Algoritmos de chamada de pico (WonderPeaks e PeakStream) como ferramentas para melhorar ChIP-seq e análise transcriptômica em patógenos fúngicos

Resumo

Este relatório apresenta o WonderPeaks, uma nova ferramenta computacional para analisar dados de RNA-seq e ChIP-seq. Esta ferramenta identifica com sucesso picos (leia-se pileups) em dados de sequenciamento, permitindo a caracterização de limites de regiões não traduzidas em RNA-seq e detectando enriquecimento de cromatina em ChIP-seq, fornecendo informações valiosas para a pesquisa de patógenos fúngicos.

Resumo

A caracterização de mudanças na expressão gênica por meio da transcriptômica e da atividade reguladora da transcrição tornou-se uma abordagem fundamental para a compreensão das diversas respostas envolvidas na patogênese fúngica. Este artigo apresenta duas ferramentas computacionais projetadas para enfrentar os principais desafios no estudo da regulação transcricional em patógenos fúngicos, particularmente não modelo com anotação genômica limitada. Primeiro, apresentamos o WonderPeaks, um novo algoritmo de chamada de pico que aproveita a primeira derivada de dados genômicos mapeados de experimentos de sequenciamento de próxima geração (NGS) para identificar picos enriquecidos na imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento (ChIP-seq). Em segundo lugar, apresentamos o PeakStream, uma extensão do WonderPeaks para anotar regiões não traduzidas (UTRs) de 3' em dados transcriptômicos gerados usando a preparação de biblioteca poli (A). Juntas, essas ferramentas fornecem um pipeline de análise de dados de ponta a ponta, oferecendo uma solução amigável para pesquisadores que estudam a regulação da transcrição em fungos. Demonstramos sua eficácia com dados do patógeno fúngico Candida albicans, identificando com sucesso picos verificados nos dados de ChIP-seq e anotando UTRs validados por meio da comparação com dados de sequenciamento de RNA total nas mesmas condições. Também discutimos as limitações do WonderPeaks para dados ChIP-seq em comparação com os métodos atuais de última geração e propomos direções para melhorias futuras. Em última análise, este trabalho fornece orientação prática e recursos poderosos para estudar a regulação transcricional, com relevância imediata para fungos patogênicos e aplicações potenciais em estudos genômicos mais amplos.

Introdução

Os patógenos fúngicos são uma preocupação emergente de saúde global, com infecções aumentando nos últimos anos¹. Muitos desses patógenos exibem alta resistência antifúngica e estão associados a taxas de mortalidade significativas². No entanto, em comparação com os organismos fúngicos modelo, muitos fungos patogênicos permanecem mal caracterizados, destacando a necessidade de mais pesquisas sobre seus mecanismos de patogenicidade. As técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS), como o sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina (ChIP-Seq) e o sequenciamento de RNA (RNA-Seq), desempenham um papel crítico na descoberta dos mecanismos moleculares de expressão gênica subjacentes à patogenicidade fúngica.

A qualidade dos insights derivados dos dados NGS é altamente dependente da precisão do software usado para análise de dados brutos. Entre os principais desafios para a análise de dados NGS está a chamada de pico - identificando com precisão regiões de leituras NGS enriquecidas - que é particularmente complexa devido à ampla variedade de técnicas de preparação e sequenciamento de bibliotecas, tornando uma solução universal impraticável. O algoritmo MACS³, incluindo sua versão mais recente, MACS3, é amplamente considerado o padrão-ouro para analisar conjuntos de dados ChIP-seq. No entanto, o MACS depende de parâmetros definidos pelo usuário - como comprimento mínimo de pico e intervalo máximo - que podem não ser universalmente aplicáveis e muitas vezes são difíceis de determinar antes da análise. Notavelmente, a versão mais recente do MACS3 inclui um recurso de análise de corte que permite aos usuários estimar parâmetros antes do pico de chamadas. Para melhorar o desempenho, os usuários também podem fornecer uma lista de regiões genômicas "na lista negra" conhecidas por introduzir viés devido à estrutura da cromatina ou à variação do número de cópias. Embora o MACS continue sendo a ferramenta de chamada de pico mais comumente usada e confiável para dados ChIP-seq, poucos algoritmos alternativos estão disponíveis, principalmente para casos que exigem configurações de parâmetros altamente personalizadas.

