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Artigo de método

Avaliação do impacto do cádmio no estado redox e perfil metabólico do ouriço-do-mar Paracentrotus lividus

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DOI:

10.3791/68300

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29 de julho de 2025

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1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

Neste artigo

Resumo

Este protocolo destaca os métodos de extração e caracterização de compostos bioativos do ouriço-do-mar Paracentrotus lividus (Equinoderme), bem como a determinação de parâmetros de estresse oxidativo após a exposição ao cádmio.

Resumo

O cádmio (Cd) é um dos metais pesados mais nocivos aos organismos aquáticos e um poluente generalizado na biota marinha. Devido à sua alta biodisponibilidade, persistência e capacidade de bioacumulação, o cádmio (Cd), um metal pesado tóxico descarregado pelo escoamento de mineração, descarga industrial e insumos agrícolas, é um dos poluentes mais prejudiciais aos organismos aquáticos e um poluente comum na biota marinha. O presente estudo avaliou os efeitos potencialmente tóxicos do cádmio em biomarcadores de estresse oxidativo e perfis de metabólitos em gônadas de Paracentrotuslividus expostas a uma variedade de concentrações (0,0183, 0,183 e 1,83 mg / L) durante 96 h. Os resultados mostraram que o Cd induziu o estresse oxidativo aumentando os níveis de malondialdeído, peróxido de hidrogênio e hidroperóxido lipídico em comparação com o grupo controle, além de aumentar as atividades antioxidantes (glutationa e catalase reduzidas). Além disso, com base na análise de cromatografia gasosa e espectrometria de massa, 74 metabólitos foram identificados nos extratos gonadais de ouriços-do-mar tratados e do controle. A Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais revelou uma clara separação de classes e discriminou nove metabólitos relevantes por meio dos escores VIP. A análise do mapa de calor realizada destacou distúrbios nos níveis de esteróis e compostos de ácidos graxos, como Cholest-5-en-3-ol(3.beta.)-, Desmosterol e (23S)-etilcolest-5-en-3.beta.-ol e ácido eicosapentaenóico (EPA), bem como as defesas antioxidantes, como o ácido retinóico, e regulação de esteróides, como Pregna-5-en-20-ona, 3-hidroxi-,(3β). No geral, nossos dados revelaram a alta sensibilidade das gônadas ao Cd, mesmo em concentrações relativamente baixas.

Introdução

O ambiente marinho também pode ser considerado um importante sumidouro de vários produtos químicos tóxicos, como metais pesados. Devido à sua lipofilicidade, esses elementos tendem a se ligar ao material particulado em suspensão e se acumular progressivamente em sedimentos marinhos, onde apresentam diminuição da mobilidade e biodisponibilidade. Como resultado, os sedimentos marinhos servem como um importante sumidouro de metais pesados1. Entre esses contaminantes, o cádmio (Cd) é reconhecido há muito tempo como um importante poluente global da água que ameaça os ecossistemas e sua biota2 relacionada. Um terço do Cd presente nos ecossistemas aquáticos provém da fabricação e uso de fertilizantes fosfatados2. Outras fontes de liberação de Cd no meio ambiente incluem o setor de mineração, empresas de galvanoplastia e processos naturais da crosta terrestre3. Este poluente é altamente difundido devido à sua capacidade de ser facilmente transportado através de meios aquosos e à sua mobilidade comparativamente grande em contraste com outros metais pesados2. De acordo com a literatura, as concentrações de Cd variam entre 12 e 16 x 10−3 μg/Lno Mar Báltico4, e entre 13,4 x 10−3 e 1,49 μg/L num local muito contaminado ao longo da costa galega (NW da Península Ibérica)5. Níveis muito mais elevados de Cd foram registrados em algumas áreas poluídas no Mar Mediterrâneo, onde as concentrações podem chegar a 80,4 x 10-3 μg/L perto da Ilha da Sicília (Itália)6 e 48 μg/L no Golfo de Gabès (Tunísia)7. Este metal de transição persistente, bioacumulativo e não essencial é reconhecido por sua capacidade de causar sérios problemas de saúde para organismos humanos e aquáticos8. O Cd pode exercer diretamente sua toxicidade ligando-se a proteínas, inibindo as atividades enzimáticas e interferindo na homeostase do cálcio9. Também pode atuar indiretamente por meio da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), levando a danos oxidativos a biomoléculas como lipídios, proteínas e DNA10. Vários estudos científicos relataram que a contaminação por Cd pode desencadear distúrbios estruturais e funcionais em organismos aquáticos11.

