lesão, inflamação e fibrose. A fibrose progride de fibrose pericelular, estágio 1, após 16 semanas, para fibrose em estágio 3 após 12 meses. Esses camundongos também desenvolvem obesidade, hipertrigliceridemia, intolerância à glicose e hiperinsulinemia. Este modelo de doença replica a histopatologia hepática, as alterações na expressão gênica hepática e a disfunção metabólica da doença humana. Este protocolo inclui dois métodos para quantificar a fibrose: coloração histológica do colágeno por picro-sirius red e quantificação do conteúdo hepático de hidroxiprolina. Esses métodos podem ser usados para o estudo da fisiopatologia da MASLD e para estudos pré-clínicos de terapias potenciais.

Introdução

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A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) é a doença hepática mais comum, com prevalência de 31% a 40% nos EUA e 42% em todo o mundo 1,2,3,4. Pacientes com MASLD podem desenvolver esteato-hepatite associada à disfunção metabólica (MASH), esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), cirrose e carcinoma hepatocelular 5,6. A MASLD aumenta o risco de carcinoma hepatocelular e, após o recente aumento na prevalência de MASLD, tornou-se a doença hepática mais comum em pacientes que desenvolvem carcinoma hepatocelular 7,8. Na MASLD, a fibrose é o principal preditor de progressão para cirrose e de desfechos clínicos adversos, incluindo morbidade relacionada ao fígado (descompensação hepática, insuficiência hepática ou câncer de fígado) e mortalidade relacionada ao fígado 6,9,10,11. Nesse sentido, a Food and Drug Administration incentiva o desenvolvimento de terapias com foco em MASH/NASH com fibrose, bem como o uso de modelos animais apropriados12.

Em estudos pré-clínicos de drogas e em estudos mecanísticos de MASLD, os modelos de camundongos são mais comumente usados13. Milhares de modelos de camundongos de MASLD foram descritos, sugerindo uma falta de consenso sobre um modelo ideal 13,14. O estabelecimento de modelos ótimos enfrenta vários desafios. Embora seja relativamente fácil induzir obesidade e esteatose em camundongos alimentando-os com dietas ricas em gordura, a fibrose hepática é mais difícil de induzir 13,14,15,16. Em modelos MASLD conduzidos por dietas obesogênicas, a fibrose se desenvolve lentamente17 Embora essa progressão lenta possa imitar melhor a doença humana18, ela aumenta a duração e o custo dos estudos em animais. Dietas com alto teor de colesterol (por exemplo, 2%) promovem o desenvolvimento de fibrose; no entanto, também diminuem a síntese endógena de colesterol, que é o oposto do aumento descrito na doença humana 15,16. Alguns modelos MASLD usam camundongos mutantes ou geneticamente modificados; no entanto, eles podem ter ressalvas: camundongos ob/ob desenvolvem obesidade, esteatose e resistência à insulina, mas não possuem leptina, que é um mediador da fibrose; Camundongos PTEN nulos desenvolvem esteatose, mas não desenvolvem resistência à insulina15,17. Portanto, os modelos de camundongos de MASLD geralmente requerem longas durações de estudo, dietas com alto teor de colesterol ou manipulações genéticas para desenvolver fibrose significativa14. Para resolver alguns desses problemas, desenvolvemos um modelo de camundongo no qual os animais desenvolvem MASLD com fibrose que progride de fibrose pericelular / perissinusoidal (estágio 1) para fibrose em ponte (estágio 3) 19 .

O objetivo deste artigo é descrever este modelo de MASLD com fibrose hepática e dois métodos para quantificar a fibrose: coloração histológica do colágeno por picro-sirius red e quantificação do conteúdo de hidroxiprolina hepática.