O RNA-Seq é uma técnica inestimável para estudar as respostas de expressão gênica de fungos patogênicos durante o crescimento in vivo, como em cultura de tecidos ou modelos de infecção de camundongos 4,5,6,7. Uma alta profundidade de sequenciamento é necessária para uma análise precisa da expressão diferencial nessas condições, que podem ser proibitivas em termos de custo e recursos ^8,9. Métodos de preparação de bibliotecas, como o sequenciamento de poliadenilação (poli (A))-priming (3'RNA-Seq), que usa primers projetados para recozer as caudas poli (A) do mRNA para geração de cDNA, podem ajudar a reduzir a profundidade de sequenciamento necessária para a análise da expressão gênica¹⁰. No entanto, essa abordagem depende de anotações genômicas de alta qualidade, particularmente de regiões não traduzidas 3 '(UTRs), onde os picos de eventos de poli (A) - priming são normalmente localizados¹¹. As anotações do genoma de muitos patógenos fúngicos pouco estudados carecem de anotações UTR, dificultando o uso de 3'RNA-Seq nesses organismos. Além disso, o comprimento UTR para um único gene pode ser dinâmico em diferentes condições de crescimento e tipos de células^12,13. Embora várias novas ferramentas de análise tenham sido desenvolvidas para identificar e anotar UTRs, muitas delas são projetadas para conjuntos de dados de mamíferos, cuja organização gênica difere muito da dos fungos, ou requerem dados de experimentos de sequenciamento independentes, como sequenciamento de mRNA de célula única ou reverso, que podem aumentar o tempo e os custos para um pesquisador que deseja fazer análise de transcriptoma^{12, 14,15}.

Neste artigo, apresentamos o WonderPeaks, um novo software de chamada de pico, projetado com base nos princípios da primeira derivada, que pode ser usado para chamar picos dinamicamente em conjuntos de dados NGS (Figura 1). O WonderPeaks identifica picos calculando a primeira derivada do sinal de cobertura e usando esse valor - a inclinação do pico - para definir picos potenciais. O algoritmo procura instâncias em que a primeira derivada exibe um máximo local acima de um limite de inclinação fornecido pelo usuário ou inferido por dados (indicando um sinal crescente), seguido por um mínimo local acima do mesmo limite (indicando um sinal decrescente), detectando assim todos os picos candidatos no conjunto de dados. Para aplicações ChIP-seq, o WonderPeaks compara todos os picos candidatos entre amostras de teste e controle para identificar picos enriquecidos exclusivamente. Ao aplicar o WonderPeaks a um conjunto de dados ChIP-seq publicado anteriormente de um fator de transcrição no patógeno fúngico Candida albicans¹⁶, demonstramos sua capacidade de identificar com sucesso picos a montante de genes-chave destacados no estudo original, ao mesmo tempo em que discutimos as limitações atuais do algoritmo nesta aplicação.

Também apresentamos o PeakStream, uma ferramenta de software que aproveita o WonderPeaks para identificar picos em conjuntos de dados 3'RNA-Seq. As bibliotecas 3'RNA-Seq dependem de anotações precisas de 3' UTR, pois as leituras geradas por meio de poly(A)-priming geralmente se estendem além do códon de parada das sequências codificantes (CDS) dos genes e, portanto, não são contadas ao usar anotações padrão focadas apenas em regiões codificantes. O pipeline de análise PeakStream foi projetado para criar novas anotações de genoma usando dados de 3 'RNA-Seq, com foco em regiões a jusante das regiões de sequência de codificação de genes (CDS). O PeakStream atribui esses picos aos genes, gerando uma nova anotação do genoma para uso em programas de contagem de leitura downstream. Mostramos que o uso do PeakStream pode identificar e atribuir com precisão picos gerados por poli (A) a jusante ao gene adequado em um conjunto de dados de C. albicans 3'RNA-Seq. O PeakStream também anota picos improváveis de estarem associados a quaisquer anotações genéticas atuais, facilitando a descoberta de possíveis novos transcritos. Juntos, o PeakStream e o WonderPeaks representam um poderoso conjunto de ferramentas fáceis de usar para detecção de pico em conjuntos de dados de sequenciamento de próxima geração (NGS).