Tal como acontece com os outros invertebrados bentônicos marinhos, os ouriços-do-mar estão particularmente expostos à poluição marinha. Apesar de sua capacidade de acumular altos níveis de metais pesados, os ouriços-do-mar podem lidar com a contaminação por metais e resistir em ambientes poluídos12. Assim, são comumente reconhecidos como organismos sentinelas e são amplamente utilizados como modelos para estudos ecotoxicológicos e ambientais13. Numerosos estudos investigaram o impacto da exposição ao Cd em várias espécies de ouriços-do-mar em diferentes estágios da vida, incluindo organismos adultos, embriões e larvas13. Verificou-se que a exposição ao Cd pode resultar em uma variedade de efeitos adversos que vão desde a redução da taxa de fertilização do ovo, anormalidades no desenvolvimento embrionário e larval, estresse oxidativo, apoptose e autofagia13. A maior parte da literatura disponível se concentra no efeito do Cd em embriões em desenvolvimento de ouriços-do-mar13,14; No entanto, apenas alguns estudos15foram realizados para entender os efeitos desse metal no perfil metabólico de ouriços-do-mar adultos, e não há informações disponíveis sobre o metabolismo lipídico.

A exposição contínua de embriões de Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) a concentrações subagudas / subletais de cádmio causa desenvolvimento anormal com defeitos no alongamento e padronização do esqueleto, juntamente com uma redução geral da síntese de proteínas e expressão diferencial de metalotioneína16.

O método proposto melhora a avaliação da toxicidade do cádmio (Cd) e do estresse oxidativo em organismos marinhos, combinando ensaios bioquímicos com perfis metabolômicos direcionados e não direcionados usando cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). Em comparação com as abordagens tradicionais que dependem apenas de biomarcadores únicos, como peroxidação lipídica ou atividades enzimáticas antioxidantes (por exemplo, SOD, CAT), a adição de triagem de metabólitos baseada em GC-MS fornece uma impressão digital bioquímica abrangente do estado fisiológico do organismo17. Essa integração permite uma detecção mais sensível e sistêmica de efeitos subletais, mesmo em baixas concentrações de Cd, e pode detectar perturbações precoces no metabolismo energético, renovação de aminoácidos e vias oxidativas que ocorrem antes de danos toxicológicos observáveis. É importante ressaltar que este método complementa as avaliações toxicológicas existentes, fornecendo dados de maior resolução e permitindo a identificação de novos biomarcadores que os ensaios tradicionais podem perder18. Também promove a compreensão mecanicista por meio da análise em nível de via, o que aprimora os modelos preditivos de ecotoxicologia19. Este método detecta a exposição ao cádmio na faixa de 1-100 μg/L, o que é relevante para sistemas costeiros e estuarinos poluídos20. A abordagem é mais apropriada para exposições laboratoriais controladas ou estudos de campo moderadamente complexos. No entanto, a interpretação pode ser difícil em matrizes altamente contaminadas, onde vários estressores (por exemplo, metais pesados, PAHs, contaminantes emergentes) interagem e potencialmente confundem a especificidade do biomarcador. Apesar disso, quando adequadamente projetado, a robustez e especificidade do GC-MS, combinadas com a análise multivariada de dados (por exemplo, PCA, PLS-DA), fornecem forte poder discriminatório para resolver efeitos sobrepostos.

Esta plataforma bioquímico-metabolómica integrada é particularmente útil para a monitorização das espécies-sentinela e as avaliações dos riscos ecológicos no âmbito de quadros como a Diretiva-Quadro Estratégia Marinha (DQEM) e é coerente com os esforços atuais para promover a monitorização ambiental baseada na economia21.

No presente estudo, utilizamos o ouriço-do-mar roxo P. lividus, que é uma das espécies mais exploradas e economicamente significativas em toda a costa atlântica e mediterrânea22, para avaliar o efeito da contaminação por Cd no status redox e no perfil metabolômico das gônadas.