A justificativa para o desenvolvimento desse modelo foi que os modelos animais mais úteis são aqueles que melhor replicam a doença humana, tanto nos condutores da doença quanto nas alterações na histopatologia e na expressão gênica. Portanto, usamos uma dieta que se assemelha à dieta média nos EUA, incluindo quantidades moderadamente altas de gordura e frutose19,20. Fornecemos essa dieta a camundongos portadores da mutação amarela Agouti (Ay), que tem sido amplamente utilizada como modelo de obesidade21. Esses camundongos expressam de forma ubíqua a proteína cutia, um antagonista dos receptores de melanocortina, incluindo MC4R, causando hiperfagia e replicando o aumento da ingestão de alimentos que é comum na obesidade humana21 , 22 , 23 . Este modelo recapitula as alterações que definem o MASH, incluindo esteatose, lesão hepatocelular, inflamação, fibrose e disfunção metabólica.

As principais vantagens desse modelo são as características que o tornam semelhante à doença humana. O modelo usa uma dieta do tipo ocidental, que foi projetada para se assemelhar à dieta típica dos EUA e demonstrou ser a dieta mais eficaz na replicação do fenótipo do MASLD humano14,20. Os camundongos desenvolvem alterações histopatológicas hepáticas semelhantes às descritas no fígado de humanos com MASH19,24. Os camundongos desenvolvem disfunção metabólica, que é um critério essencial para o diagnóstico de MASLD5. Os fígados de camundongos com MASH mostram mudanças na expressão gênica que recapitulam as de humanos com MASH / NASH19. Um estudo recente comparou 39 modelos de camundongos de MASLD por sua semelhança com a doença humana. Incluiu camundongos knock-out MC4R, que compartilham o mesmo mecanismo de hiperfagia e receberam a mesma dieta que o modelo que descrevemos14. Esse modelo ficou em quinto lugar (de 39) por sua semelhança com o MASLD humano, avaliado pelo fenótipo, histopatologia hepática e transcriptômica14.

As vantagens adicionais deste modelo são: Os camundongos Ay estão disponíveis comercialmente no Laboratório Jackson e estão disponíveis na cepa C57BL / 6J, que é comumente usada em estudos metabólicos21,25; camundongos mutantes são facilmente identificáveis pela cor da pelagem; o modelo pode ser combinado com modelos de ganho ou perda de função para estudar o papel de genes específicos no desenvolvimento de MASLD; e, finalmente, o modelo não usa deficiências nutricionais (deficiência de colina ou metionina), componentes alimentares incomuns (ácido cólico, etionina), um teor excepcionalmente alto de nutrientes específicos (gorduras trans) ou hepatotoxinas (tetracloreto de carbono), que não são causas comuns de MASLD e podem não replicar a doença humana 13,14,17.

Este método é apropriado para a investigação de mecanismos que contribuem para o desenvolvimento e progressão do MASLD, bem como para a avaliação de intervenções para seu tratamento ou prevenção. Este modelo é particularmente útil porque os animais não apenas desenvolvem esteato-hepatite e disfunção metabólica, mas também desenvolvem fibrose que progride para o estágio 3. O modelo pode não ser apropriado para o estudo de mecanismos que afetam o comportamento alimentar (por exemplo, agonistas de GLP1R), uma vez que esses camundongos apresentam hiperfagia.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Brooklyn College; Protocolo IACUC número 318.