Figura 1: Figura geral de chamadas de pico por WonderPeaks e PeakStream. Esquerda: Chamada de pico usando a primeira derivada. Canto superior direito: Chamada de pico em conjuntos de dados ChIP-Seq usando WonderPeaks. Canto inferior direito: Chamada de pico em conjuntos de dados de RNA-Seq usando PeakStream. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Instalação (pular se concluída)

1. Pré-requisitos
   1. Instale o Anaconda ou Minconda para carregar os requisitos para executar o pré-processamento (seção 5) e o WonderPeaks (seção 6 ou seção 7).
      NOTA: Para obter um guia do usuário do Anaconda, consulte a referência¹⁶.
   2. Instale o Python: Python no Anaconda ou Miniconda.
   3. Instale o Jupyter Notebooks para executar todas as funções nesse método.
      NOTA: Um guia do usuário para iniciantes para Jupyter Notebooks pode ser encontrado na referência¹⁷.
      CUIDADO: Para genomas de fungos (≤100 Mbp), garanta um ambiente de computação com pelo menos 20 núcleos, 8 GB de RAM e 30 GB de espaço em disco disponível.
2. Instale funções de pré-processamento.
   1. No terminal, execute: conda create -n WP_preprocessing
   2. No terminal, execute: conda activate WP_preprocessing
   3. No terminal, execute: conda env update --file environment.yml --name
      NOTA: O environment.yml é um arquivo que contém todas as dependências do pacote e deve ser baixado do https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git.
   4. No terminal, execute: pip install WonderPeaks-preprocessing
   5. No terminal, execute: conda deactivate WP_preprocessing
3. Instale as funções do WonderPeaks:
   1. No terminal, execute: conda create -n WonderPeaks
   2. No terminal, execute: conda ativar WonderPeaks
   3. No terminal, execute: conda env update --file environment.yml --name
      NOTA: O environment.yml é um arquivo que contém todas as dependências do pacote e deve ser baixado do https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git.
   4. No terminal, execute: pip install WonderPeaks
   5. No terminal, execute: conda desative o WonderPeaks
      NOTA: As etapas 1.2 e 1.3 realizam o seguinte: Eles criam um ambiente Conda dedicado para pré-processamento (seção 5) e WonderPeaks (seções 6 e 7), isolando dependências para evitar conflitos com outros softwares. Eles ativam o ambiente, configurando-o para instalar e executar funções específicas do WP_preprocessing ou WonderPeaks. Eles instalam as dependências de software e as ferramentas necessárias para o pré-processamento dos dados. Eles desativam o ambiente quando não estão em uso para evitar modificações acidentais e liberar recursos do sistema.
4. Baixe Jupyter Notebooks e modelos do repositório WonderPeaks GitHub. Carregue os downloads do WonderPeaks para o sistema operacional que contém os dados brutos (o diretório será criado na seção 2).
   NOTA: Os Jupyter Notebooks contêm scripts e modelos pré-escritos necessários para executar fluxos de trabalho de pré-processamento, WonderPeaks e PeakStream. Carregá-los no mesmo sistema que os dados brutos garante que os caminhos e diretórios se alinhem corretamente.

2. Crie um diretório de dados

NOTA: Os fluxos de trabalho WonderPeaks e PeakStream exigem que todos os dados (brutos e processados) sejam armazenados no mesmo diretório. Esta etapa explica como criar esse novo diretório ({data_directory} = /path/to/your/data) e como mover dados brutos experimentais (leituras de sequenciamento não processadas) para uma pasta dentro desse diretório chamada raw_data.

