Projeto de Sistemas de Fermentação em Estado Sólido para Produção de Enzimas Extracelulares Hidrolíticas Poliméricas por Fungos Filamentosos

Summary

Este protocolo utiliza farelo de trigo em um sistema rotativo de fermentação em estado sólido para aumentar a produção de enzimas. O substrato, complementado com indutores como a quitina, suporta o crescimento de fungos sob condições controladas. Os resultados demonstram rendimentos enzimáticos 4-6 vezes maiores em comparação com a fermentação submersa, mostrando a adaptabilidade e eficácia do método para diversas aplicações biotecnológicas.

Abstract

A fermentação em estado sólido (SSF) é um processo de bioconversão que utiliza um substrato sólido que não se dissolve em meio aquoso. Os microrganismos crescem na superfície do substrato e penetram em sua matriz sólida para extrair nutrientes essenciais para o seu desenvolvimento. A FES é caracterizada por um mínimo de água livre, com um teor de umidade do substrato mantido acima de 70%, e envolve três fases interconectadas - gasosa, líquida e sólida. Este protocolo descreve o uso do farelo de trigo, um subproduto agroindustrial, como substrato base para a produção de enzimas em um sistema rotativo. O substrato é suplementado com um indutor, como quitina, quitosana, amido ou celulose, para promover a síntese de proteínas hidrolíticas. O sistema é altamente adaptável, permitindo o uso de diferentes formas de fungos, incluindo micélio, esporos ou pellets. Na metodologia descrita, o indutor e o substrato são misturados na proporção de 1:100 (m/m), esterilizados em autoclavagem e ajustados ao nível de umidade desejado com água estéril. O inóculo fúngico é então adicionado e o sistema rotativo opera a 10 rpm para garantir mistura e oxigenação adequadas. O sistema é incubado por 6-8 dias em condições ideais de crescimento para fungos mesófilos ou termofílicos/termotolerantes, aumentando sua versatilidade. Após a incubação, a enzima é facilmente extraída usando um tampão frio apropriado (por exemplo, acetato, citrato ou fosfato), dependendo do tipo de enzima. O extrato é clarificado por centrifugação e filtração para obter um sobrenadante livre de células. A enzima pode então ser ainda mais concentrada ou purificada conforme necessário. Os resultados demonstraram um aumento de 4 a 6 vezes na atividade enzimática em comparação com a fermentação submersa (SmF), destacando a eficácia do sistema. Sua adaptabilidade a diferentes substratos, indutores e espécies de fungos o torna uma ferramenta valiosa para várias aplicações biotecnológicas.

Introduction

A fermentação em estado sólido (SSF) surgiu como uma tecnologia de bioconversão promissora e sustentável para a produção de enzimas de alto valor, compostos bioativos e metabólitos secundários. Essa técnica envolve o crescimento de microrganismos em substratos sólidos com o mínimo de água livre, simulando seu ambiente natural e permitindo uma atividade metabólica eficiente¹. O principal objetivo deste protocolo é otimizar a produção de enzimas por meio de um sistema SSF rotativo que garante maior utilização do substrato, difusão de oxigênio e escalabilidade do processo. O emprego do farelo de trigo, um subproduto agroindustrial abundante, como substrato base, contribui para a valorização dos resíduos agrícolas e promove práticas de bioeconomia circular².

O SSF tem vantagens significativas sobre a fermentação submersa (SmF), incluindo menor consumo de energia e água, maior concentração de produto e compatibilidade com uma ampla gama de resíduos agrícolas baratos, como farelo de trigo, casca de arroz e bagaço de cana-de-açúcar³. Ao contrário do SmF, que requer grandes volumes de água e meios nutritivos caros, os sistemas SSF utilizam matrizes sólidas que não apenas servem como superfícies de crescimento microbiano, mas também fornecem nutrientes essenciais para a atividade microbiana. Além disso, a água livre limitada em SSF minimiza os riscos de contaminação, tornando-a uma opção mais robusta para a produção de enzimas em ambientes industriais⁴. Além de suas vantagens operacionais, a FES apresenta benefícios ambientais e econômicos significativos em comparação com a fermentação submersa (SmF). Estudos relataram que o SSF reduz o consumo de água em 50% -70% e reduz os custos de energia em mais de 30% devido à ausência de grandes volumes de água que requerem agitação e aeração constantes. Além disso, o uso de resíduos agroindustriais como substratos minimiza os custos das matérias-primas e promove práticas de economia circular ao reaproveitar subprodutos agrícolas ^2,4.