1. Modelo de camundongo de MASLD com fibrose

  1. Crie camundongos para produzir descendentes Ay. Configure casais reprodutores com camundongos Ay (B6. Cg-Ay/J). Registre a data de nascimento dos filhotes.
  2. Certifique-se de que as ninhadas tenham um número semelhante de filhotes para promover alimentação e crescimento adequados e uniformes. Procure ter de cinco a seis filhotes por ninhada, pois é o tamanho médio da ninhada para camundongos C57BL / 6J. Filhotes extras, preferencialmente aqueles do sexo não necessário, podem ser sacrificados ou adotados.
    NOTA: O uso de machos Ay e fêmeas do tipo selvagem (C57BL / 6J Jax 0000664) pode melhorar a eficiência da reprodução, uma vez que os camundongos fêmeas C57BL / 6J do tipo selvagem são fáceis de obter e podem ser melhores reprodutores do que os camundongos fêmeas Ay.
  3. Configure gaiolas para experimentos conforme descrito abaixo.
    1. Identifique os camundongos Ay pela cor amarela da pelagem. Atribua uma identificação única a cada mouse e marque ou marque os mouses.
      NOTA: O alelo amarelo agouti (Ay) do gene agouti confere uma cor de pelagem amarela. O alelo é semidominante em heterozigotos. A homozigosidade causa letalidade embrionária. Portanto, camundongos com cor de pelagem amarela são heterozigotos para o gene Ay.
    2. Desmame de camundongos aos 21 dias de idade. Agrupe camundongos que serão alojados na mesma gaiola durante o estudo. Alojar três ou quatro camundongos Ay por gaiola, de acordo com o peso corporal esperado e as diretrizes institucionais.
    3. Alimente ração e água padrão. Camundongos domésticos em temperatura padrão (20-23 ° C) e umidade relativa (40% a 60%) com um ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuridão.
  4. Alimente os camundongos Ay com a dieta rica em gordura e frutose (Dieta rica em gordura e frutose, HFFD) a partir das 8 semanas de idade, conforme descrito abaixo.
    1. Forneça aos camundongos Ay a dieta ocidental, que é rica em gordura e sacarose (calorias ajustadas Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Prepare uma solução contendo frutose (23 g/L) e glicose (19 g/L) em água de bebida. Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 μm e armazená-la em frascos estéreis. Depois de aberto, mantenha a solução refrigerada.
    3. Forneça aos camundongos a solução contendo frutose e glicose para beber, em frascos estéreis. Substitua a solução e os frascos pelo menos semanalmente, verificando o crescimento de microrganismos.
    4. Use camas de gaiola sem valor nutricional (por exemplo, lascas de madeira).
  5. Alimente os ratos de controle com uma dieta pobre em gordura e frutose, conforme descrito abaixo.
    NOTA: O tipo de camundongos de controle a serem usados depende do desenho do estudo: Se camundongos Ay-HFFD forem usados para avaliar o efeito dos medicamentos, os camundongos de controle podem ser camundongos Ay-HFFD tratados com placebo. Se o modelo for usado para estudar o efeito de uma modificação genética no desenvolvimento da fibrose, camundongos Ay-HFFD sem a modificação genética podem ser usados como controles. Se desejar controles sem MASH, siga as etapas descritas aqui.
    1. Use camundongos do tipo selvagem que são irmãos de ninhada dos camundongos Ay. Eles podem ser identificados pela cor da pelagem preta.
    2. Alimente os camundongos com uma dieta de controle (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; conhecida como Low Fat and Fructose Diet, LFFD) começando na mesma idade. Forneça água potável regular aos ratos.
  6. Monitore o desenvolvimento da obesidade pesando os ratos semanalmente, colocando os animais acordados em um recipiente em uma balança de laboratório e registrando seu peso.
  7. Certifique-se de que os ratos tenham comida e bebida suficientes o tempo todo. Monitore e registre o consumo de alimentos e soluções para estimar a ingestão calórica, se desejado.
  8. Colete tecidos conforme descrito abaixo.
    1. Realize a coleta de tecido após 16 semanas na dieta HFFD. Eutanasiar o camundongo por inalação de dióxido de carbono (ou outros métodos aprovados pela IACUC da instituição).
      NOTA: Após 16 semanas, os camundongos Ay alimentados com a dieta HFFD geralmente apresentam fibrose em estágio 1; Prolongar o tempo levará a uma maior fibrose, progredindo para o estágio 3 após 9 a 12 meses.
    2. Pese o mouse e registre o peso19.
    3. Colete sangue, se necessário. Para fazer isso, retire sangue da veia cava inferior com uma seringa de 1 mL e agulha 27G após abrir o abdômen e antes de dissecar o fígado (ou use qualquer outro método aprovado pela IACUC).
    4. Disseque o fígado abrindo o abdômen com uma incisão na linha média, segurando o fígado pelo hilo com uma pinça e cortando os ligamentos que ligam o fígado ao diafragma e ao retroperitônio com uma tesoura. Pese o fígado e registre o peso.
    5. Enxágue o fígado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. Fotografe o fígado e inclua uma régua ou outro objeto como referência de tamanho na imagem. Coloque o fígado em uma placa de Petri que é colocada no gelo.
    6. Dissecar amostras (aproximadamente 100 a 150 mg por amostra) de vários lobos, incluindo o lobo mediano, o lobo esquerdo e o lobo direito. Certifique-se de que as amostras tenham uma espessura não superior a 4 mm para facilitar a fixação. Coloque-os em solução fixadora (formalina 10% ou formaldeído 4%) por 24 h e processe-os para análise histopatológica (veja abaixo).
    7. Dissecar amostras adicionais de vários lóbulos. Coloque-os em tubos (1,5 ou 2 mL), congele-os submergindo-os em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C. Essas amostras serão usadas para medir o conteúdo de hidroxiprolina.
    8. Colete amostras de outros órgãos, se desejar (tecido adiposo, músculo, etc.)