1. Crie um diretório de dados.
   1. No terminal, execute mkdir {data_directory} (por exemplo, mkdir /caminho/para/seus/dados)
2. Crie um subdiretório de dados brutos para leituras de sequenciamento não processadas.
   1. No terminal, execute mkdir {data_directory}/raw_data (por exemplo, mkdir /path/to/your/data /raw_data)
3. Mova as leituras de sequenciamento não processadas para o diretório de dados brutos.
   1. No terminal, execute mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data (por exemplo, mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. Crie o arquivo de entradas do usuário (NGS_user_input.csv)

NOTA: O arquivo de entrada especifica as configurações geradas pelo usuário para executar o pré-processamento e o WonderPeaks.

1. Baixe o NGS_user_inputs.csv do modelo do repositório GitHub do WonderPeaks.
2. Atualize os campos no NGS_user_inputs.csv. Atualize os campos da seguinte maneira:
   Diretório de dados: /caminho/para/seu/dados
   Diretório do genoma: /caminho/para/seu/genoma
   Genoma fasta: genome.fasta
   Anotação do genoma: genome_annotation.gtf (forneça o nome do arquivo da anotação do genoma no formato GTF)
3. Salve NGS_user_inputs.csv atualizados no diretório de dados criado na seção 2.
   CUIDADO: Não altere o nome do arquivo; O WonderPeaks só reconhecerá este arquivo se ele for nomeado NGS_user_input.csv.

4. Crie um arquivo de metadados (NGS_user_metadata.csv)

NOTA: O arquivo de metadados é usado para armazenar qualquer informação relevante para o experimento. Colunas adicionais podem ser adicionadas para descrever as condições do experimento, mas elas não afetarão as etapas subsequentes.

1. Baixe o modelo NGS_user_metadata.csv do repositório WonderPeaks GitHub.
2. Atualizar campos no NGS_user_metadata.csv Os campos são os seguintes:
   1. file: Certifique-se de que o nome do arquivo não tenha espaços, inclua o identificador do arquivo (por exemplo, fastq, fastq.gz) e não inclua o caminho absoluto.
   2. bedgraph: especifique se o arquivo deve ser incluído no PeakStream definindo esse campo como TRUE ou FALSE.
      1. Defina o campo bedgraph como FALSE quando o arquivo puder ser razoavelmente excluído da análise PeakStream. Por exemplo, em um experimento de RNAseq, defina o parâmetro bedgraph bedgraph=FALSE para mutantes ou outros casos em que as diferenças de UTR entre as amostras não são esperadas. No entanto, certifique-se de definir o campo bedgraph como TRUE para todos os arquivos de controle em um experimento de RNAseq e para todos os arquivos em um experimento ChIPseq .
   3. fator de design
      1. designfactor1: Especifique um fator de design relevante para o design experimental (por exemplo, tratamento ou sample_type).
      2. designfactor2: Especifique um segundo fator de experimento relevante para o experimento Para um experimento de RNAseq, inclua tratamento e deformação como fatores típicos de projeto. A coluna de tratamento lista os tratamentos aplicados (por exemplo, controle, medicamento1) e a coluna de cepa lista as informações da cepa (por exemplo, tipo selvagem, mutante). Para um experimento ChIPseq, inclua sample_type e epítopo como fatores de design típicos. A coluna sample_type lista se a proteína foi marcada ou não, e a coluna do epítopo lista o nome do epítopo usado.
         NOTA: fatores de design são atributos específicos do projeto experimental.
         O WonderPeaks é compatível com controles não marcados ou controles de entrada como linha de base.
      3. Certifique-se de que as colunas de fator de experimento não incluam um número de replicação exclusivo (por exemplo, sample_type: [marcado, marcado, untagged_control, untagged_control] não sample_type: [tagged_1, tagged_2, untagged_control _1, untagged_control _2]. Fornecer números de replicação exclusivos resultará em um erro durante a execução.
      4. Certifique-se de usar sublinhados (_) em vez de espaços em nomes de fatores de design.
      5. Para o aplicativo ChIPseq, verifique se a coluna sample_type (ou nome personalizado) no arquivo de metadados inclui termos que contêm palavras tag e controle.
         NOTA: Por exemplo, as entradas válidas podem incluir tags e untagged_control. Fornecer uma coluna sample_type sem esses termos resultará em um erro durante a execução.
         CUIDADO: Para o aplicativo ChIP, o usuário deve especificar dois fatores de design.
      6. Adicione fatores de experimento à linha de NGS_user_inputs.csv relevante. Certifique-se de que os nomes de coluna usados para fatores de experimento estejam listados como uma string separada por ponto-e-vírgula (por exemplo, tratamento; cepa ou sample_type; epítopo).
         CUIDADO: Os fatores de design em NGS_user_inputs.csv devem corresponder exatamente às colunas de NGS_user_metadata.csv . Qualquer execução incompatível resultará em um erro durante a execução (Figura 2, Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2).