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Protocolo

1. Amostras e desenho experimental

  1. Coletar um total de 40 espécimes adultos de ouriços-do-mar P. lividus (20 machos e 20 fêmeas, comprimento médio: 45 ± 4 mm, idade média: 2,0 ± 0,5 anos, peso médio: 22,54 ± 2,50 g) por mergulhadores na faixa de profundidade de 5-7 m em maio de 2023 nas costas de Bizerte (Mar Mediterrâneo, Tunísia).
  2. Transfira os ouriços-do-mar coletados P. lividus de sexo misto, idade estimada de aproximadamente 12-18 meses com base no tamanho para o laboratório e mantenha em água do mar natural aerada 16 ± 1 ° C com salinidade natural de ~ 38 PSU, pH de 7,8-8,0 e fotoperíodo de 12:12. Monitore os parâmetros diariamente durante todo o período de exposição para garantir a estabilidade ambiental e minimizar a variação externa.
  3. Injete 1 mL de KCl 0,5 M na região peristomial para induzir a desova e identificar visualmente os gametas. Enxágue os indivíduos com água do mar filtrada e aclimate-os por 3 dias em condições controladas, sem fornecimento de alimentos.
  4. Divida aleatoriamente os ouriços-do-mar em quatro grupos de nove indivíduos (três indivíduos por tanque em triplicata) e aloque-os em aquários de vidro de 50 L. Determinar o tamanho da amostra com base em estudos publicados anteriormente23,24 que avaliaram biomarcadores de estresse oxidativo e respostas metabolômicas em invertebrados marinhos e usam réplicas biológicas comparáveis ou em menor número.
    NOTA: Este nível de replicação garante forte representação biológica e resultados estatisticamente significativos.
  5. Expor os animais, após aclimatação, durante 96 h a uma gama de concentrações de cloreto de cádmio (CdCl2) da seguinte forma: Grupo I (Ctrl): ouriços-do-mar mantidos em água não CdCl2; Grupo II (Tr1): ouriços-do-mar expostos a uma concentração de CdCl2de 0,0183 mg/L; Grupo III (Tr2): ouriços-do-mar expostos a uma concentração de CdCl2de 0,183 mg/L; Grupo IV (Tr3): ouriços-do-mar expostos a uma concentração de CdCl2de 1,83 mg/L.
  6. Para manter a estabilidade da água durante o experimento, troque 50% da água a cada 24 h, remova a água cuidadosamente usando um sifão e substitua-a por água recém-preparada, mantendo as concentrações de CdCl2.

2. Preparação de tecidos

  1. Realizar, utilizando o protocolo descrito por Telahigue et al.23, a preparação dos homogeneizados de tecido de ouriço-do-mar.
  2. Dissecar em ouriços-do-mar de gelo de cada grupo no final do experimento. Use uma tesoura estéril para fazer um corte circular ao redor da boca para abrir o teste.
  3. Retirar cuidadosamente as cinco gônadas com uma espátula e guardar para análise posterior. Lave com água destilada fria para remover detritos e contaminantes da superfície
  4. Homogeneizar usando um sonicador de sonda ajustado para 40% de amplitude, em 3 rajadas de 10 s cada com 20 s de descanso entre as rajadas, 300 mg de frações gonais com tampão Tris-HCl (20 mM, pH 7,4) em condições frias.
  5. Divida cada amostra de gônada em duas porções: uma para análise bioquímica (fresca) e outra para análise metabolômica (liofilizada).
  6. Centrifugue a 10.000 x g por 20 min. Armazenar os sobrenadantes a - 80 °C para análise dos parâmetros bioquímicos.
  7. Liofilizar outras frações gonais usando um liofilizador antes da análise GC-MS. Manter durante 48 h a -50 °C com um vácuo inferior a 0,1 mbar até que a secagem total esteja concluída.
  8. Utilize o método de Lowry para determinar o teor total de proteína de cada amostra usando BSA como padrão. Determinar o nível de LOOH a 560 nm e expressar em mmol/mg de proteína.
    NOTA: Esta quantificação foi realizada antes de todos os ensaios bioquímicos para normalizar os níveis de biomarcadores.