2. Coloração histoquímica do colágeno e quantificação morfométrica

NOTA: As etapas que requerem o uso de produtos químicos perigosos e/ou voláteis devem ser feitas em uma capela de exaustão. Todas as lâminas devem ser processadas em paralelo usando pratos de coloração e porta-lâminas.

  1. Prepare as secções hepáticas conforme descrito abaixo.
    1. Fixe o tecido hepático mantendo-o em formalina (ou formaldeído) por 24 h em temperatura ambiente. Use um volume de fixador 20 vezes maior que o volume do tecido. Em seguida, transfira os tecidos para etanol a 70%. O protocolo pode ser pausado neste momento.
      NOTA: Os tecidos podem ser colocados em de histologia que são então colocados em um recipiente com fixador ou, alternativamente, em recipientes ou tubos individuais.
    2. Incorpore tecidos em parafina. Isso geralmente é feito por uma instalação ou serviço central de histopatologia.
    3. Obtenha seções com espessura de 0,5 μm montadas em lâminas (lâminas não carregadas são adequadas). Deixe as seções secarem expondo-as ao ar em temperatura ambiente. Uma instalação ou serviço central de histopatologia geralmente faz isso. O protocolo pode ser pausado neste momento.
  2. Desparafinizar e reidratar seções conforme descrito abaixo.
    1. Desparafinizar as seções submergindo-as em duas trocas de solução de desparafinização/limpeza (xileno ou citrisolv), por 5-15 min em cada uma.
    2. Reidrate submergindo sucessivamente as lâminas em etanol 100%, etanol 95%, etanol 70% e água, por 5 min em cada.
  3. Seções de coloração com picro-sirius vermelho conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe as seções em uma solução de vermelho Sirius (vermelho direto 80) 1 g / L em ácido pícrico 1,3% por 1 h. Não manche por muito mais tempo, pois o vermelho direto pode manchar outras estruturas além do colágeno (por exemplo, núcleos). Adicione verde rápido (1 g/L) à solução de coloração se a contracoloração for desejada26. Alternativamente, core os núcleos com hematoxilina27 de Weigert.
    2. Retorne a solução vermelha de picro-sirius para um recipiente fechado de vidro escuro ou plástico para armazenamento. A solução pode ser reutilizada várias vezes (por pelo menos 20 anos27).
  4. Mergulhe as amostras em etanol (100%) por 5 min para desidratar. Repetir com uma segunda mudança de etanol.
  5. Mergulhe na solução de limpeza (xileno ou citrisolv) até que sejam removidos individualmente para montagem.
  6. Remova uma lâmina de cada vez da solução de limpeza e remova o excesso de líquido enxugando em papel toalha. Adicione meio de montagem (aproximadamente 50 a 100 μL). Cubra a seção com uma lamínula e pressione suavemente a lamínula para baixo para remover as bolhas de ar. Deixe secar ao ar.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado neste momento.
  7. Observe as seções usando um microscópio de luz com iluminação de campo claro e objetivas de 4x a 20x - o colágeno aparece vermelho sobre um fundo amarelo-laranja claro. Áreas de interesse de imagem com uma câmera colorida, de acordo com as instruções da câmera.
  8. Realize imagens com microscopia de luz polarizada conforme descrito abaixo.
    1. Envolva e ajuste os filtros polarizadores e analisadores ortogonalmente para garantir que o colágeno seja visível e que o sinal de fundo seja mínimo. O colágeno é visível como branco, amarelo ou laranja em um fundo escuro. Em seções com pouca ou nenhuma fibrose, o colágeno nas paredes dos vasos sanguíneos será visível. Mantenha as configurações, incluindo a intensidade da iluminação, as mesmas para todas as amostras a serem comparadas.
    2. Imagem usando uma câmera monocromática ou modo monocromático em uma câmera colorida. Use uma objetiva de ampliação de 4x. Tire várias imagens por seção. Evite áreas próximas ao hilo se tiverem grandes vasos sanguíneos. Use as mesmas configurações para todas as imagens a serem comparadas.
  9. Execute a quantificação morfométrica usando o Photoshop (alternativa a) conforme descrito abaixo.
    1. Quantifique a área branca nas imagens, que corresponde ao colágeno. No Photoshop, clique em Selecionar > intervalo de cores, selecione Realces e ajuste os parâmetros Imprecisão e Intervalo para selecionar pixels brancos, correspondentes ao colágeno. Em seguida, selecione Janela > Histograma > Exibição expandida e registre o número de pixels selecionados, mostrado ao lado do parâmetro Pixels. Use os mesmos parâmetros para todas as imagens a serem comparadas.
    2. Quantifique a área total da imagem. No Photoshop, clique em Selecionar > tudo e grave o número total de pixels como feito anteriormente.
    3. Calcule a porcentagem da área da imagem correspondente ao colágeno dividindo o número de pixels brancos pelo número total de pixels. Os valores são geralmente expressos como porcentagens de área.
  10. Realize a quantificação morfométrica usando ImageJ (alternativa b) conforme descrito abaixo.
    1. Selecione áreas brancas nas imagens que correspondem ao colágeno. Abra a ferramenta Limite clicando em Imagem > Ajustar > Limite (ou pressione Shift + T). Defina o intervalo de limite para garantir que apenas as regiões coradas com colágeno (áreas brancas) sejam destacadas em vermelho (por exemplo, limite mínimo 64; limite máximo: 255) e clique em Aplicar. Isso binarizará a imagem, convertendo a região de colágeno em preto e o fundo em branco.
    2. Meça a área total da imagem clicando em Analisar > Definir medidas. Verifique a área e o rótulo de exibição. Clique em OK. Clique em Analisar > Medir (ou pressione M no teclado). A janela Resultados exibirá a área total da imagem.
    3. Para medir a área e a porcentagem de colágeno, primeiro ative Limitar ao limite clicando em Analisar > Definir medidas. Verifique a área, a fração da área (o ImageJ calculará a % de colágeno automaticamente), o limite ao limite e o rótulo de exibição. Clique em OK. Em seguida, clique em Analisar > Medir (ou pressione M). A janela Resultados mostrará: Área de colágeno (contagem absoluta de pixels) e Fração de área (% de colágeno da imagem total).
    4. Salve os resultados selecionando Salvar como ou copie-os para a área de transferência e cole-os em uma planilha.