Figura 2: Exemplo NGS_user_input.csv e NGS_user_metadata.csv. Exemplos do NGS_user_input.csv (painel superior) e NGS_user_metadata.csv (painel inferior), destacando a correspondência entre as colunas designfactor e designfactor com texto e setas rosa ou azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Pré-processamento de dados NGS

NOTA: Pule para a seção 5 ou seção 6 se estiver usando o pré-processamento personalizado.

1. Abra o Jupyter Notebook de pré-processamento de NGS (NGS_Preprocessing.ipynb).
2. Ative WP_preprocessing ambiente (criado na etapa 1.2) no canto superior direito da interface do notebook.
3. Execute a primeira célula mantendo pressionada a tecla Shift e pressionando Enter (Shift+Enter).
4. Na segunda célula do Jupyter Notebook, atualize o caminho do diretório definindo o diretório = "path/to/your/data", em que path/to/your/data/ é o diretório criado na seção 2.
5. Gere arquivos de alinhamento. As funções de pré-processamento executarão o corte usando o FastP¹⁸; Controle de Qualidade utilizando FastQC¹⁹ e MultiQC²⁰; Alinhamento usando STAR²¹. Os arquivos de alinhamento de saída são salvos em um subdiretório chamado startout dentro do diretório de dados (por exemplo, path/to/your/data/starout); Filtragem (optional) usando o samtools view²², filtre o arquivo de alinhamento para manter apenas as leituras acima de um limite especificado em NGS_user_inputs.csv.
   NOTA: Essas funções processarão apenas leituras únicas (por exemplo, R1) do conjunto de dados por vez. Os usuários podem especificar opções de execução para FastP e STAR no NGS_user_inputs.csv (por exemplo, FastP: adapter_sequence (opcional); STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil).
6. Execute funções de pré-processamento na segunda célula com Shift + Enter.
   NOTA: As tarefas na segunda célula podem levar várias horas para serem concluídas. Se a execução for interrompida, repita as etapas 5.3 a 5.6 para reiniciar a execução. O progresso das etapas anteriores não será substituído e o processo continuará de onde parou.
7. Gere arquivos de rastreamento da cobertura de alinhamento usando BamCoverage²³ (consulte as etapas 5.7.1 e 5.7.2).
   NOTA: Para ChIPseq, o WonderPeaks requer arquivos de gráfico de leito único contendo cobertura para leituras diretas e reversas. Para RNAseq com priming Poly(A), o PeakStream requer dois arquivos bedgraph, um para leituras diretas (_fwd.bedgraph) e outro para leituras reversas (_rev.bedgraph). As leituras diretas e reversas são geradas usando o parâmetro filterRNAstrand dentro do BamCoverage²³.
   1. ChIPseq usando os seguintes parâmetros: outfilfeformat="bedgraph", strand=None, binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      NOTA: Saída: Produz arquivos de gráfico de leito único contendo cobertura para leituras diretas e reversas. A saída é armazenada em /path/to/your/data/bedgraphout (Figura 3).
      1. Execute a função BamCoverage na terceira célula usando Shift + Enter.
   2. RNAseq usando os seguintes parâmetros: outfilfeformat="bedgraph", strand="forward" ou "reverse", binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      CUIDADO: Certifique-se de executar a função duas vezes com a fita definida para frente ou para trás para gerar files para leituras em ambas as direções.
      NOTA: Saída: Produz dois arquivos de gráfico de leito: um para leituras diretas (_fwd.bedgraph) e outro para leituras reversas (_rev.bedgraph). A saída é armazenada em /path/to/your/data/ bedgraphout (Figura 3).
      1. Execute a função BamCoverage na terceira célula usando Shift + Enter.