O SSF foi amplamente validado por sua eficiência e escalabilidade. Por exemplo, estudos relataram um aumento de 4 a 6 vezes na atividade enzimática usando SSF em comparação com SmF, destacando as vantagens econômicas e ambientais dessa técnica ^2,5. Além disso, o processo a jusante é simplificado, pois a extração de enzimas normalmente requer menos água e menos etapas de purificação. Isso torna a pesca de pequeno e pequeno nível particularmente atraente para as indústrias que visam reduzir os custos operacionais e o impacto ambiental⁶.

O sistema SSF rotativo descrito neste protocolo oferece várias melhorias em relação aos métodos tradicionais de SSF estático. Embora os sistemas estáticos frequentemente enfrentem desafios como colonização irregular do substrato e limitação de oxigênio, a configuração rotativa garante mistura e aeração completas, promovendo o crescimento microbiano uniforme ^7,8,9. Por exemplo, este sistema tem sido empregado com sucesso para produzir enzimas hidrolíticas, como quitinases, amilases e proteases, usando espécies de fungos como Aspergillus e Trichoderma².

Uma característica fundamental deste sistema SSF é sua adaptabilidade. O uso do farelo de trigo como substrato base demonstra o potencial dos resíduos agroindustriais para bioconversão econômica³. Além disso, a suplementação do substrato com indutores como quitina, quitosana e amido aumenta ainda mais a síntese enzimática, estimulando vias metabólicas específicas ^2,10. O sistema também é compatível com diferentes formas de fungos, incluindo esporos, micélio e pellets, permitindo que os usuários adaptem o processo às suas necessidades específicas².

A pesca de pequena escala oferece um amplo potencial de aplicação em vários domínios, como a biotecnologia alimentar, a produção de biocombustíveis e a remediação ambiental¹¹. Sua integração de substratos econômicos, rendimentos excepcionais de enzimas e alta flexibilidade de processo estabelecem o SSF como uma abordagem essencial para inovações biotecnológicas em escala industrial.

Protocol

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do substrato

NOTA: Use uma marca comercial de farelo de trigo para minimizar variações significativas nas características do substrato. Cada lote de farelo de trigo varia devido a vários fatores, tornando-o um material heterogêneo e difícil de padronizar, levando a flutuações em seu conteúdo constituinte. Se for necessário um material padronizado, escolha uma matriz alternativa ou faça uma análise química centesimal de cada lote de farelo de trigo para ajustá-lo de acordo com as necessidades.

1. Lave o farelo de trigo três vezes com água destilada estéril para remover resíduos de matéria orgânica, detritos e poeira. Isso também remove açúcares simples que podem interferir na fermentação.
2. Espalhe o farelo lavado em uma bandeja de alumínio e seque-o em um forno a 60 °C por 24 h.
3. Depois de seco, coloque o farelo de trigo em um tubo cônico estéril de 50 mL.

2. Preparação do inóculo

NOTA: Este protocolo descreve três métodos para preparação de inóculo: suspensão de esporos, inoculação direta com discos de micélio e suspensão celular. Estabeleça a concentração inicial de inóculo e quantifique os níveis de proteína para cálculos precisos de rendimento.

1. Preparação da suspensão de esporos
   1. Transferir um disco de ágar-ágar de 5 mm de diâmetro, saturado com micélio, para uma placa de ágar-ágar dextrose de batata fresca. Incubar a placa a 28 °C durante 5-7 dias ou até que o micélio sature o meio. Alguns fungos podem exigir um tempo de incubação mais longo.
   2. Adicione 5 mL de água destilada estéril à placa e retire mecanicamente os esporos usando uma alça estéril.
   3. Prepare uma diluição de 1:100 da suspensão de esporos. Coloque 10 μL no centro de uma câmara de Neubauer e conte os esporos ao microscópio. Calcule a concentração de esporos (esporos/mL) com base no fator e na diluição da câmara.
2. Cultivo de micélio em meio líquido
   1. Transferir um disco de ágar-ágar 5 mm saturado com micélio para uma placa de batata-dextrose-ágar fresca e incubar a 28 °C até à saturação.
   2. Prepare 25 mL de caldo de batata-dextrose em um frasco estéril de 125 mL e autoclave.
   3. Transferir um disco de micélio de 5 mm da placa saturada para o caldo estéril.
   4. Incubar o balão num shaker a 125 rpm durante 24-48 h, dependendo da estirpe do fungo. Estenda o tempo de incubação para fungos de crescimento lento.
   5. Colete 2 mL para o inóculo e 2 mL para determinação do peso seco.
3. Inoculação direta de discos de micélio
   1. Colocar um disco de ágar-ágar de 5 mm saturado com micélio numa placa de batata-dextrose-ágar fresca. Incubar a 28 °C até à saturação.
   2. Use um disco de micélio como inóculo e outro para determinar o peso seco.