3. Quantificação de hidroxiprolina hepática

NOTA: As etapas que requerem o uso de bases fortes e ácidos devem ser realizadas com equipamento de proteção individual adequado.

  1. Pesar as amostras de fígado preparadas no passo 1.8.7 e registar os pesos. Colocar alíquotas de tecido num tubo adequado à homogeneização. Adicione água deionizada usando uma proporção água-tecido de 900 μL de água por 100 mg de tecido.
  2. Homogeneizar por batimento de contas ou outro método de acordo com as instruções do fabricante até que o tecido esteja completamente homogeneizado, conforme avaliado por observação visual. O protocolo pode ser pausado neste ponto e os homogeneizados podem ser armazenados a -20 °C.
  3. Realize a precipitação de proteínas conforme descrito abaixo. As etapas a seguir são executadas em temperatura ambiente, exceto quando uma temperatura diferente é especificada.
    1. Transfira aproximadamente 500 μL para 1000 μL de homogeneizado para tubos de centrífuga de 1,5 mL. Transfira o mesmo volume para todas as amostras.
    2. Adicione ácido tricloroacético para uma concentração final de 12% (por exemplo, adicione 120 μL de ácido tricloroacético a 880 μL de homogenato)28. Vórtice brevemente para misturar.
    3. Incubar amostras em banho-maria por 30 min. Centrifugue a 6.000 x g a 4 °C por 10 min. Forma-se um precipitado contendo a proteína. Remover o sobrenadante por aspiração. Mantenha os tubos no gelo.
    4. Adicione 1 mL de etanol gelado (100%) para lavar o pellet. Ressuspenda o pellet por sonicação (ou outro método) e verifique visualmente se o material foi ressuspenso. Centrifugar a 6.000 x g a 4 °C durante 10 min e remover o sobrenadante por aspiração. Use as configurações de sonicação de acordo com as instruções do equipamento (por exemplo, usando um sonificador Branson SFX 150 com uma microponta de 3,2 mm de diâmetro, uma amplitude de 70% por 10 s é eficaz para a maioria das amostras). Repita a lavagem 2x.
    5. Deixe o pellet secar ao ar por 10 min ou mais, se necessário.
  4. Realize a hidrólise de proteínas conforme descrito abaixo.
    1. Adicionar 800 μL de ácido clorídrico 6 N aos tubos que contêm o precipitado proteico. Ressuspenda o pellet por sonicação (ou outro método), usando as mesmas configurações da etapa 3.3.4.
    2. Transfira a suspensão de proteínas para tubos de vidro ou frascos com tampas de rosca; feche bem. Incubar os tubos em estufa a 110 °C durante 22 ± 2 h29.
    3. Tubos de centrífuga a 16.000 x g por 10 min; partículas formarão um pellet. Isso geralmente requer a transferência do hidrolisado dos frascos de vidro para os tubos de centrífuga antes da centrifugação.
    4. Transfira o sobrenadante, que contém hidroxiprolina, para tubos de 1,5 mL. O protocolo pode ser pausado neste momento. Os hidrolisados podem ser armazenados a 4 °C.
  5. Prepare uma curva padrão para a concentração de hidroxiprolina. Para amostras de fígado com estágio de fibrose 1 a 3, usando as quantidades de tecido indicadas neste protocolo, concentrações padrão de até 125 μg/mL são adequadas (por exemplo,., diluições seriadas de 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 e 0 μg/mL). Preparar os padrões diluindo a hidroxiprolina em ácido clorídrico 6 N.