Figura 3: Organização de arquivos para WonderPeaks. Uma captura de tela da pasta de dados com os arquivos bedgraph no diretório bedgrapghout/normalizeUsingCPM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. WonderPeaks para ChIPseq

1. Pré-verificação
   1. Confirme se todos os arquivos bedgraph com filehandle .bedgraph estão em um subdiretório dentro do diretório de dados chamado bedgraphout (Figura 3).
   2. Confirme se os fatores de design no arquivo (NGS_user_inputs.csv) (Figura 2) correspondem user_inputs colunas no arquivo de metadados (NGS_user_metadata.csv) e se as linhas das colunas de fator de design não são exclusivas (consulte o cuidado na etapa 4.2.4).
2. Abra o Jupyter Notebook de pré-processamento de NGS (WP4ChIP.ipynb).
3. Ative o WonderPeaks (ambiente criado na etapa 1.3) no canto superior direito da interface do notebook.
4. Execute as células usando Shift+Enter até o ponto de interrupção para executar a chamada de pico. Uma vez terminado, um registro dos dados processados será salvo e armazenado em um subdiretório dentro do diretório de dados chamado WonderPeaks
   1. Procure WOnder_init.csv: uma concatenação de toda a cobertura bruta e os resultados do cálculo da primeira derivada.
   2. Nota WOnder_unfiltered_peaks.csv: uma concatenação de todos os picos não filtrados chamados com base na primeira derivada.
   3. Observe bedgraph_summary.csv: um resumo das estatísticas de pontuação após agrupar cada arquivo e cromossomo.
5. Defina os parâmetros de execução:
   1. Execute a^1ª célula abaixo do ponto de interrupção de remarcação.
      NOTA: Um gráfico exibindo os dados brutos segregados pelos fatores de projeto especificados e uma tabela mostrando os fatores de projeto serão exibidos; use a tabela e o gráfico para determinar os valores nas etapas subsequentes (Figura 4).
   2. Na próxima célula, especifique os valores para score_cut, fold_change e fator de design (Figura 4).
      1. score_cut é o valor limite usado para determinar se um pico deve ser considerado na saída. Para determinar o score_cut, observe o gráfico e escolha um valor próximo à mediana dos dados marcados (consulte a linha com hash, Figura 4). Insira esse valor da seguinte maneira: score_cut= valor.
      2. fold_change é o valor limite das pontuações de proporção de tagged:untagged usado para determinar se um pico é considerado real. Para determinar a fold_change, observe o gráfico e escolha um valor acima da proporção das medianas dos dados não marcados e marcados. Insira esse valor da seguinte maneira: fold_change= value.
      3. designfactor_value é especificado como parte do projeto experimental. Os possíveis fatores de design estão listados em vermelho na tabela impressa. Para determinar o fator de design, escolha um dos valores listados em vermelho. Insira esse valor entre aspas da seguinte maneira: designfactor_value ="{ value}".
6. Execute as próximas células usando Shift + Enter para executar a filtragem e o mapeamento de pico. Os gráficos de dados e resumo serão armazenados em um subdiretório dentro do diretório de dados chamado WonderPeaks.
   1. Observe {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv: uma tabela dinâmica de todos os picos sobrepostos com coluna para cada uma das amostras marcadas e não marcadas.
   2. Nota {designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv: Uma tabela de resumo de todos os picos reais, com base nos parâmetros do usuário (etapa 6.5).
   3. Observe {designfactor_value}_peaks2gtf.csv: Um mapeamento dos picos reais, com base nos parâmetros do usuário (etapa 6.5), para genes no arquivo de anotações especificado pelo usuário.
7. Opcional: alterne os parâmetros na etapa 6.5 executando novamente as etapas 6.5 a 6.6. Se estiver usando o mesmo designfactor_value, os arquivos gerados, conforme descrito na etapa 6.6, serão substituídos.