3. Ensaio de glutationa reduzida

  1. Estimar o teor reduzido de glutationa (GSH) de acordo com o método de Ellman25, com base na absorbância do ácido 2-nitro-5-mercaptúrico resultante da redução do ácido 5-50-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB) pelo grupo tiol (SH) da glutationa.
  2. Centrifugue a 1600 x g por 15 min uma mistura de homogeneizados de tecido em tampão fosfato e ácido sulfossalicílico (4%).
  3. Pegue um volume de 500 μL do sobrenadante obtido e adicione-o ao reagente de Ellman (DNTB) com 0,025 mL. Ler a 412 nm a absorvância da mistura resultante.
  4. Avalia o teor de GSH em mg por g de tecido. Exprimir o teor total de GSH em μg/mg de tecido. Calcule os níveis de GSH usando uma curva de calibração padrão baseada em concentrações conhecidas de glutationa reduzida.
    NOTA: O objetivo é quantificar a glutationa reduzida (GSH) em homogeneizados gonadais como um marcador de estresse oxidativo após a exposição ao cádmio.

4. Atividade da catalase

  1. Realize a configuração da reação de acordo com o método de Aebi26. Preparar o meio de reacção constituído por 2,9 ml de tampão fosfato 100 mM (pH 7,4) e 20 μL de sobrenadante de tecido gonadal. Pré-equilibre o meio de reação à temperatura ambiente.
  2. Inicie a reação adicionando 80 μL de solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) 0,5 M recém-preparada à cubeta. Homogeneizar imediatamente o conteúdo e registar a diminuição da absorvância a 240 nm durante 1 mi a intervalos de 10 s utilizando um espectrofotómetro UV-Vis.
  3. Calcular a actividade das CAT com base na taxa de decomposição de H2O2, determinada pela monitorização da diminuição da absorvância a 240 nm ao longo do tempo. Use a seguinte fórmula: Atividade CAT = (ΔA/min x V) / (ε x l x C)
    onde: ΔA/min = mudança na absorbância por minuto a 240 nm, V = volume total do ensaio (em L), ε = coeficiente de extinção molar de H2O2 (43,6 M-1/cm), l = comprimento do caminho da cubeta (geralmente 1 cm), C = concentração de proteína em mg/mL.
  4. Use o coeficiente de extinção molar de 43,6 M/cm. Expresse a atividade CAT como nmol H2O2 decomposto por minuto por mg de proteína (nmol H2O2 / min / mg de proteína).
    NOTA: O objetivo é quantificar a atividade da catalase em homogeneizados gonadais de P. lividus como uma medida da resposta enzimática antioxidante à exposição ao cádmio.

5. Medição da geração de peróxido de hidrogênio

  1. Medir os níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2) nas gônadas de P. lividus usando o ensaio de oxidação ferrosa-laranja de xilenol de acordo com o método descrito por Ou e Wolff27.
  2. Determinar a concentração de H2O2no sobrenadante utilizando um espectrofotómetro a 560 nm. Expresse os resultados em nmol/mg de proteína.

6. Ensaio de malondialdeído

  1. Preparar as amostras conforme descrito no método de Draper e Hadley28. Misture 500 μL de homogenato de gônadas com 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 10%. Centrifugue a 2500 x g durante 10 min a 4 °C.
  2. Transfira 1 mL do sobrenadante resultante para um novo tubo e adicione 1 mL de solução a 0,67% de TBA. Incubar a mistura em banho-maria a 100 °C durante 15 min.
  3. Resfrie as amostras à temperatura ambiente. Medir a absorvância a 532 nm com um espectrofotómetro.
  4. Subtrair a absorvância de fundo utilizando um reagente em branco (TBA + TCA sem extracto tecidual). Preparar uma curva padrão utilizando 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) e expressar a concentração de MDA sob a forma de nmol/mg de proteína.

7. Medição de hidroperóxido lipídico

  1. Medir o hidroperóxido lipídico (LOOH) nos tecidos gonais usando o ensaio de oxidação ferrosa em laranja de xilenol, conforme descrito pelo método de Jiang et al.29.
    NOTA: O objetivo é avaliar os níveis de peroxidação lipídica nos tecidos gonadais por meio da quantificação do malondialdeído (MDA), um subproduto do dano oxidativo da membrana.