  6. Transfira 40 μL de cada amostra e padrão para tubos de centrífuga marcados com 1,5 mL. Adicione 10 μL de hidróxido de sódio 10 N a cada um e vortex brevemente para misturar.
  7. Execute a oxidação da hidroxiprolina conforme descrito abaixo.
    1. Prepare o tampão acetato-citrato contendo ácido acético 1,2% v/v, ácido cítrico 46 g/L, acetato de sódio trihidratado 120 g/L e hidróxido de sódio 34 g/L em água deionizada e ajuste o pH do tampão para 6,5.
    2. Prepare uma solução de 12,7 g/L de cloramina T em água: n-propanol: acetato-citrato tampão (1: 1: 8 v: v: v). Primeiro, dissolva a cloramina T em água misturando, depois adicione n-propanol, misture e, em seguida, adicione tampão acetato-citrato e misture.
    3. Adicione 450 μL de solução de cloramina aos tubos com amostras e padrões. Misture por vórtice. Incubar à temperatura ambiente durante 25 min30.
  8. Preparar o reagente de Ehrlich com 1 M 4-(Dimetilamino)benzaldeído em ácido perclórico:propanol 1:2 (v/v). Adicione 500 μL do reagente de Ehrlich às amostras e padrões. Misture por vórtice.
  9. Incubar a 65 °C durante 20 min num bloco de aquecimento, banho-maria ou incubadora. Quando a incubação terminar, deixe as amostras e os padrões esfriarem até a temperatura ambiente.
  10. Medir a absorvância das amostras e dos padrões no comprimento de onda de 550 nm, utilizando um espectrofotómetro.
  11. Plote a absorbância em relação às quantidades padrão e use uma regressão linear para fazer uma curva padrão. Use os parâmetros da curva padrão para calcular a concentração de hidroxiprolina nas amostras.
  12. Calcular a quantidade de hidroxiprolina nas amostras de fígado com base no volume total do hidrolisado (etapa 3.4) e normalizar pela massa de tecido correspondente ao volume de homogeneizado utilizado para a precipitação das proteínas (etapa 3.3.1). Expresse os resultados como ng de hidroxiprolina por mg de tecido. Em alternativa, pode medir-se a concentração de proteínas nos homogeneizados e expressar-se os resultados em massa de hidroxiprolina por massa de proteína.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os camundongos Ay alimentados com HFFD ganham mais peso do que os camundongos do tipo selvagem alimentados com o LFFD e desenvolvem obesidade (Figura 1A). Eles ganham peso mais rapidamente durante as primeiras 4 semanas de alimentação HFFD, ganhando aproximadamente 3-4 g / semana. Após 8 semanas, eles ganham peso a uma taxa semelhante à dos camundongos controle (aproximadamente 0,6 g / semana) 19. Após 16 semanas, os camundongos Ay al...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um modelo de camundongo de MASLD com fibrose hepática que replica a doença em humanos 5,6. Os camundongos desenvolvem esteatose hepática, como demonstrado por esteatose micro e macrovesicular mista na histologia e elevado conteúdo hepático de triacilglicerol19. Os camundongos também desenvolvem obesidade, hipertrigliceridemia, intolerância à glicose e foram relatados como hipertenso...