Figura 4: Captura de tela destacando os limites designfactor_value e especificados pelo usuário no WonderPeaks para ChIP-seq. Captura de tela do notebook jupyter do WonderPeaks, destacando as possíveis opções de designfactor_value da tabela exibida e como implementar o designfactor_value na próxima célula. A seta preta superior aponta para uma tabela que exibe possíveis entradas designfactor_value; o valor Op é circulado e mostrado como a entrada do usuário selecionada para designfactor_value na célula de opções (seta preta inferior). No gráfico, as linhas sólidas e tracejadas indicam as pontuações de pico medianas aproximadas para amostras marcadas e não marcadas, respectivamente, nos experimentos com células opacas. Essas medianas são usadas para definir os parâmetros score_cut (mediana marcada) e fold_change (a proporção de medianas marcadas e não marcadas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. PeakStream para 3'RNAseq

1. Pré-verificação:
   1. Confirme se todos os arquivos bedgraph estão em um subdiretório dentro do diretório de dados chamado bedgraphout (Figura 2).
   2. Abra o Jupyter Notebook de pré-processamento de NGS (PeakStream.ipynb)
   3. Ative o WonderPeaks (ambiente criado na etapa 1.3) no canto superior direito da interface do notebook.
2. Execute as células usando Shift+Enter até o ponto de interrupção para executar a chamada de pico e o mapeamento de pico. Uma vez concluído, um novo arquivo de anotação com UTRs de 3' previstos e arquivos de contagem de leitura FeatureCounts²⁴ será salvo e armazenado em um subdiretório dentro de seu diretório de dados chamado PeakStream (Figura 5).
   NOTA: Por padrão, o arquivo de saída incluirá apenas anotações para biótipos codificadores de proteínas, mas isso pode ser alternado usando a opção de biótipo.

Figura 5: Organização de arquivos para PeakStream. Uma captura de tela da pasta de dados com os arquivos bedgraph no diretório bedgrapghout. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Picos Maravilhosos
Depois de realizar um experimento ChIP-seq, os pesquisadores geralmente usam chamadores de pico, como MACS³, para identificar regiões genômicas enriquecidas por uma proteína de ligação ao DNA marcada com epítopo. Desenvolvemos o WonderPeaks como um chamador de pico fácil de usar, projetado para identificar picos usando o método descrito acima.

O WonderPeaks identifica os picos calculando primeiro a primeira derivada da cobertura e ...

Discussão

As técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) fornecem informações incomparáveis sobre a regulação e expressão gênica em patógenos fúngicos. Como tal, as ferramentas computacionais devem ser abrangentes - capturando todos os dados gerados em um experimento - e acessíveis aos usuários em geral, particularmente cientistas de bancada. Neste relatório, apresentamos duas ferramentas, WonderPeaks e PeakStream, que atendem a essas necessidades de pesquisadores de patógenos fúngicos em ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CORALL Total RNA-seq V1 kit	Lexogen	095	Material de laboratório úmido
Filamentous-Fungi riboPOOL	siTOOLs	dp-P096-6	Material de laboratório úmido
Fita de Tela de RNA de Alta Sensibilidade	Agilent	5067-5579	Material de laboratório úmido
Tela de RNA de Alta SensibilidadeEscada de Fita	Agilent	5067-5581	Material de laboratório úmido
Tampão de amostra de fita de tela de RNA de alta sensibilidade	Agilent	5067-5580	Material de laboratório úmido
			lista de dependências para WonderPeaks
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml			lista de dependências para WonderPeaks_preprocessing
Monarch Spin RNA Cleanup Ki	NEB	T2040L	Material de laboratório úmido
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Library Prep Kit V1	Lexogen	015	Material de laboratório úmido
Kit de Ensaio de Alta Sensibilidade (HS) de RNA Qubit	Invitrogen	Q32852	Material de laboratório úmido
RNA Limpo & Concentrador-5	Zymo Research	R1016	Material de laboratório úmido
Kit TURBO DNA-free	ThermoFisher	AM1907	Material de laboratório úmido
WonderPeaks(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)