8. Extração de compostos bioativos de gônadas e triagem analítica

  1. Realizar a extração metanólica de compostos lipofílicos em triplicado do tecido gonadal seco de cada grupo em triplicado, embebendo o material em metanol de qualidade analítica (≥99,8%; 1:25 p/v) em um agitador rotativo a 150 rotações/min à temperatura ambiente.
  2. Centrifugar todos os extractos durante 15 min a 700 x g, 4 °C, após evaporação das fracções de MeOH por evaporação rotativa a uma temperatura de banho-maria de 40 °C e uma velocidade de rotação regulada para 100 rpm. Ressuspenda o extrato bruto em 1 mL de MeOH e armazene em frascos fechados a 4 ° C.

9. Análise por cromatografia gasosa-espectrometria de massa de extratos gonadais

  1. Fazer uma alíquota de 500 μL num frasco para injetáveis utilizando o extracto metanólico armazenado.
  2. Realizar análise por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS) em um cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas. A coluna de GC foi de 5 %-Fenil-metilsiloxano: 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espessura de filme.
  3. Use hélio como gás de arraste a uma taxa de fluxo constante de 1 mL / min. Defina o volume de injeção para 1 μL no modo split na proporção de 100:1. Programe a temperatura do forno de 4-280 °C a 5 °C/min.
  4. Opere o espectrômetro no modo de impacto de elétrons (EI), a energia de ionização foi de 72 eV, a temperatura da fonte de íons foi de 250 °C, o tempo de varredura de 1 s e a faixa de massa de 45-550 amu.
  5. Realize a identificação de compostos por comparação de seus espectros de massa com os da NIST98MS Library e Willy Library275 Database.

10. Análise estatística

  1. Avalie o conjunto de dados primeiro quanto à normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk e quanto à homogeneidade das variâncias usando o teste de Levene.
  2. Pré-processe os dados com o MetaboAnalyst 6.030, usando procedimentos de normalização padrão, transformação de log e escala de Pareto para atender às suposições ANOVA, como distribuição normal e homogeneidade de variância.
  3. Realize uma análise estatística multivariada usando o Metaboanalyst, use o método de taxa de descoberta falsa (FDR) de Benjamini-Hochberg para correção de vários testes para contabilizar erros do Tipo I relacionados a inúmeras comparações bioquímicas e garantir a robustez estatística.
  4. Use a análise de variância unidirecional (ANOVA) para comparar os resultados entre os grupos. As diferenças entre as médias foram consideradas significativas quando p <0,05.
  5. Use a Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) para discriminar entre grupos comparáveis. Determine a importância da variável na projeção (VIP) para todos os compostos.
  6. Calcule os valores de p usando o teste t de Student pareado para análise estatística unidimensional de variáveis padronizadas.

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Resultados

A validade e eficácia de nossos métodos foram garantidas pelo uso de réplicas biológicas e técnicas, o que permitiu medições consistentes e confiáveis. Os ensaios demonstraram baixa variabilidade, com desvios padrão tipicamente inferiores a 10%, indicando alta repetibilidade. Para garantir a quantificação precisa dos metabólitos, as análises de GC-MS incluíram curvas de calibração e padrões internos. Todas as técnicas utilizadas são baseadas em protocolos amplamente aceitos que foram prev...

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Discussão

Este estudo foi planejado para avaliar o efeito tóxico do Cd sobre as gônadas do ouriço-do-mar P. lividus por meio da análise de biomarcadores bioquímicos e metabólitos ativos. A exposição de P. lividus a diferentes concentrações de Cd produziu uma resposta ao estresse oxidativo. Esses achados são semelhantes a relatórios anteriores, indicando correlações estreitas entre o aumento dos níveis de antioxidantes nos campos de ouriço-do-mar e os níveis de contaminantes

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Reitor de Pós-Graduação e Pesquisa Científica da Universidade de Bisha por apoiar este trabalho por meio do Programa de Apoio à Pesquisa Fast-Track.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LiofilizadorBiobaseBK-FD12PTliofilização
Cromatógrafo gasoso Cromatógrafogasoso HP 6890 ColunaDetector de Ionização de Chama (FID)
GC ColunaAgilent TechnologiesHP-5 (5%-Fenil)-metilsiloxanoApolar  coluna  que oferece excelente desempenho em uma ampla gama de aplicações
Espectrômetro de massaAgilent TechnologiesHP 5973 espectrômetro de massaQuadrupole MS

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