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Divulgações

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Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health K22CA178098, R03DK101863 e fundos de R15DK131627 e start-up do Brooklyn College (para JMC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4-(Dimetilamino)benzaldeídoSigma-AldrichD2004
Ácido acéticoVáriosNA
Dieta de calorias ajustadas Dieta ocidentalInotivTD.88137Dieta contém gordura (42% kcal) e sacarose (34% p/p). Outros fornecedores fornecem dietas com a mesma composição
B6. Cg-ay/JO Laboratório Jackson000021A cepa possui a mutação amarela letal de Agouti e um fundo C57BL6/J. Atualmente, o Laboratório Jackson mantém a cepa criopreservada.
C57BL/6JO Laboratório Jackson000664
CentrífugaVáriosNACom rotor para tubos de 1,5 mL, refrigerado, capaz de atingir 16.000 xg.
CentrífugaVáriosNA
Cloramina-T hidratadoSigma-Aldrich857319
Ácido cítricoVáriosNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EtanolLaboratórios de Descontaminação2701
Solução de formalina, tamponado neutroSigmaHT501128
FrutoseSigma-AldrichF0127
GlicoseSigma-AldrichG8270
Equipamentos de processamento histológicoNANAA incorporação e o seccionamento podem ser feitos no laboratório do investigador ou em instalações externas
HomogeneizadorVáriosNABatedores de esferas são eficientes para processar múltiplas amostras. Outros métodos de homogeneização podem ser usados
Ácido clorídricoVáriosNA
HidroxiprolinaSigmaH5534
Dieta de controle com baixo teor de gorduraInotivTD.08485Dieta controle, baixa em gordura (13% kcal) e sacarose (12% p/p)
Microscópio equipado para microscopia de luz polarizadaVáriosNA
N-propanolVáriosNA
Ácido perclóricoVáriosNA
Média de Montagem PermountFisher ScientificSP15-100
Ácido Pícrico, Solução Aquosa Saturada, EspectroFisher18612375
Triidrato de acetato de sódioVáriosNA
Hidróxido de sódioVáriosNA
SonicatorVáriosNAO Sonicator é útil para resuspender pellets na etapa 2.5, mas não é absolutamente necessário
Ácido tricloroacéticoVáriosNA
Óculos VWR Micro Cover, RetangularesVWR 48393-081
Láminas de Microscópio VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
Água, deionizadaVáriosNAÁgua desionizada do sistema de purificação ou comprada de um fornecedor.
XilenosFisher ScientificX3FAgente de Compensação Citrisolv   (Fisher 22-143-975) é vendido como uma alternativa ambientalmente amigável

Referências

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