3. Preparação do sistema de pesca de pequena escala

NOTA: Os indutores podem ser naturais ou comerciais. Os indutores comerciais purificados são preferidos para minimizar as impurezas que podem alterar a eficiência da fermentação. Ajuste as adições de água para manter uma umidade relativa de pelo menos 90%.

1. Combine os seguintes componentes em um tubo cônico estéril de 50 mL: 5 g de farelo de trigo seco; 0,2 g do indutor (por exemplo, quitina comercial); 5,5 mL de água (ajuste com base na capacidade de absorção de água do indutor); 5 ml de uma solução salina estéril contendo 16 g/L de fosfato de potássio monobásico, 4 g/L de sulfato de sódio, 2 g/L de cloreto de potássio, 1 g/L de cloreto de cálcio, 400 mg/L de cloreto de zinco, 60 mg/L de ácido bórico, 40 mg/L de molibdato de sódio, 150 mg/L de cloreto de magnésio, 100 mg/L de cloreto férrico e 400 mg/L de sulfato de cobre.
2. Meça a umidade relativa usando um higrômetro baseado em eletrodo, garantindo um mínimo de 90% de umidade. Insira a sonda do eletrodo diretamente no reator em profundidades variadas para obter uma medição representativa da distribuição de umidade.
   1. Siga as etapas para ajustar a umidade se estiver abaixo de 90%:
      1. Adicione gradualmente água destilada estéril em incrementos de 1 mL por 10 g de substrato. Após cada adição, misture bem para garantir uma distribuição uniforme da umidade.
      2. Deixe o substrato se equilibrar por 10-15 min. Meça novamente o nível de umidade.
      3. Repita as etapas acima até que a umidade desejada de 90% seja atingida. Evite molhar demais o substrato durante todo o processo.
   2. Siga as etapas para ajustar a umidade se estiver acima de 90%:
      1. Espalhe o substrato em uma camada fina em um ambiente estéril. Remova o excesso de umidade (1) expondo o substrato ao fluxo de ar laminar ou (2) colocando-o em uma câmara de secagem a 30 ° C por 10-15 min.
      2. Como alternativa, misture suavemente o substrato para promover uma redistribuição uniforme da umidade. Após o tratamento, reavalie o nível de umidade.
      3. Repita a etapa de secagem ou mistura conforme necessário até que a umidade atinja 90%. Prossiga com a fermentação somente quando a umidade desejada for atingida.
3. Autoclave o tubo a 15 psi por 15 min.
4. Após o resfriamento, inocule o substrato com um dos seguintes: 1 mL de suspensão de esporos (1 x 10^6-1 x 10⁷ esporos / mL), 2 mL de suspensão celular ou um disco de micélio de 5 mm.

4. Procedimento de fermentação no estado sólido (SSF)

NOTA: Para estudos cinéticos ou avaliações de parâmetros em momentos diferentes, prepare tubos separados para cada ponto de tempo para garantir a representatividade.

1. Evite a aglomeração do substrato vortando os tubos na velocidade máxima por 5 min em ciclos de 1 min.
2. Coloque os tubos em um misturador rotativo com eixo horizontal. Certifique-se de que o substrato se move livremente dentro dos tubos. Defina o mixer para operar a 10 rpm.
3. Incube o misturador em uma incubadora na temperatura ideal de crescimento do microrganismo. Mantenha a temperatura indicada para uma atividade enzimática ideal ao usar indutores sensíveis ao calor.

5. Extração de enzimas

NOTA: Os fundamentos da extração são baseados na solubilidade e na atividade de pH máximo da enzima extracelular. Como a FES evita o meio aquoso, a enzima extracelular está envolvida na água ao redor da matriz sólida, o que significa que a concentração é maior do que na SmF. Nesse contexto, a seleção do melhor tampão de extração depende do conhecimento da atividade desejada. A otimização das extrações depende da concentração final da enzima e do tipo de tampão de extração utilizado.

1. Após o período de fermentação desejado, ressuspender o substrato em 20 mL de tampão pré-resfriado. Os exemplos incluem: tampão acetato 0,1 M, pH 5,6, para extração de quitinase; Tampão fosfato 0,02 M, pH 6,9, para extração de amilase.
2. Vortex os tubos em ciclos: 1 min na velocidade máxima, seguido de 1 min no gelo. Repita 10 vezes.
3. Filtrar a suspensão com filtros de papel e extrair mecanicamente o sobrenadante por prensagem.
4. Clarificar o sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Utilizar o extracto bruto directamente ou purificar ainda mais a enzima através de cromatografia em coluna ou filtros centrífugos. Estudos cinéticos também são recomendados para determinar a constante de Michaelis (Km) e a taxa máxima de transformação enzimática (Vmax)¹².

6. Processo de otimização

NOTA: Otimize este protocolo avaliando e ajustando a qualidade e a concentração dos indutores, bem como o tipo e a concentração do inóculo.

1. Determine o tempo ideal de fermentação e refine as etapas de extração para melhorar a eficiência.
2. Controle e ajuste as condições ambientais, incluindo temperatura, pH e aeração.
3. Teste vários tampões e condições de extração para aumentar o rendimento e a estabilidade da enzima.
4. Realize análises estatísticas, como metodologia de superfície de resposta, para identificar as variáveis mais influentes e alcançar a produção ideal de enzimas.

Results

A Figura 1A apresenta a representação esquemática do misturador rotativo utilizado neste sistema, que tem capacidade para seis tubos cônicos de 50 mL. A Figura 2B ilustra as mudanças que ocorrem no farelo de trigo durante o condicionamento antes de entrar no processo de fermentação em estado sólido. Como visto, não foram observadas alterações estruturais significativas.

A Figura 2 mostra a saturação do fa...

Discussion

Este estudo descreve um protocolo relevante para otimizar a produção de enzimas por meio de sistemas de fermentação em estado sólido (SSF), projetados especificamente para fungos filamentosos. Abaixo, são discutidos aspectos críticos da metodologia, juntamente com seu significado, limitações e possíveis aplicações.

O sucesso do protocolo é altamente dependente de etapas importantes, como a preparação do substrato e do inóculo. A lavagem e secagem adequadas do ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balão Erlenmeyer de 125 ml	Sigma-Aldrich	CLS431684	Para cultura de micélio em meio líquido.
Tubo cônico de 50 mL	Sigma-Aldrich	CLS430921	Para armazenar e preparar substratos e inóculo.
Tampão de acetato, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Para extração de quitinase.
Filtros Centricon	Millipore	UFC905024	Para posterior purificação de enzimas.
Câmara de células de contagem	Sigma-Aldrich	Z359629	Usado para contar esporos ao microscópio.
Papel de filtro	O que homem	1001-110	Para filtrar o extrato enzimático.
Higrômetro	Todomicro	-	Para medir a umidade relativa do substrato.
Indutor (por exemplo, quitina comercial)	Sigma-Aldrich	C9752	Usado para aumentar a produção de enzimas durante a fermentação.
Tampão fosfato, pH 6,9	Sigma-Aldrich	Pág. 5379	Para extração de amilase.
Ágar batata-dextrose	Sigma-Aldrich	Pág. 2182	Meio de cultura para o cultivo de micélio fúngico.
Caldo de batata-dextrose	Sigma-Aldrich	Pág. 6685	Meio de cultura líquido para o cultivo de micélio fúngico.
Misturador rotativo	Thermo-Fisher Científico	88-861-051	Para manter o substrato em movimento durante a fermentação.
Componentes da solução salina (por exemplo, KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Múltiplo	Para preparar solução salina estéril, consulte a receita detalhada no protocolo.
Farelo de trigo	Mercado comercial	-	Substrato para fermentação em estado sólido.